方法文章

使用双瓶选择家庭笼饮酒法与微观结构分析对啮齿类动物饮酒行为建模

DOI：

10.3791/67486

⸱

2024年11月8日

 ,  , 
1Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

本文内容

摘要

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本方案描述了一种标准的间歇性接触双瓶选择家庭笼具饮酒范式，用于模拟大鼠的酒精摄入行为。此外，本方案还提供了逐步指导，通过添加自制的舔舐检测系统来增强标准方案，从而实现对饮酒行为的微结构分析。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

双瓶选择法在动物家庭笼具中的饮酒行为研究是目前研究啮齿类动物乙醇摄入最广泛使用的方法之一。在最简单的形式中，动物可自由接触两个饮水瓶，其中一个装有普通自来水，另一个装有乙醇，每日摄入量通过测量24小时内饮水瓶重量的变化来确定。因此，该方法无需使用特殊实验设备。尽管这种易于实施的特性可能是其被临床前酒精研究领域广泛采用的主要原因，但该方法所获取的饮酒数据分辨率受限于研究人员测量饮水瓶重量的频率（例如每天一次）。然而，为了在总体摄入量、药理学干预和神经调控的背景下进一步分析饮酒模式，研究人员已开发出可在单次舔舐水平上采集数据的家庭笼具舔舐检测系统。尽管近年来已出现多种此类系统，但开源系统LIQ HD（Lick Instance Quantifier Home cage Device，家庭笼具舔舐实例量化装置）因其成本低廉且操作友好而在该领域受到广泛关注。尽管该系统令人期待，但其最初设计仅适用于小鼠。本文综述了标准双瓶选择法及配备舔舐计数器的双瓶选择法在家庭笼具中的适当操作流程，并介绍了将LIQ HD系统适配于大鼠的方法，包括对硬件进行改造以适应更大的笼具尺寸，以及重新设计一款可与市售标准饮水瓶兼容的3D打印饮水瓶支架。通过该方法，研究人员可同时并行分析多只大鼠的每日饮酒模式和摄入水平，从而在几乎不增加资源投入的情况下显著提高数据分辨率。这些方法为研究人员提供了灵活性，可根据具体实验需求选择使用标准饮水瓶或配备舔舐计数器的装置，以探究酒精饮用行为背后的神经生物学机制。

引言

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尽管历史上适度饮酒曾被认为对健康有一定益处，但近期大规模综合性研究显示，任何程度的酒精摄入均不安全。1,2事实上，酒精使用是第七大th 全球死亡和残疾的主要风险因素1 饮酒量即使很少的个体，其患癌症、传染病和受伤的风险也会增加1,3在美国，2016年至2021年间因饮酒导致的死亡人数增加了近30%4重要的是，死亡和残疾的风险随着消费量的增加而单调上升1.

尽管人类研究为了解酒精使用和滥用的神经生物学机制提供了宝贵的见解，但动物模型所提供的实验控制对于深入理解饮酒行为的机制以及重度饮酒风险至关重要。这些模型也是开发旨在减少失控性饮酒的治疗方法的重要工具。双瓶选择法在啮齿类动物的家笼环境中进行饮酒实验，是研究酒精摄入最广泛使用的临床前范式之一。这主要归因于其易于实施的特点，该方法无需特殊的研究设备或复杂的分析，即可测量动物的总自愿饮酒量及对酒精的偏好。使用这种方法，研究人员可通过计算每次饮酒时段开始和结束时瓶子重量的变化，在其期望的时间间隔（例如小时、天、周）内收集数据。该基本方法的多种变体已被领域内众多研究者采用，以实现短至长期范围内从低到中等乃至暴饮水平的酒精摄入。例如，连续性和间歇性双瓶选择程序已被用于分别促进小鼠5和大鼠6,7,8的低水平和中等水平酒精摄入。相同的范式在偏好酒精的品系动物中可促进高水平的酒精摄入7,9。此外，另一种对该方法的改进是将每日酒精接触时间限制在黑暗周期开始约3小时后，持续2至4小时，该方法已被证明可在小鼠中诱导暴饮行为（即“暗期饮酒”）10,11。这些方法的其他变体还曾与促进酒精依赖的方法（如慢性间歇性乙醇蒸气暴露）结合使用，以研究戒断期间自愿饮酒行为的加剧情况12,13,14,15,16,17,18,19。

尽管该领域广泛采用通过测量瓶子重量变化来评估酒精摄入量的标准方法，但其分辨率仅限于每次饮酒时段的总消耗量。因此，该方法无法捕捉饮酒模式，而饮酒模式已被证实会影响酒精使用障碍（AUD）的发生风险和严重程度20,21,22。事实上，个体在一段时间内的平均摄入量可能源于少数几次大量饮酒事件，也可能源于多次每次摄入量相对较低的饮酒事件，而当摄入量仅以每次饮酒时段的总量来衡量时，这些细微差异将无法被检测到。重要的是，与健康对照个体相比，AUD患者表现出显著更多的伴随大剂量饮酒行为（即“牛饮”）的饮酒事件23，且非人灵长类动物的数据表明，在饮酒早期即形成包含大剂量饮酒行为模式的个体，发展为AUD的风险显著增加22。此外，包含大剂量饮酒行为的饮酒事件会显著增加发病率和死亡率风险，这一风险独立于AUD的诊断21。综上所述，这些数据促使研究者在临床前模型中更加关注饮酒模式而不仅仅是总体摄入水平，并推动了多种复杂程度不同的系统的发展，这些系统能够记录到单次舔饮水平的饮酒数据。

