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方法文章

使用双瓶选择家庭笼饮酒法与微观结构分析对啮齿类动物饮酒行为建模

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DOI：

10.3791/67486

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2024年11月8日

 ,  , 
1Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

本文内容

摘要

本方案描述了一种标准的间歇性接触双瓶选择家庭笼具饮酒范式，用于模拟大鼠的酒精摄入行为。此外，本方案还提供了逐步指导，通过添加自制的舔舐检测系统来增强标准方案，从而实现对饮酒行为的微结构分析。

摘要

双瓶选择法在动物家庭笼具中的饮酒行为研究是目前研究啮齿类动物乙醇摄入最广泛使用的方法之一。在最简单的形式中，动物可自由接触两个饮水瓶，其中一个装有普通自来水，另一个装有乙醇，每日摄入量通过测量24小时内饮水瓶重量的变化来确定。因此，该方法无需使用特殊实验设备。尽管这种易于实施的特性可能是其被临床前酒精研究领域广泛采用的主要原因，但该方法所获取的饮酒数据分辨率受限于研究人员测量饮水瓶重量的频率（例如每天一次）。然而，为了在总体摄入量、药理学干预和神经调控的背景下进一步分析饮酒模式，研究人员已开发出可在单次舔舐水平上采集数据的家庭笼具舔舐检测系统。尽管近年来已出现多种此类系统，但开源系统LIQ HD（Lick Instance Quantifier Home cage Device，家庭笼具舔舐实例量化装置）因其成本低廉且操作友好而在该领域受到广泛关注。尽管该系统令人期待，但其最初设计仅适用于小鼠。本文综述了标准双瓶选择法及配备舔舐计数器的双瓶选择法在家庭笼具中的适当操作流程，并介绍了将LIQ HD系统适配于大鼠的方法，包括对硬件进行改造以适应更大的笼具尺寸，以及重新设计一款可与市售标准饮水瓶兼容的3D打印饮水瓶支架。通过该方法，研究人员可同时并行分析多只大鼠的每日饮酒模式和摄入水平，从而在几乎不增加资源投入的情况下显著提高数据分辨率。这些方法为研究人员提供了灵活性，可根据具体实验需求选择使用标准饮水瓶或配备舔舐计数器的装置，以探究酒精饮用行为背后的神经生物学机制。

引言

尽管历史上适度饮酒曾被认为对健康有一定益处，但近期大规模综合性研究显示，任何程度的酒精摄入均不安全。1,2事实上，酒精使用是第七大th 全球死亡和残疾的主要风险因素1 饮酒量即使很少的个体，其患癌症、传染病和受伤的风险也会增加1,3在美国，2016年至2021年间因饮酒导致的死亡人数增加了近30%4重要的是，死亡和残疾的风险随着消费量的增加而单调上升1.

尽管人类研究为了解酒精使用和滥用的神经生物学机制提供了宝贵的见解，但动物模型所提供的实验控制对于深入理解饮酒行为的机制以及重度饮酒风险至关重要。这些模型也是开发旨在减少失控性饮酒的治疗方法的重要工具。双瓶选择法在啮齿类动物的家笼环境中进行饮酒实验，是研究酒精摄入最广泛使用的临床前范式之一。这主要归因于其易于实施的特点，该方法无需特殊的研究设备或复杂的分析，即可测量动物的总自愿饮酒量及对酒精的偏好。使用这种方法，研究人员可通过计算每次饮酒时段开始和结束时瓶子重量的变化，在其期望的时间间隔（例如小时、天、周）内收集数据。该基本方法的多种变体已被领域内众多研究者采用，以实现短至长期范围内从低到中等乃至暴饮水平的酒精摄入。例如，连续性和间歇性双瓶选择程序已被用于分别促进小鼠5和大鼠6,7,8的低水平和中等水平酒精摄入。相同的范式在偏好酒精的品系动物中可促进高水平的酒精摄入7,9。此外，另一种对该方法的改进是将每日酒精接触时间限制在黑暗周期开始约3小时后，持续2至4小时，该方法已被证明可在小鼠中诱导暴饮行为（即“暗期饮酒”）10,11。这些方法的其他变体还曾与促进酒精依赖的方法（如慢性间歇性乙醇蒸气暴露）结合使用，以研究戒断期间自愿饮酒行为的加剧情况12,13,14,15,16,17,18,19。

尽管该领域广泛采用通过测量瓶子重量变化来评估酒精摄入量的标准方法，但其分辨率仅限于每次饮酒时段的总消耗量。因此，该方法无法捕捉饮酒模式，而饮酒模式已被证实会影响酒精使用障碍（AUD）的发生风险和严重程度20,21,22。事实上，个体在一段时间内的平均摄入量可能源于少数几次大量饮酒事件，也可能源于多次每次摄入量相对较低的饮酒事件，而当摄入量仅以每次饮酒时段的总量来衡量时，这些细微差异将无法被检测到。重要的是，与健康对照个体相比，AUD患者表现出显著更多的伴随大剂量饮酒行为（即“牛饮”）的饮酒事件23，且非人灵长类动物的数据表明，在饮酒早期即形成包含大剂量饮酒行为模式的个体，发展为AUD的风险显著增加22。此外，包含大剂量饮酒行为的饮酒事件会显著增加发病率和死亡率风险，这一风险独立于AUD的诊断21。综上所述，这些数据促使研究者在临床前模型中更加关注饮酒模式而不仅仅是总体摄入水平，并推动了多种复杂程度不同的系统的发展，这些系统能够记录到单次舔饮水平的饮酒数据。

