本方案介绍了一种经过验证的液相色谱-离子淌度-高分辨质谱法，用于检测食品中麦角生物碱的存在，符合最新发布的欧盟委员会法规（EU）2023/915的要求。
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摘要
摘要
离子淌度质谱法（IMS）在整合到液相色谱-质谱法（LC-MS）工作流程中时，可作为额外的分离维度。与传统的LC-MS方法相比，LC-IMS-MS方法具有更高的峰分辨率，能够更好地分离同量异位化合物和异构体化合物，并提高信噪比（S/N）。IMS提供了用于分析物鉴定的另一项分子特征，即碰撞截面（CCS）参数，有助于减少假阳性结果。因此，LC-IMS-MS方法解决了食品安全领域中若干重要的分析难题（例如，在复杂的食品基质中痕量水平化合物的检测，以及对同量异位和异构分子的明确鉴定）。
麦角生物碱（EAs）是一类由真菌产生的霉菌毒素，可侵染多种禾本科植物，包括黑麦、小黑麦、小麦、大麦、小米和燕麦等小粒谷物。针对这些霉菌毒素，已在若干食品中设定了最高限量（MLs），具体规定详见欧盟委员会法规EC/2023/915。该新法规涵盖了六种主要的麦角生物碱及其相应的表异构体，因此需要一种高效的分析方法，以准确区分这些在自然界中常共存的异构分子。
因此，本方案旨在展示离子淌度质谱（IMS）与液相色谱-质谱（LC-MS）流程联用如何实现异构体麦角生物碱（EAs）的有效分离，从而提高分析方法的选择性。此外，本方案还说明了通过分析标准品构建碰撞截面（CCS）数据库，可显著提升对真菌毒素鉴定的置信度。本方案以谷物中EAs的测定为例，系统阐述了在食品安全领域引入IMS技术的优势。采用基于QuEChERS方法的提取，结合液相色谱-捕集离子淌度质谱（LC-trapped ion mobility spectrometry, TIMS-MS）分析，定量限范围为0.65至2.6 ng/g，在1.5倍、1倍和0.5倍最大限量（ML）水平下具有可接受的准确度（尽管麦角胺醇的回收率较低），且基质效应可忽略不计。
引言
离子淌度质谱法（IMS）正成为一种日益广泛应用的分析技术，通常作为额外的分离维度整合到传统的液相/气相色谱（LC/GC）与质谱联用的工作流程中。IMS 技术通过在充满缓冲气体的淌度分离池中施加电场并在常压下实现分子的分离1。根据离子化分子的质荷比（m/z）及其几何构象，该分子在穿过淌度分离池时会与缓冲气体发生相互作用，这一过程反映在离子淌度参数（K）上2，并可通过以下公式计算：
其中 D 表示总漂移长度， td 是 总漂移时间，以及 E 是 电场。因此，K 的单位为 m2 V−1 s−1，尽管由于实际原因通常以 cm 表示2 V−1 s−1在迁移池中固有的移动能力可通过漂移时间进行测量，随后可转换为所谓的碰撞截面（CCS）值，该值对于每种分子而言均为一个高度可重复的参数，且与离子迁移谱（IMS）仪器无关3. CCS 可通过以下公式从迁移率推导得出：
q 为离子的电荷；N 为缓冲气体的数密度；µ 为缓冲气体-离子碰撞对的约化质量；kB 为玻尔兹曼常数；T 为缓冲气体的温度。因此，离子迁移谱（IMS）可提供色谱与质谱分析所得分析数据之外的补充信息。
在液相色谱-质谱（LC-MS）平台中引入离子淌度谱（IMS）已被证明可提高分析测定的可靠性，尤其是在处理痕量浓度化合物时。多项研究报道，液相色谱-离子淌度-质谱（LC-IMS-MS）方法可通过降低背景噪声来改善质谱图质量，从而提升方法的灵敏度，并减少多残留LC-MS方法所产生的假阳性与假阴性结果4,5,6。此外，碰撞截面（CCS）值具有良好的重现性，使得不仅可在使用相同技术的不同仪器之间进行比较，也可在不同类型的离子淌度技术之间进行比较，主要包括行波离子淌度谱（TWIMS）、捕获离子淌度谱（TIMS）和漂移管离子淌度谱（DTIMS）2,7，这些是目前应用最为广泛的系统1。因此，CCS作为鉴定参数的潜力带来了一个显著成果，即构建CCS数据库的可能性，这一点已在代谢组学研究中的应用中得到体现8。然而，IMS最强大的功能之一在于其能够分离那些仅靠LC-MS方法难以充分分辨的异构体和同量异位化合物。这种情况在复杂基质中分析大量目标分析物时尤为常见，而这正是环境与食品分析中的典型场景。在此背景下，已有研究提出采用LC-IMS-MS方法用于食品中农药的监测，以及在较小程度上用于兽药和真菌毒素的检测9。
由于具有高分辨能力和选择性，液相色谱/气相色谱-离子迁移谱-质谱（LC/GC-IMS-MS）平台已成为应对当前食品安全领域某些挑战的最有效工具，尤其是针对异构体混合物的分析。异构体混合物作为食品污染物对健康可能带来的风险，已在现行的欧洲法规中有所体现，例如，该法规限制了多种食品中六种主要麦角生物碱（EAs）及其相应六种差向异构体的最高浓度10。
EAs 构成一类由多种真菌产生的有毒次级代谢产物，主要来源于 麦角菌科 例如， 麦角菌（Claviceps purpurea）， 最重要的EA生产者（因其宿主范围广泛），但也 曲霉科，可在开花期寄生在活体植物（如黑麦、大麦、小麦和燕麦）的穗部11,12在特定条件下，尤其是温度和水分活度下 麦角菌属 真菌可产生在子实体中积累的EAs，称为 菌核 或麦角，存在于寄主作物中。在一定程度上，麦角生物碱（EAs）能够耐受原材料加工过程并最终进入食品链。摄入受污染的食物可导致麦角生物碱中毒，即麦角中毒症，其急性症状包括腹痛、呕吐、皮肤灼烧感、失眠和幻觉。13为减少乙基氨基甲酸乙酯（EAs）对人类健康的影响，欧盟委员会针对多种食品中主要EAs的总量设定了最大限量（MLs）： R-差向异构体麦角新碱（Em）、麦角胺（Et）、麦角松碱（Es）、麦角克林（Ecr）、麦角隐亭（Ekr）和麦角柯宁（Eco）及其相应的 S-差向异构体：麦角酸甲酯（Emn）、麦角辛宁（Esn）、麦角胺宁（Etn）、麦角柯宁碱（Econ）、麦角克林宁（Ekrn）和麦角新克林宁（Ecrn）。这些化合物可发生差向异构化反应，从 R 至 S 形成和 反之亦然，尤其是在强光照射、长期储存或在高或低pH条件下接触某些溶剂时 12. 尽管比例 R 和 S 在不同条件下形态可能有所差异，欧洲食品安全局（EFSA）污染物专家组报告称，某种形态的检出率更高 R 比...的形态 S 在查阅了有关食品中环境雌激素（EAs）的现有文献后形成14因此，最大残留限量（MLs）因多种因素而异，例如作物的敏感性、加工程度或消费频率。在欧盟框架内，大麦、小麦、斯佩耳特小麦和燕麦的碾磨制品的MLs已被设定为50或 150 µg/kg （根据灰分含量分别低于或高于900 mg/100 g），而直接供人类食用的谷物则受限量标准 150 µg/kg，但以谷物为基础的婴儿食品除外，其最大限量降低至 20 µg/kg10.