最早的研究之一是开发了一种双瓶系统，配备有光束舔舐检测装置，专为小鼠使用而设计24。随后，另一研究团队将该系统改进并应用于大鼠25。在此之后的数年中，基于这一理念的多种变体被用于开发集成于定制啮齿类动物饲养笼内的类似系统26，可实现对群养个体动物的舔舐行为检测27,28，并能同时记录摄食和饮水行为29。其中，LIQ HD（舔舐事件定量家庭笼具装置，Lick Instance Quantifier Home cage Device）30 引起了广泛关注，因其为小鼠提供了一种在实施便捷性和成本效益方面可与Godnyuck等人开发的系统相媲美的方案24。该系统采用电容感应技术，直接检测舌头与导电金属吸管之间的接触，而非依赖光束检测系统所采用的吸管接近或互动等间接测量方式。作者提供了数据，证明其电容感应系统在舔舐检测方面具有显著更高的精确度和灵敏度，相较于光束检测，其在舔舐次数与瓶子重量变化之间的相关性更强。作者进一步展示了该系统可与持续可及的双瓶选择家庭笼具饮酒范式结合使用，不仅可测量每日总摄入量，还可获取酒精饮用微观结构的相关指标30。

本文介绍了在标准方法以及能够检测舔舐行为的方法（图1）下，利用双瓶选择实验在动物家庭笼中进行酒精摄取的操作流程。我们还介绍了构建和实施LIQ HDR的方法——这是对LIQ HD30的改进版本，适用于大鼠，包含硬件修改以适应更大的笼具尺寸，并配备重新设计的3D打印瓶架，可兼容市售的标准试剂瓶。这些方法为研究人员提供了灵活性，可根据其实验资源和数据采集需求，选择使用标准方法或配备舔舐监测装置的方法。

以下是根据 Simms 等人7改进的间歇性双瓶选择饮酒实验方法，用于在家庭笼环境中记录饮水行为所需的材料说明及逐步操作步骤。在此方法中，大鼠每周7天、每天24小时可接触两个饮水瓶。在周一、周三和周五（MWF），为大鼠提供一个装有水（H2O）的瓶子和另一个装有乙醇（EtOH）的瓶子。在周二、周四和周六（TRS），移除上述瓶子，并更换为两个装有水的瓶子。在周六和周日，大鼠持续从这两个水瓶中饮水。需要注意的是，如有需要，该方法可轻松调整为其他乙醇摄入模式（例如连续摄入、暴饮等）。本文分别提供了标准装置和配备舔触记录仪（lickometer）装置的操作说明。

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方案

所有代表性数据均使用单笼饲养的成年Long-Evans大鼠采集，实验方案经伊利诺伊大学芝加哥分校机构动物护理与使用委员会批准，并遵循《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》。为准确监测每只动物的液体摄入量，必须采用单笼饲养。实验所用成年雄性（n = 38）和雌性（n = 22）Long-Evans大鼠在到达时为P50–80日龄，在开始实验前于动物房适应环境一周。大鼠具有 随意摄取 除非另有说明，均可自由获取标准饲料（Teklad 7912，Envigo）和水。

1. 实验前准备

  1. 将饮水瓶标记为 H2O 或 EtOH。然后，为每只大鼠分别标记一个用于周一、周三、周五（MWF）的 H2O 瓶和一个 EtOH 瓶，以及两个用于周二、周四、周六（TRS）的 H2O 瓶。
    注意：可选地，使用不同颜色的胶带区分 H2O 和 EtOH 瓶，以帮助避免换瓶时可能出现的错误。
  2. 在实验开始前 1 天，用饮用水装满 H2O 瓶。在实验开始前 1 天，通过将 190 证的 EtOH 与饮用水混合（20% v/v）配制 EtOH 溶液。
    警告：必须使用未变性 EtOH，因为变性 EtOH 具有毒性。
  3. 在参与实验的大鼠所在的同一层架上准备一个空笼子。该笼子将用于计算液体洒漏量。
  4. 如使用 LIQ HDR 系统，则在笼具中安装该系统（见步骤 3，图 2、图 3、图 4、图 5、图 6 以及 补充图 1）。
  5. 在研究开始前确定每日换瓶的准确时间。为了获得准确的 24 小时摄入量测量值，应每天在同一时间更换瓶子。
    注意：先前的研究表明，啮齿类动物在黑暗周期开始后不久的摄取量最高10,31。因此，为了捕捉这一高度活跃时期的摄入情况（见步骤 2.3.1 以记录类似暴饮的行为），建议在关灯后 30–60 分钟内进行换瓶操作。换瓶期间使用红色灯照明，以便观察且不干扰明暗周期。