这项严格的法规要求采用足够灵敏的分析方法，以检测痕量浓度（µg/kg）水平的物质，同时准确鉴定受监管的麦角生物碱（EAs）及其相应的差向异构体，因为在受污染样品中通常会同时存在 R- 和 S- 异构体两种形式。这一任务极具挑战性，因为每一对毒素-差向异构体具有完全相同的质荷比和碎片化模式。此外，两种化合物之间的色谱分离也可能十分复杂。因此，必须优化液相色谱梯度条件，以避免在食品样品中麦角生物碱差向异构体共存时导致定量错误。尽管已有若干研究报道了用于明确测定EAs的LC-MS方法15,16,17,18，但仍需对色谱方法进行深入研究，以实现色谱峰的良好分离，从而对EAs进行确凿鉴定。然而，在多类别方法中，由于需同时检测属于不同化学类别的污染物，通常难以实现上述分离要求。在此背景下，Carbonell-Rozas、Hernández-Mesa 等人最近的一项研究19报道了一种用于小麦和大麦样品中EAs定量的LC-IMS-MS方法，该方法使用了两种不同的迁移离子淌度质谱（TWIMS）仪器，提供了可重复的碰撞截面（CCS）值和较低的定量限（LOQs），可依据现行法规检测任何不符合规定的情况。因此，本实验方案的目标是展示在LC-MS工作流程中整合离子淌度谱（IMS）如何有助于分离异构体形式的EAs，从而提高分析方法的选择性。此外，本方案还说明了通过表征标准品建立CCS数据库，如何为真菌毒素的鉴定提供更高置信度。本方案旨在以谷物中EAs的测定为例，清晰阐述将IMS技术应用于食品安全分析所带来的优势。本方案涵盖基于QuEChERS方法的样品前处理、LC-TIMS-MS分析以及IMS数据的提取与解析。
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方案
1. 储备液、中间液和工作标准溶液的配制
注意：使用腈类手套、实验服和安全眼镜。
- 使用乙腈在4 mL棕色玻璃小瓶中分别配制12种EAs（见材料表）的储备液，浓度为10,000 ng/mL。R-型（-ine）先前已被分装为每份25,000 ng，而S-型（-inine）则被分装为每份10,000 ng。本研究从这些分装样品开始，分别用2.5 mL和1 mL乙腈溶解R-型和S-型，稀释至浓度为10,000 ng/mL，随后涡旋混匀2分钟。
- 在12 mL棕色玻璃小瓶中，通过加入每种生物碱溶液各65 µL以及7.02 mL乙腈，配制总EAs浓度为1,000 ng/mL（每种生物碱83.33 ng/mL）的中间储备液。
注意：中间储备液配制完成后，必须将各单个储备液干燥，并用铝箔包裹后于-20 °C保存，以避免差向异构化。 - 从中间储备液中移取2.7 mL、1.8 mL和0.9 mL至4 mL棕色玻璃管中，制备工作标准溶液。在温和氮气流下吹干后，用600 µL乙腈重新溶解。
注意：最终所得浓度设定为当向1 g样品中加入50 µL时，分别达到1.5、1和0.5倍的 mL（即150 ng/g）。这些浓度水平用于验证研究（如回收率、重复性等）。 - 将每种工作标准溶液的600 µL用移液器分装为每份200 µL，分别加入三个2 mL棕色玻璃小瓶中，并在氮气下吹干。
注意：步骤1.2至1.4在图1中以示意图形式说明。通过将工作标准溶液分装并干燥，可在三个不同日期进行三重复加标，满足验证实验要求，同时保持EAs的化学完整性。 - 在每次验证实验当天，将每个加标水平的一个2 mL棕色玻璃小瓶用200 µL乙腈重新溶解。
注意：每个加标水平将使用每份样品50 µL进行三重复测定，因此每种溶液共消耗150 µL。
2. 试剂与溶液的配制
注意：使用腈类手套、实验服和安全眼镜。
- 称取24.02 mg碳酸铵，溶于50 mL水中，配制5 mM碳酸铵溶液。将24.02 mg碳酸铵加入烧杯中，加入约5 mL水，轻轻手动振荡使碳酸铵溶解，然后转移至50 mL容量瓶中。用少量水冲洗烧杯，并将洗涤液转移至容量瓶中，定容至50 mL。
- 取步骤2.1中配制的碳酸铵溶液37.5 mL与乙腈212.5 mL混合，配制250 mL提取液[乙腈:5 mM碳酸铵溶液(85:15, v/v)]。
- 配制100 mL甲醇:水混合液(1:1, v/v)，用于重悬样品提取物（步骤8.8）。
- 对于每个样品，在15 mL离心管中称取150 mg反相C18:锆基吸附剂混合材料(1:1, w/w)，用于分散净化步骤（步骤8.5）。
- 分别在两个试剂瓶中配制色谱分离用流动相溶剂：1 L超纯水（流动相A）和甲醇（流动相B），均含0.3% (v/v) 甲酸。为达到该浓度，向各瓶中加入3.03 mL甲酸（99%纯度）。
注意：液相色谱-离子迁移谱-质谱（LC-IMS-MS）分析前应现配流动相溶剂。
3. 设置仪器参数
注意：本LC-IMS-MS研究所用仪器为超高压液相色谱仪（UHPLC）与离子淌度-高分辨质谱仪（IM-HRMS）联用系统，配备真空隔热探针加热电喷雾离子源（VIP-HESI）。仪器在正离子模式下运行。
- 使用采集软件建立色谱方法，通过设置以下洗脱梯度实现分析物的分离：0 min，10% B；2 min，10% B；4.5 min，40% B；9 min，45% B；11 min，95% B；12 min，95% B；13 min，10% B；16 min，10% B。
- 将流动相流速设定为 0.4 mL/min，柱温保持在35 °C，进样体积为5 µL。若条件允许，自动进样器内部温度应保持恒定在10 °C。
- 设定 IMS 参数如下：迁移率值 (1/K00.1 到 1.5 V·s/cm2；斜坡时间，100 ms；精度时间，10 ms；占空比，10%；斜坡速率，9.05 Hz。
- 设定离子源参数 质谱检测 如下所示： 毛细管电压，2,500 V; 雾化器压力，2.5 bar; 干燥气体流速, 8 L/min; 干燥气体温度，200 °C; 鞘气温度，450 °C; 鞘气流速，4 L/min。对于 质谱采集，选择以下参数，需考虑两次扫描事件：对整个质谱范围进行全扫描，分辨率设为 m/z 从 20 到 1,300 随后进行宽带碰撞诱导解离（bbCID），可在三个固定条件下从任意前体离子生成产物离子 碰撞能量 的 24, 36，以及 50 eV 进行电离和数据采集 正离子模式.
- 保存此采集方法文件以供后续使用。
4. 来自EAs分析标准品的数据采集
注意：仅在步骤 4.1 中使用丁腈手套、实验服和安全眼镜。
- 准备两个1.5 mL棕色小瓶，每瓶加入500 µL浓度为1,000 ng/mL的中间溶液，另准备一个含有溶剂A和B（1:1，v/v）混合液的小瓶作为清洗溶液。
- 按照制造商说明校准timsTOF仪器，并选择正离子模式进行离子迁移谱（IMS）和质谱（MS）的数据采集。
- 将C18色谱柱（见材料表）放入液相色谱柱温箱中，温度设置为35 °C，具体参数参见步骤3.5中保存的采集方法文件。
注意：确保色谱柱两端连接紧密；否则会出现流动相泄漏现象。 - 对液相色谱柱进行平衡，使流动相流速为0.1 mL/min，并设置溶剂A与B的混合比例为90:10（%），作为初始流动相组成。
- 等待色谱柱压力稳定（约130 bar）。
- 将流动相流速提高至0.2 mL/min，待压力稳定后，再进一步提高至0.3 mL/min。
- 当压力再次稳定后，将流速设定为0.4 mL，此即为步骤3.5中保存的采集方法文件所规定的操作流速，并等待压力稳定在约350 bar。
注意：切勿直接将流速从0.2 mL/min升至0.4 mL/min。流速的剧烈变化会导致高压峰，可能损坏色谱柱。 - 在色谱柱平衡过程中，编写样品列表，包括步骤4.1所述的两个含1,000 ng/mL EAs中间溶液的小瓶对应的样品，以及清洗小瓶。在样品批次开始和结束时各分析一次清洗小瓶。