2. 每日操作与维护

  1. 实验第一天，请执行以下操作。
    1. 从笼中移除标准水瓶。
    2. 可选：大鼠在觅食时常会触碰笼顶，可能导致无法通过空置的洒落物收集笼纠正的饲料洒落。在笼内使用饲料杯可缓解此问题。若采用此方法，现将饲料从笼顶移除，在笼内添加一个饲料杯，并装入饲料。确保分配给大鼠的笼底面积仍符合机构指南要求，具体需根据大鼠笼尺寸和饲料杯尺寸进行评估。
    3. 向相关护理和饲养人员说明，在实验期间由研究人员负责提供食物和水。
    4. 笼具更换可能干扰数据采集。建议将笼具更换与体重测量同步进行。选择此操作方式的研究人员应相应地告知饲养管理人员。
  2. 在随后的几天中，遵循以下所述的步骤。
    注意：请记住，移动笼子和瓶子时可能会造成溢出。因此，操作时动作要轻柔，并采用与大鼠笼子相同的瓶子安装和取下方法来处理溢出用笼子。
    1. 在换瓶前进入房间，确保有充足时间完成以下步骤，并在规定的实验开始时间将新瓶子放置到笼具上。
    2. 移除笼具的滤帽。若为MWF，则进行步骤2.2.3；若为TRS，则进行步骤2.2.4。
    3. 每周一、周三和周五，从笼顶取下 TRS 瓶。称量周一、周三、周五的瓶子（一个含乙醇，一个含水）2O）。记录瓶子在当天饮酒实验开始时的重量。如有必要，可在笼顶或食杯中额外提供食物。在指定的实验开始时间，将瓶子放置于每只大鼠笼顶，标签面朝上，以防止大鼠啃咬瓶身标签。
      注意：通常情况下，TRS实验中不记录或报告饮水量，但研究者可根据需要选择通过以下2.2.3和2.2.4步骤中所述方法，获取饮水瓶在给药前后重量来收集相关数据。每次饮酒阶段结束后，应交替乙醇瓶的放置侧，以避免产生潜在的侧位偏好，否则可能无意中影响摄取量数据的准确性。
      1. 可选：先前的研究表明，许多大鼠在饮酒阶段开始时表现出类似暴饮的行为8,32,33大多数研究人员在记录此期间的暴饮行为时，会关注饮酒开始后前30-60分钟内的摄入量。为获取此次潜在暴饮事件期间的摄入数据，请按以下步骤操作。
      2. 在将瓶子放置到最后一笼后设置计时器。在计时期间内保持房间不受干扰。
      3. 计时器响起后重新进入房间。移除乙醇和 H2O 瓶并记录瓶重。将乙醇和 H2O型瓶转移到笼子。
        注意：当使用配备舔舐检测功能的系统时，此步骤无需用于捕捉暴食发作事件。
    4. 在星期二、星期四和星期六，在指定的实验结束时间（即开始时间后的24小时）从笼中移除MWF瓶。称量每个瓶子的重量，并记录MWF饮水阶段的瓶末重。获取并记录每只大鼠的体重。如有需要，可在笼顶或食杯中补充额外食物。放置TRS H2将O型瓶用胶带固定在每只大鼠笼子顶部，瓶身标签朝上，以防大鼠啃咬标签。
    5. 将滤膜盖子放回笼盒上，并离开动物房。
      注意：可选择性覆盖乙醇瓶吸嘴以防止蒸发。若由研究人员执行换笼操作，应在TRS职责期间每周指定一天完成此任务。在获取每只大鼠体重后，将其放入清洁的笼具中。
  3. 每周或每两周定期按照机构的动物护理和饲养规程清洗水瓶并更换液体，操作时需注意避免干扰动物的饮水过程。例如，TRS H2O型瓶可在去除后清洗并重新灌装。同样地，MWF H2O 和 EtOH 瓶在从 TRS 上取下后可进行清洗并重新灌装。

3. 双瓶选择实验中的舔舐检测

注意：希望获取高分辨率饮水数据的研究人员可通过为瓶子增加舔舐检测功能来修改上述实验步骤。LIQ HD30 是一种低成本的自助式（DIY）系统，可用于小鼠的此类数据采集。下述操作步骤描述了将LIQ HD改装用于大鼠（称为LIQ HDR）所需的修改。参见 材料表 如需获取构建一套舔舐检测系统所需的全部市售和定制3D打印部件清单（该系统可同时采集多达18只大鼠的双瓶选择数据），请访问作者网站（www.ejgloverlab.com/3dprints），获取3D打印.stl文件及相关说明。