- 在样品列表的方法文件 列中，加载步骤3.5中已保存的采集方法文件。
- 创建一个文件夹用于保存所有采集到的数据文件，并在样品路径列中选择该文件夹以指定所有样品的存储路径。
注意：请务必使用同一文件夹保存验证研究期间生成的所有文件，以便后续处理。在色谱柱平衡过程中，压力稳定值可能会略有波动。尽管如此，在再次提高流速前必须确保压力稳定，以保护色谱柱完整性。此外，当达到工作流速时，压力也必须保持稳定，以实现可重复的色谱分离。 - 进入软件上方的工具栏，运行样品列表。
5. 定量方法建立的数据处理
- 工作列表执行完毕后，打开定性分析软件。
- 通过点击 文件 | 打开工作列表 来加载所有已分析的样品。
- 右键单击对应于浓度为 1,000 ng/mL 的 EAs 中间溶液的样品，选择编辑色谱图，然后选择 类型 | 提取离子色谱图，输入与每种 EA 相关的质子化离子的理论分子质量。接着点击 添加，最后点击 确定。由于分析物组包含六种 EAs 及其具有相同精确质量的相应差向异构体，因此将出现六个提取离子色谱图。
注意：宽度 参数用于调整 m/z 窗口的宽窄。若难以找到目标分析物的色谱峰，建议选择较宽的 m/z 窗口。然而，为避免可能的干扰，建议设置较窄的 m/z 窗口（小于 0.05 单位）。 - 在每个提取离子色谱图中，会出现两个与主要 EA 及其差向异构体相关的色谱峰。右键单击并选中其中一个峰的整个区域，其下方将弹出离子淌度谱图。
- 转至离子淌度谱图的 x 轴，右键单击，然后点击 碰撞截面。记录下 CCS 值。
注意：如果 CCS 值未自动显示，请前往上方工具栏中的 校准，然后选择 淌度计算器，手动输入淌度值以获得对应的 CCS 值。 - 在同一条离子色谱图中，选择另一个色谱峰对应的区域，并重复步骤 5.4 和 5.5。
- 类似地，在执行步骤 5.4 后，裂解图谱也会出现。根据文献和数据库中报道的裂解模式，比较并选择强度最高的产物离子作为补充鉴定依据。
- 记录每种 EA 的主离子加合物（通常为质子化离子）的保留时间、CCS 值和精确质量，以建立定量分析方法。
- 对剩余的分析物重复执行步骤 5.4 至 5.8。
- 按住 Ctrl 键并单击选中步骤 5.3 中生成的所有分子质量，然后右键单击并选择 复制。切换到另一个对应于 EAs 中间溶液的样品，右键单击该样品并选择 粘贴。系统将自动提取相应的离子色谱图和淌度谱图。
- 仔细核对此第二个样品中所有分析物的鉴定参数。
6. 麦角生物碱常规检测的数据处理方法的建立
- 打开软件，点击 方法管理 选项卡。
- 点击 分析物设置，输入每个EA的名称及其保留时间、CCS值，以及在步骤5.4至5.9中采集的质子化加合物的质量。根据需要调整每个鉴定点的容差，但建议采用默认设置以适用于本方案。
注意：容差值设置得越高，出现假阳性结果的可能性越大，因为系统允许与理论值存在更大的偏差。同样，容差值设置过严可能导致假阴性结果，这通常是由仪器性能引起的与理论值之间的偏差所致。 - 保存定量方法以供后续使用。
7. 取样
- 根据欧洲委员会制定的采样指南20，在超市中购买小麦和燕麦样品，最好选择1 kg包装的样品。如果无法获得1 kg包装的样品，也应确保至少有50 g样品以完成全部分析。
- 使用研磨机对样品进行研磨。本研究中采用刀片式研磨机对包装内的全部样品进行研磨，研磨后将样品重新放回原包装中以实现均质化。
注意：每次处理不同样品之间必须彻底清洁研磨机，以避免交叉污染。实验时应穿戴实验服。 - 将均质后的样品分装至50 mL离心管中，并在阴凉干燥条件下保存。
8. 样品制备