  1. 设置电容式传感器单元
    注意：每个 LIQ HDR 系统包含三个电容式传感器单元，可同时采集 36 个瓶子的舔水数据，对应 18 只单笼饲养的大鼠。每个传感器单元由一块差分 I2C 通信 breakout 板和一块 12 键电容式传感器板组成，通过六对颜色编码的 2 针电缆连接至六个独立笼具的舔水检测装置（图 2A）。
    1. 准备构建全部三个电容式传感器单元所需的材料（如 图 2B 所示），以及必要的焊接工具。
    2. 开始构建传感器单元 A 时，将一根 2 针母接头电缆用一段 7 英寸长的红色热缩管包裹，将其红、黑导线末端分别插入传感器板的第 0 和第 1 引脚（图 2C-1），并进行焊接固定（图 2C-2）。确保电缆位于传感器板前方，以便在动物房内从左到右按数字顺序排列笼具时，电缆不会交叉，从而避免干扰记录（见步骤 3.6 和 图 6）。
    3. 再用五种不同颜色的热缩管分别包裹其余五根电缆，并按图示焊接到第 2 至第 11 引脚（图 2C-3）。确保所有红色导线焊接到偶数编号引脚（连接左侧所有瓶子），所有黑色导线焊接到奇数编号引脚（连接右侧所有瓶子）。
    4. 在所有焊点周围涂上热熔胶以进行保护（图 2C-4）。按数字顺序标记接头，为每个舔水检测装置提供唯一标识号（图 2C-4）。
    5. 组装传感器单元 A：使用一根 50 mm 的 4 针电缆将传感器板 A 连接到通信 breakout 板的端点（EndPoint），再使用一根 100 mm 的 4 针电缆将该端点连接到 5V 转 3V 电平转换器的 3.3 V 输出端（图 2D-1）。尽管传感器板和通信 breakout 板均有两个相同的 4 针接口，但仍需确保布线完全如图所示（图 2D-1 和 图 2F），以便使用 3D 打印的传感器外壳和推荐的动物房布局（见步骤 3.6 和 图 6）。将传感器单元 A 安装进 3D 打印外壳中（图 2D-2）。轻轻合上顶盖，注意不要压到电平转换器的电缆（图 2D-3）。
    6. 通过将跳线从 ADDR 引脚焊接到 3Vo 或 SDA 引脚，修改传感器板 B 和 C 的 I2C 地址（如 图 2E 所示）。
    7. 使用与板 A 相同的顺序，将六根颜色编码的母接头电缆焊接到传感器板 B 和 C 上。用相应的舔水检测装置 ID 编号标记每个接头。使用 50 mm 的 4 针电缆将板 B 连接到通信 breakout 板的中点（MidPoint），板 C 连接到端点（EndPoint）（图 2F）。
    8. 将传感器单元 B 和 C 分别装入各自的 3D 打印外壳中。使用以太网电缆将三个传感器单元串联连接，完成传感器系统的搭建（图 2G）。
  2. 设置微控制器接口
    注意：LIQ HDR 微控制器接口（补充图 1A）与 LIQ HD30 所描述的基本相同，仅有细微修改。以下步骤概述了设置接口所需的操作，其中步骤 3.2.6 和 3.2.8 描述了具体修改。研究人员可参考原始协议及作者 GitHub 页面提供的视频教程，获取更详细的逐步说明30。
    1. 准备构建微控制器接口所需的材料和焊接工具（补充图 1B）。在触摸屏屏蔽板背面（补充图 1C-1），在背光焊盘之间创建一个焊锡跳线（补充图 1C-2）。
    2. 在数据记录屏蔽板背面，切断 CS 引脚的跳线焊盘走线（补充图 1D-1）。在数据记录器正面，用一根短跳线将 CS 引脚焊接到第 7 引脚（补充图 1D-2）。
    3. 安装屏蔽堆叠插针时，先将其堆叠到触摸屏屏蔽板背面（补充图 1E-1）。将数据记录器堆叠到触摸屏上，用胶带固定，然后将所有插针焊接到数据记录器上（补充图 1E-2）。随后取下触摸屏。
    4. 将剩余的 2 x 3 插针堆叠到微控制器上（补充图 1F-1），然后在焊接前将数据记录器堆叠到微控制器上（补充图 1F-2）。
    5. 将纽扣电池插入数据记录器（补充图 1G-1）。将触摸屏堆叠到数据记录器上（补充图 1G-1）。将 microSD 卡及其适配器插入数据记录器（补充图 1G-2）。
    6. 制作额外的接地线：从一根跳线中剪下一端的公接头，并将末端剥去约 1/4 英寸（补充图 1H-1）。将一段剥皮的实心导线焊接到跳线上，并用热缩管覆盖焊点（补充图 1H-2）。
    7. 将 4 针跳线和额外的接地线插入微控制器（黑色 - GND，红色 - 5V，黄色 - 第 21 引脚，蓝色 - 第 20 引脚，补充图 1I-1）。用热熔胶固定连接（补充图 1I-2）。可选地，用热缩管包裹跳线（补充图 1I-2）。
    8. 将完全组装好的微控制器接口装入 3D 打印外壳中，使 4 针跳线和接地线从顶部开口穿出（补充图 1J）。
    9. 按照原始协议安装微控制器接口的软件30。
  3. 构建 LIQ HDR 舔水检测装置
    注意：用于固定瓶子的定制 3D 打印件专为标准啮齿类饮水瓶设计，适配吸管直径为 8 mm 的饮水瓶（见 材料表，图 3A）。该瓶架可轻松适配类似尺寸的饮水瓶和吸管，通常无需或仅需少量修改。
    1. 准备构建一个舔水检测装置所需的材料、3D 打印件和焊接工具（如 图 3B 所示）。注意，每个 LIQ HDR 系统最多可支持 18 个舔水检测装置，对应 36 个瓶子。
    2. 为延长公接头电缆，将其两端均剥去约 1/4 英寸长度，同时剥去延长用的黑色和红色导线（图 3C-1）。
    3. 将延长导线焊接到接头电缆上（图 3C-2），并用热缩管覆盖焊点（图 3C-3）。用与传感器单元上对应母接头电缆颜色匹配的热缩管包裹公接头电缆（图 3C-4）。
    4. 为与传感器板布线保持一致（图 2），将红色和黑色导线分别穿过瓶架左侧和右侧的内部电缆通道（图 3D-1）。
    5. 将每根导线焊接到 1 ¾ 英寸导电铜箔的最末端（图 3D-2），然后将铜箔对折（图 3D-3）。
    6. 撕去铜箔背胶，使用镊子小心将其置入吸管支架内部（图 3E-1），然后牢固地粘贴到吸管支架内壁上（图 3E-2）。确保铜箔的焊接面粘贴在靠近瓶架中线的一侧（如图所示，图 3E-2）。将吸管穿过支架，压紧铜箔并完成支架预装。