- 制定一个在三个非连续日进行验证研究的时间表（以评估实验室内的重复性）。每天通过在225 ng/g（1.5 mL）、150 ng/g（ML）和75 ng/g（0.5 mL）三个浓度水平加标样品来进行检测。每个浓度水平设三个重复，每天共9个加标样品和3个空白样品。
注意：考虑到3天的验证实验，总共需要36个样品，另加8个空白样品用于制备基质匹配校准曲线。本实验步骤全程需佩戴腈类手套、实验服和护目镜。 - 称取1 g样品至50 mL离心管中。
注意：进行验证实验时，在称量后立即加入50 µL步骤1.3和1.5中所述的相应工作标准溶液进行加标。 - 加入4 mL提取液[乙腈:5 mM碳酸铵水溶液（85:15, v/v）]，涡旋混合1分钟。
- 在9,750 × g、4 °C条件下离心5分钟。
注意：离心机容量可能成为本步骤的限制因素，因此建议仅同时提取离心机容量所能容纳的确切样品数量。 - 将全部上清液转移至含有150 mg净化吸附剂（1:1, w/w）混合物的15 mL离心 管中，涡旋混合1分钟。
- 在9,750 × g、4 °C条件下离心5分钟。
- 收集上清液并转移至4 mL棕色玻璃小瓶中，在氮气流下温和吹干提取物。
注意：若样品不在当天分析，必须在-20 °C条件下干燥保存。 - 用750 µL甲醇:水（1:1, v/v）混合液重新溶解样品。
- 将提取液转移至2 mL注射器中，通过0.22 µm尼龙滤膜过滤至1.5 mL棕色色谱小瓶中。
- 将用于制备基质匹配校准曲线的8个空白样品的提取液收集至一个12 mL棕色玻璃小瓶中（每个样品重悬于750 µL中，总体积为6 mL）。
- 用移液器将1 mL中间溶液（1,000 ng/mL，每种麦角生物碱为83.33 ng/mL）（步骤1.2）加入2 mL棕色玻璃小瓶中，在氮气流下吹干溶剂，然后用1 mL先前收集的空白样品提取液重悬。
注意：该混合液浓度为1,000 ng/mL（每种EA为83.33 ng/mL），将用于制备基质匹配校准曲线。 - 准备十个2 mL棕色玻璃小瓶，每瓶加入450 µL空白样品提取液（步骤8.10），并编号1至10。每个小瓶将作为校准曲线的一个点。
注意：本方案中使用450 µL，是因为这是液相色谱仪进样针在不使用插件的情况下可触及小瓶底部的最小体积。若进样针无法达到该深度，应增加体积，并相应计算所需额外提取的空白样品数量（每个样品重悬于750 µL甲醇:水（1:1, v:v）混合液中）。 - 通过逐级稀释建立校准曲线。将步骤8.11制备的混合液450 µL转移至已含450 µL空白样品提取液的1号小瓶中，使浓度达到41.67 ng/mL（最高校准点）。涡旋混合2分钟。
注意：混合液体积必须与空白样品提取液体积相等，以确保每一步稀释两倍。 - 将450 µL溶液从1号小瓶转移至已含450 µL空白样品提取液的2号小瓶中，使浓度达到20.83 ng/mL（第二高浓度校准点）。
- 重复步骤8.14（即从2号小瓶至3号小瓶，依此类推），依次进行直至获得十个校准点。每种EA的浓度范围将为：41.67、20.83、10.42、5.21、2.60、1.30、0.65、0.33、0.16和0.08 ng/mL。
- 按照步骤 8.11 所述方法制备1,000 ng/mL的标准混合液（每种EA为83.33 ng/mL），但使用1 mL甲醇:水（1:1, v/v）混合液。
- 按照步骤 8.13至8.15所述方法制备标准校准曲线，但在逐级稀释时使用450 µL甲醇:水（1:1, v/v）混合液。该校准曲线将用于通过与基质匹配校准曲线比较来评估基质效应。
9. 定量数据处理
- 按照步骤 4.1 至 4.11 中所述的说明启动并运行仪器。本方案所用工作列表见图 2。
注意：编写校准曲线工作列表时，应在加标样品之前进样，先按浓度从低到高依次进样标准校准曲线，接着进样含有甲醇:水（1:1，v/v）的清洗瓶，最后按浓度从低到高进样基质匹配校准曲线。 - 打开定量分析软件，导航至左下角的 TASQ Quick 选项卡 | 导入批处理。