    7. 为加固粘性较差且易脱落的铜箔焊接面，在焊点处涂抹少量热熔胶（图 3E-3）。涂抹胶水以覆盖铜箔及 3D 打印件上相邻的任何裸露部分（图 3E-4）。
    8. 将电缆穿过电缆保护套的内部通道（图 3F）。务必为每个舔水检测装置选择合适的电缆保护套（左向或右向），以适配推荐的动物房布局（见步骤 3.6 和 图 6）。注意：当前设置中以蓝色或紫色电缆表示的舔水检测装置 5-6、11-12 和 17-18 需使用左向电缆保护套（图 4D-1），其余所有舔水检测装置则需使用右向电缆保护套（图 4D-2）。
    9. 安装电缆夹时，先将一根导线放入电缆夹一半的凹槽中（图 3G-1），再将另一半覆盖在第二根导线上，然后用螺母拧紧两半（图 3G-2）。
    10. 用相应的舔水检测装置 ID 编号标记公接头（图 3H）。重复上述步骤，直至完成全部 18 个舔水检测装置的制作。
  4. 安装 LIQ HDR 舔水检测装置
    注意：LIQ HDR 设计用于安装在带有金属丝网顶的标准鞋盒式大鼠笼具上（图 4A-1）。
    1. 在金属丝网笼顶上找到两对中心间距约为 75 mm 的金属杆，以适配瓶架。使用钳子轻微撑开吸管开口周围的金属杆，并用绝缘胶带包裹这些金属杆，防止吸管与笼顶之间发生金属接触（图 4A-2）。
      注意：尽管绝缘胶带无法被大鼠接触，因此不易被啃咬，但仍建议在研究结束时丢弃，且不得在不同研究间重复使用。
    2. 使用两组 M5 螺丝和螺母将舔水检测装置和 1/8 英寸厚的激光切割亚克力板安装到笼顶上（图 4B）。确保舔水检测装置和亚克力板上的吸管开口对齐，且吸管不与笼顶任何部分接触。
    3. 将电缆夹固定在金属丝网笼顶最外侧的金属杆（直径约 4 mm）上（图 4C）。根据需要调整电缆夹，确保笼顶能紧密贴合笼底，且电缆不受过度拉扯或弯曲。确保每个舔水检测装置使用正确的电缆保护套（图 4D，参见步骤 3.8.8）。
    4. 根据需要调整吸管，使仅约 2 cm 的吸管从瓶盖伸出（图 4E-1）。安装瓶子时，将吸管穿过瓶架的吸管支架直至无法再推进（图 4E-2）。仅吸管最尖端应略微突出于亚克力板之外（图 4E-3）。必须确保吸管其他部分完全不外露，以避免因非摄食行为（如大鼠触碰或玩耍吸管）导致的假阳性舔水信号。过滤盖应能紧密覆盖在金属丝网笼顶和电缆夹上，且不干扰电缆本身（图 4F）。
      注意：对于需要吸管更深入笼内的实验（例如测量幼年大鼠饮水行为，因其可能难以触及较短吸管），可使用更厚的亚克力板或叠加多层 1/8 英寸板，以完全封闭较长的吸管。
  5. 安装和使用吸管阻断器
    ​注意：吸管阻断器（图 5A）设计用于在更换瓶子期间限制大鼠接触吸管，并确保每次饮水会话开始时舔水检测装置的校准准确。
    1. 准备一个吸管阻断器所需的 3D 打印部件及一个 M5 螺丝、螺母和垫圈（如 图 5B 所示）。
    2. 将 SIPPER_Gear 插入 SIPPER_Base 中（图 5C-1）。确保 SIPPER_Gear 的方向与 3D 渲染图插图中完全一致。将 SIPPER_Worm 插入 SIPPER_Base 顶部的开口中，边插入边顺时针旋转，直至其头部与基座齐平（图 5C-2）。
    3. 从基座底部将 SIPPER_Nut 拧到蜗杆末端（图 5C-3）。使用镊子在旋转蜗杆旋钮的同时拧紧螺母。将 SIPPER_Blockers 的圆形细颈插入齿轮的槽口中（图 5C-4）。
    4. 使用 M5 螺丝组件将组装好的吸管阻断器安装到笼顶上（图 5D）。确保两个吸管阻断器与吸管开口对齐。
    5. 为阻断吸管接触，顺时针旋转蜗杆旋钮，降低阻断器，直至其完全覆盖吸管开口（图 5E）。
    6. 为恢复吸管接触，逆时针旋转旋钮，使阻断器升至垂直于笼顶的竖直位置（图 5F-1）。手动向上拉动每个阻断臂，使头部刚好位于金属丝网笼顶下方。将阻断器旋转 90°，使头部与笼顶金属杆平行，臂部锁定到位（图 5F-2）。继续逆时针旋转旋钮，直至两个阻断器完全升至笼顶上方（图 5F-3），吸管完全可接触（图 5F-4）。
  6. 在动物房中使用 LIQ HDR 系统
    注意：以下动物房设置经过优化，可使用单个微控制器接口采集 18 个标准鞋盒式大鼠笼具的双瓶选择饮水数据。所有电子组件（包括微控制器接口、传感器单元及各类电缆）均固定在承载笼具的壁挂式金属丝网架上（图 6A）。根据动物设施和用户需求，可能需要进行部分修改。
    1. 使用定制的 3D 打印安装螺丝将每个传感器单元固定在动物房架子上（图 6B）。确保每个传感器单元安装在对应黄色舔水检测装置的笼具正下方，以避免不必要的电缆张力（图 6A）。
    2. 排列并固定每根母接头电缆，确保它们互不重叠，且焊点处无过度弯曲，以免影响舔水检测效果（图 6B）。若使用金属杆架子，可通过扎带将接头电缆分别固定在架子的不同金属杆上，如图所示。
    3. 使用相同的 3D 打印安装螺丝将微控制器接口安装在传感器单元 A 旁边，并将其 4 针接头插入连接至传感器单元 A 的 5V 转 3V 电平转换器的 5 V 输入端口（图 6C）。
    4. 使用绝缘胶带将额外的接地线固定到接地源（如金属架子）上（图 6D）。
    5. 根据已安装舔水检测装置的颜色和 ID 编号排列每个笼具（如 图 6A 所示），以最小化电缆重叠和张力。
    6. 将所有公头舔水检测电缆牢固地连接到对应的母头传感器电缆上（图 6E）。接通电源以启动微控制器接口（图 6F）。
    7. 在主图形用户界面（GUI）页面（图 6G）上，点击 设置符号 以打开设置页面。 用户可根据动物房作息时间调整“开灯”和“关灯”时间，以确保在暗周期开始时界面显示自动变暗（图 6H-1）。
    8. 点击 编辑传感器设置 （图 6H-1），将触碰阈值调整为 8，释放阈值调整为 2，此设置在当前系统中可实现最稳定的舔水检测效果（图 6H-2）。然而，若对当前系统进行任何修改，用户可能需要尝试不同设置。
    9. 若数据采集周期仅为 24 小时或更短，请取消勾选 自动校准（图 6H-2）。

4. 使用舔舐检测法进行双瓶选择家庭笼具饮水的每日操作流程

  1. 按照第2步中所述的标准双瓶选择实验步骤进行操作，但需进行以下修改。
  2. 在周一、周三和周五，使用MWF瓶之前，先用饮水管阻塞器盖住所有笼子的饮水管开口（参见步骤3.5.5和 图5E).
  3. 在记录之前，选择正确的 实验组 在主图形用户界面页面上，该位置即为当天乙醇瓶所在的一侧（图6G).
  4. 安装所有MWF瓶后，轻触 开始！ 在主页上（图6G) 开始校准传感器，建议用户此时远离系统，并确保大鼠未舔舐饮水管（图6I-1）。校准过程需要数秒完成，完成后系统将进入主记录页面，显示每个舔瓶计数器上每只瓶子的累积舔舐次数图6I-2).
  5. 将所有饮水管阻隔器抬升至笼盖上方，以允许动物接触饮水管（参见步骤 3.5.6 及 图5F），并按照所述方法轻轻放回所有滤膜盖（参见步骤 3.4.4 和 图4F).
  6. 轻敲 刷新 以更新屏幕上的舔舐次数，屏幕不会自动实时更新（图6I-2).
  7. 每周二、周四和周六，轻触 保存 & 退出 停止录制并返回主页面（图 6I-2) 在移除MWF瓶之前。
  8. 为传输数据而取出SD卡，请轻触 弹出SD卡 在拔下 SD 卡之前（图6G）。将SD卡插入任意计算机，并复制/粘贴以瓶子开启日期命名的.csv数据文件至该计算机（图6K）。要为下一次录制重新安装SD卡，请将卡插入接口并轻触 安装SD (图6J).
    注意：建议每天备份数据文件。
  9. 建议在符合动物模型和动物使用方案的前提下，将体重测量频率限制为每周一次，并在指定换笼日进行，以尽量减少对舔舐监测仪和传感器的不必要干扰。移动笼子前，应先拔下所有雄性舔舐监测仪电缆与相应雌性传感器电缆的连接。每次称重后，立即将大鼠放回清洁的笼子中。必要时，将舔舐监测仪转移至新的笼盖，并重新将每个舔舐监测仪与对应的传感器连接。
  10. 对于测试干预措施（例如药物注射）对乙醇摄入量和饮酒微结构影响的实验，应尽可能在饮酒阶段开始前实施干预。当无法做到时，研究人员可通过轻敲来中断舔舐检测 暂停 (图6I-2）并通过点击恢复数据采集 简历 干预结束后。我们建议在每次饮酒阶段的暂停期间收集瓶子的重量，以记录干预前后乙醇摄入量的变化，并计入在移开笼盖以接触动物时可能发生的液体洒漏。
  11. 研究结束后，所有笼内组件在用于新动物之前均应彻底消毒，以限制动物间污染物的传播。建议使用70% EtOH溶液轻轻喷洒并擦拭舔舐测量仪，注意避免损坏内部电子元件。吸管阻断器和亚克力板可用温肥皂水清洗。