- 选择步骤 4.10 中创建的文件夹，其中包含所有原始数据（与工作列表中所有样品经 LC-IMS-MS 分析后获得的信息相关的文件）。
- 数据导入软件后，转至 处理批处理，该选项位于 导入批处理 正下方。
- 选择需要处理的样品（即 27 个加标样品、9 个空白样品以及两条校准曲线）和此前在步骤 6.1 至 6.3 中创建的数据处理方法。此时将弹出一个窗口，显示多个可设置参数（例如用于评估色谱峰的积分器类型或需考虑的分析信号类型等）。可根据需要更改这些参数，但默认值已适用于本方案的执行。
- 数据处理完成后，进入 审查筛查 界面，检查是否存在自动积分相关的问题，例如因色谱峰过于接近而被错误选择的峰。若存在此类问题，可缩小定量方法文件中最初设定的保留时间容差、CCS 值容差和/或质量误差值，并重新处理数据。若自动峰积分仍选择错误的峰，则需在 审查筛查 窗口中手动积分：在色谱图中选择正确的峰区域（操作时应参考第 5 节中获得的 EA 标准品的分析参数）。
注意：审查每个样品至关重要，因为某些主要的 EA 差向异构体对保留时间非常接近，软件可能将其误判。 - 当所有样品的色谱峰均成功积分后，点击屏幕左上角的 批处理管理 选项卡，并标明每个分析所对应的样品类型：溶剂、空白、质控、样品或校准点。对于校准点，需为每个浓度水平分配一个编号。
- 在同一个 批处理管理 选项卡中，下拉至名为 批处理浓度 的底部窗口，为上一步设定的每个浓度水平指定相应的浓度值。完成后，点击 保存浓度。
- 点击 定量批处理，并根据需要调整参数（例如拟合校准数据的模型、权重、是否强制模型过原点等）。除校准曲线的权重需设为 1/x 外，其余默认值均适用于本方案的执行。
注意：由于软件一次只能使用一条校准曲线，因此需重复步骤 9.9 两次，以分别获取标准校准曲线和基质匹配校准曲线的信息。在本方案中，采用基质匹配校准曲线进行待测物定量，因此首先评估溶剂校准曲线，按步骤 9.13 后续说明提取校准数据，最后选择基质匹配校准曲线进行样品定量。 - 根据定量方法文件完成麦角生物碱的定量后，点击屏幕上方的 定量 选项卡。
- 若步骤 9.9 中设定的默认参数未能获得良好的线性和精密度，可通过右键点击图表并调整拟合方式和权重，优化校准曲线，以获得良好的线性模型（R2 > 0.99），并在每个校准点上达到足够的精密度（偏差低于 20%）。
注意：软件会以红色标记未能达到适当精密度的校准点数据单元。 - 完成后，右键点击屏幕最左侧的批处理文件夹，选择 生成报告，然后选择 待测物定量，将报告导出为所需格式。
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结果
首先，将工作标准溶液注入 LC-IMS-MS 仪器，以获得本研究中分析的每种环氧花生酸（EA）的全部鉴定特征（即保留时间、碰撞截面（CCS）和质谱图）。由于除精确质量外的鉴定参数最初未知，采集方法基于双扫描事件，首先对整个质谱进行全扫描，随后进行宽带碰撞诱导解离（bbCID）。该研究采用回溯性分析策略，得益于 Q-TOF 高分辨质谱仪，该仪器可在无需待测物任何先验信息的情况下采集并生成数据。在所获得的数据中检索每对主要 EA 及其差向异构体的精确质量，以同时获取它们的其他鉴定特征（即保留时间和 CCS 值），用于建立定量方法以处理样品数据。分析后获得的实验参数详见表 1。
色谱分离为每一对主要的EA差向异构体均提供了清晰且分离良好的峰，但Et和Etn除外（图3）。由于Et（6.85 min）和Etn（6.98 min）的色谱峰保留时间相近，导致二者之间分离不充分，出现轻微重叠，因此在考虑到运行过程中保留时间可能发生漂移的情况下，可能导致定量不准确。然而，在离子淌度谱中，这对分子实现了基线分...