5. 数据分析

  1. 在评估依赖性指标之前，需根据每天更换瓶子时不可避免发生的洒漏情况，校正摄入量数据。为此，计算乙醇（EtOH）和水（H₂O）瓶重量变化的平均值。2在整个研究期间，将O瓶放置在溢出防护笼内。
  2. 排除每个瓶子中大于平均值两个标准差的任何数值。剔除这些离群值后，从乙醇和H的变化中减去计算得到的平均值2通过称量装有动物的笼具上瓶子的重量获得O瓶重。通过减去该数值，研究人员可以确保在计算消耗量时，不会将特定溶液洒出的平均损失量计算在内。在某些情况下，减去平均洒出量可能导致某些动物的数值为负值。此时应将这些负值转换为零，并解释为该动物对该溶液无任何摄入。
  3. 双瓶选择饮酒实验的主要依赖性测量指标为乙醇摄入量（g/kg）和偏好百分比（%）。根据乙醇瓶重量变化（g）计算摄入量，并通过以下步骤将其标准化为体重（kg）。
    1. 使用以下公式将瓶子重量的变化（g）转换为体积的变化（mL）：
      figure-protocol-1
      纯乙醇的密度为 0.789 g/mL。因此，20% 乙醇的贡献密度为 0.1578 g/mL。2O 的密度为 1 g/mL。因此，80% H2O = 0.80 g/mL。因此，每毫升20%乙醇溶液（v/v）由0.1578（乙醇）+ 0.80（H2O) = 0.9578 g/mL。因此，当使用20%（v/v）乙醇浓度时，最终方程为：
      figure-protocol-2
    2. 使用以下公式计算乙醇消耗剂量。采用与摄入数据同一周内测得的体重，以根据动物体重计算乙醇消耗量。
      figure-protocol-3
    3. 使用以下公式计算偏好值：
      figure-protocol-4
  4. 与其小鼠同源物类似30，LIQ HDR 可捕获多种饮水微结构变量，包括舔水持续时间、饮水次数、每次饮水持续时间、每次舔水次数和每次舔水持续时间（图 6K）。一次饮水行为定义为一系列舔舐动作，其开始于1秒内至少完成3次舔舐，并在连续3秒无额外舔舐后结束。这些指标可用于计算单次舔舐平均持续时间、单次饮水行为平均持续时间、每次饮水行为中的平均舔舐次数、平均舔舐频率、估计的舔舐间间隔以及估计的饮水行为间间隔。
    注意：微控制器接口以 1 分钟为分辨率在 .csv 文件中提供这些微结构数据（图6K）。研究人员可以使用随原始LIQ HD方案提供的分析应用程序30 或使用其偏好的后期处理平台，根据研究需求整合和汇总数据。微结构数据通常在整个24小时期间进行总和，以在宏观层面比较平均差异，或按30分钟至1小时的时间段分组，以分析光照-黑暗周期中饮酒模式的变化。

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结果

标准间歇性双瓶选择法在家庭笼具中饮酒数据
采用标准操作流程（图7A），研究人员可记录24小时内的酒精摄入量（图7B-D），若在饮酒阶段开始后不久即采集瓶子重量，还可获得类似暴饮的饮酒数据（图7E-F）。通过计算乙醇摄入量相对于水摄入量的比值，研究人员亦可在所有测量时间点获得偏好数据（图 7D、F）。如图7C所示，大鼠在双瓶选择实验的最初几天内常表现出乙醇摄入量逐渐上升的阶段。随后进入平台期，摄入量保持相对稳定。尽管该模式在雄性大鼠中 consistently 被观察到7,32

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讨论

本方案提供了使用间歇性双瓶选择家庭笼具程序采集乙醇饮用数据的逐步操作说明。该方法实施相对简便，几乎无需额外成本或专用科研设备。通过本文提供的方法构建和实施LIQ HDR——一种用于大鼠的舔舐检测系统——研究人员除可获得摄入量和偏好性的常规测量指标外，还可采集高分辨率的饮水微结构数据。

当前方案中描述的间歇性获取模式被广泛使用，主要原因在于该模式已知能够诱导出比许多其他乙醇获取模式更高的乙醇摄入水平。事实上，先前的研究表明，采用间歇性获取模式的大鼠其平均每日乙醇摄入量高于持续24小时自由获取乙醇的大鼠6,7。然而，根据具体的研究问题或其他实验设计参数，可能需要采用不同的乙醇获取模式。研究人员可以非常容易地修改本方案，以适应不同的获取模式（例如，持续获取、暗期饮酒等），只需简单调整瓶子的开启/关闭时间及操作的天数即可。

尽管双瓶选择饮酒实验是一种相对容易实施的范式，但仍可能出现影响数据采集的问题。因此，实验人员必须...

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披露

所有作者均声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢 Joseph Pitock 和 Katie Przybysz 博士在 LIQ HDR 方法开发过程中提供的技术协助。我们还感谢 Nicholas Petersen 和 Marie Doyle 博士在 LIQ HDR 开发期间参与的许多有益讨论。本研究由美国国立卫生研究院下属的国家酒精滥用与酒精中毒研究所资助（项目编号：P50 AA022538 和 R01 AA029130，授予 EJG）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
市售可得组件数量
12键电容式触摸传感器扩展板（MPR121）Adafruit19823
2针电缆配对（JST XH 2.5mm间距）Adafruit487218
4针面包板跳线（Qwiic）SparkFunPRT-179121
4针电缆（100mm Qwiic）SparkFunPRT-172591
4针电缆（50mm Qwiic）SparkFunPRT-172603
5V转3V电平转换扩展板Adafruit56371
电容式触摸扩展板（2.8英寸）Adafruit19471
导电铜箔胶带（1/4英寸）DigiKey4393-CFT-1/4-ND1
数据记录扩展板Adafruit11411
差分I2C通信扩展套件（QwiicBus）SparkFunKIT-172501
绝缘胶带DigiKey3M156004-ND1
热缩管（3/16英寸，多种颜色）Cable Ties and MoreHS357-S106
热缩管套件（4英寸，黑色）Jameco20959631
锂纽扣电池（3V，12.5mm）DigiKey1908-CR1220JAUCHSB-ND1
M5平垫圈Grainger54FN661
M5六角螺母Grainger6CA721
M5机螺钉（12mm）Grainger6GU881
M5机螺钉（25mm）Grainger 6GU912
公对公跳线Adafruit19571
微控制器板（Arduino Mega 2560 Rev3）DigiKey1050-1018-ND1
PETG线材（2.85mm，银色）MatterHackersM-DDH-UZR22
PLA线材（2.85mm，黑色）MatterHackersM-SEW-RUAW2
PLA线材（2.85mm，银色）MatterHackersM-66P-6CLE1
电源适配器（直流9V 1A）Newegg9SIBPPKJYR59911
SD/microSD存储卡（8GB）Adafruit12941
扩展板堆叠排针Adafruit851
实心导线（22AWG，红色）Adafruit2881
绞合导线（22AWG，黑色）Adafruit29761
绞合导线（22AWG，红色）Adafruit30681
带钢珠的旋盖式饮水管Alternative DesignTCCN8.5-ST2.5SB38
水瓶（8盎司）Alternative DesignWB8FS38
定制3D打印组件数量
3D打印Arduino外壳底座N/AARDUINO_Bottom.stl1
3D打印Arduino外壳顶盖N/AARDUINO_Top.stl1
3D打印电缆夹左件N/ACLIP_L.stl18
3D打印电缆夹螺母N/ACLIP_Nut.stl18
3D打印电缆夹右件N/ACLIP_R.stl18
3D打印舔舐测量仪瓶架N/ALICKOMETER_Bottle Holder.stl19
3D打印舔舐测量仪电缆保护左件N/ALICKOMETER_Cable Protector_L.stl6
3D打印舔舐测量仪电缆保护右件N/ALICKOMETER_Cable Protector_R.stl12
3D打印舔舐测量仪字母标识N/ALICKOMETER_Letters.stl19
3D打印安装螺钉N/AMount Screw.stl4
3D打印传感器外壳A底座N/ASENSOR_A_Bottom.stl1
3D打印传感器外壳A顶盖N/ASENSOR_A_Top.stl1
3D打印传感器外壳B底座N/ASENSOR_B_Bottom.stl1
3D打印传感器外壳B顶盖N/ASENSOR_B_Top.stl1
3D打印传感器外壳C底座N/ASENSOR_C_Bottom.stl1
3D打印传感器外壳C顶盖N/ASENSOR_B_Top.stl1
3D打印传感器外壳字母标识N/ASENSOR_Letters.stl1
3D打印饮水管阻挡器N/ASIPPER_Blocker.stl36
3D打印饮水管阻挡器底座N/ASIPPER_Base.stl18
3D打印饮水管阻挡器齿轮N/ASIPPER_Gear.stl18
3D打印饮水管阻挡器螺母N/ASIPPER_Nut.stl18
3D打印饮水管阻挡器蜗杆N/ASIPPER_Worm.stl18
激光切割舔舐测量仪亚克力面板N/ALICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf19

参考文献

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