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讨论
本方案的成功应用基于对提取步骤的优化，此前由 Carbonell-Rozas 等人17完成，他们采用了一种高效的提取溶剂，能够从大麦和小麦等复杂食品基质中有效提取麦角生物碱（EAs），并结合净化步骤，获得了相对较低的基质效应（SSE）值。提取溶剂的选择是一个关键步骤，需综合考虑分析物的化学特性、EAs 对分解和差向异构化的不稳定性，以及待分析基质的组成。在此情况下，当乙腈（一种可防止差向异构化的非质子性溶剂）作为提取溶剂时，EAs（以及总体上的真菌毒素）表现出良好的提取效率21,22,23,24。此外，对于 EAs 而言，添加碳酸铵可通过提供碱性 pH 环境提高提取效率25。同时，溶剂与样品的比例也需加以考虑，使用过低体积的溶剂可能导致饱和26
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由安达卢西亚大学、研究与创新委员会（Consejería de Universidad, Investigación e Innovación - Junta de Andalucía，项目编号：PROYEXCEL_00195）以及巴伦西亚自治区政府与欧洲社会基金+（Generalitat Valenciana 和 European Social Fund+，项目编号：CIAPOS/2022/049）提供的博士后资助支持。 作者感谢格拉纳达大学"科学仪器中心（Centro de Instrumentación Científica, CIC）"为本实验方案所使用的分析仪器提供的使用权限。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | VWR | 83640.32 | |
| 4 mL 棕色玻璃管 | VWR | 548-0052 | |
| 12 mL 棕色玻璃管 | VWR | 548-0903 | |
| 1.5 mL 棕色小瓶 | Agilent | 5190-9063 | |
| 碳酸铵 | Fluka | 9716 | |
| 分析天平 BAS 31 | Boeco | 4400519 | |
| 天平 CP 323 S | Sartorius | 23-84182 | |
| C18 | Supelco | 52604-U | |
| 离心管，15 mL | VWR | 525-1082 | |
| 离心管，50 mL | VWR | 525-0155 | |
| Universal 320 R 离心机 | Hettich | 1406 | |
| Compass HyStar | Bruker | 采集软件 | |
| DataAnalysis | Bruker | 定性分析软件 | |
| Elute PLUS UHPLC | Bruker | ||
| EVA EC-S 蒸发仪 | VLM | V830.012.12 | |
| 甲酸 GR 分析纯 ACS，Reag. Ph Eur | Merck | 100264 | |
| 研磨仪 TitanMill300 | Cecotec | 1559 | |
| 甲醇 | VWR | 83638.32 | |
| Milli-Q 超纯水系统（18.2 MΩ cm） | Millipore | ZD5211584 | |
| 移液器吸头 1–5 mL | Labortecnic | 162005 | |
| 移液器吸头 100–1000 µL | Labortecnic | 1622222 | |
| 移液器吸头 5–200 µL | Labortecnic | 162001 | |
| 可调式移液器 Transferpette S，DE-M 10–100 µL | BRAND | 704774 | |
| 可调式移液器 Transferpette S，DE-M 100–1000 µL | BRAND | 704780 | |
| 可调式移液器 Transferpette S，DE-M 500–5000 µL | BRAND | 704782 | |
| 2 mL 注射器 | VWR | 613-2003 | |
| 13 mm，0.22 µm 滤膜注射器 | Phenomenex | AF-8-7707-12 | |
| TASQ | Bruker | 定量分析软件 | |
| timsTOFPro2 IM-HRMS | Bruker | ||
| Vortex Genie 2 涡旋振荡器 | Scientific Industries | 15547335 | |
| Zorbax Eclipse Plus RRHD C18 色谱柱（50 x 2.1 mm，1.8 µm 粒径） | Agilent | 959757-902 | |
| Z-Sep+ | Supelco | 55299-U | 基于氧化锆的吸附剂 |
| 麦角生物碱 | CAS 登记号吸附剂 | ||
| 麦角柯宁碱（Eco） | Techno Spec | E178 | 564-36-3 |
| 麦角柯宁宁碱（Econ） | Techno Spec | E130 | 564-37-4 |
| 麦角克里斯亭碱（Ecr） | Techno Spec | E180 | 511-08-0 |
| 麦角克里斯亭宁碱（Ecrn） | Techno Spec | E188 | 511-07-9 |
| 麦角克瑞普亭碱（Ekr） | Techno Spec | E198 | 511-09-1 |
| 麦角克瑞普亭宁碱（Ekrn） | Techno Spec | E190 | 511-10-4 |
| 麦角新碱（Em） | Romer Labs | "002067" | 60-79-7 |
| 麦角新碱宁（Emn） | Romer Labs | LMY-090-5ML | 479-00-5 |
| 麦角辛碱（Es） | Techno Spec | E184 | 561-94-4 |
| 麦角辛宁碱（Esn） | Techno Spec | E194 | 596-88-3 |
| 麦角胺（Et） | Romer Labs | "002069" | 113-15-5 |
| 麦角胺宁（Etn） | Romer Labs | "002075" | 639-81-6 |
参考文献
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