最早的研究之一是开发了一种双瓶系统，配备有光束舔舐检测装置，专为小鼠使用而设计24。随后，另一研究团队将该系统改进并应用于大鼠25。在此之后的数年中，基于这一理念的多种变体被用于开发集成于定制啮齿类动物饲养笼内的类似系统26，可实现对群养个体动物的舔舐行为检测27,28，并能同时记录摄食和饮水行为29。其中，LIQ HD（舔舐事件定量家庭笼具装置，Lick Instance Quantifier Home cage Device）30 引起了广泛关注，因其为小鼠提供了一种在实施便捷性和成本效益方面可与Godnyuck等人开发的系统相媲美的方案24。该系统采用电容感应技术，直接检测舌头与导电金属吸管之间的接触，而非依赖光束检测系统所采用的吸管接近或互动等间接测量方式。作者提供了数据，证明其电容感应系统在舔舐检测方面具有显著更高的精确度和灵敏度，相较于光束检测，其在舔舐次数与瓶子重量变化之间的相关性更强。作者进一步展示了该系统可与持续可及的双瓶选择家庭笼具饮酒范式结合使用，不仅可测量每日总摄入量，还可获取酒精饮用微观结构的相关指标30。

本文介绍了在标准方法以及能够检测舔舐行为的方法（图1）下，利用双瓶选择实验在动物家庭笼中进行酒精摄取的操作流程。我们还介绍了构建和实施LIQ HDR的方法——这是对LIQ HD30的改进版本，适用于大鼠，包含硬件修改以适应更大的笼具尺寸，并配备重新设计的3D打印瓶架，可兼容市售的标准试剂瓶。这些方法为研究人员提供了灵活性，可根据其实验资源和数据采集需求，选择使用标准方法或配备舔舐监测装置的方法。

以下是根据 Simms 等人7改进的间歇性双瓶选择饮酒实验方法，用于在家庭笼环境中记录饮水行为所需的材料说明及逐步操作步骤。在此方法中，大鼠每周7天、每天24小时可接触两个饮水瓶。在周一、周三和周五（MWF），为大鼠提供一个装有水（H2O）的瓶子和另一个装有乙醇（EtOH）的瓶子。在周二、周四和周六（TRS），移除上述瓶子，并更换为两个装有水的瓶子。在周六和周日，大鼠持续从这两个水瓶中饮水。需要注意的是，如有需要，该方法可轻松调整为其他乙醇摄入模式（例如连续摄入、暴饮等）。本文分别提供了标准装置和配备舔触记录仪（lickometer）装置的操作说明。

方案

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所有代表性数据均使用单笼饲养的成年Long-Evans大鼠采集，实验方案经伊利诺伊大学芝加哥分校机构动物护理与使用委员会批准，并遵循《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》。为准确监测每只动物的液体摄入量，必须采用单笼饲养。实验所用成年雄性（n = 38）和雌性（n = 22）Long-Evans大鼠在到达时处于P50-80阶段，在开始实验前于动物饲养室中适应环境一周。大鼠具有 随意摄取 除非另有说明，均可自由获取标准饲料（Teklad 7912，Envigo）和水。

1. 实验前准备

  1. 将饮水瓶标记为 H2O 或 EtOH。然后，为每只大鼠分别标记一个用于周一、三、五（MWF）的 H2O 瓶和一个 EtOH 瓶，以及两个用于周二、四（TRS）的 H2O 瓶。
    注意：可选地，可使用不同颜色的胶带区分 H2O 和 EtOH 瓶，以帮助避免换瓶时可能出现的错误。
  2. 在实验开始前 1 天，用饮用水灌装 H2O 瓶。在实验开始前 1 天，通过将 190 证的 EtOH 与饮用水混合（20% v/v）配制 EtOH 溶液。
    注意：必须使用未变性 EtOH，因为变性 EtOH 具有毒性。
  3. 在参与实验的大鼠所在的同一层架上准备一个空笼子。该笼子将用于计算洒漏量。
  4. 若使用 LIQ HDR 系统，则在笼具中安装该系统（参见步骤 3，图 2、图 3、图 4、图 5、图 6 以及 补充图 1）。
  5. 在研究开始前确定每日换瓶的精确时间。为了获得准确的 24 小时摄入量测量值，应每天在相同时间更换瓶子。
    注意：先前的研究表明，啮齿类动物在暗周期开始后不久的摄取量最高10,31。因此，为了捕捉这一高度活跃时期的摄入情况（参见步骤 2.3.1 以记录类似暴饮的行为），建议在关灯后 30–60 分钟内进行换瓶操作。换瓶时使用红光灯，以便在不干扰光暗周期的情况下进行观察。

2. 每日操作与维护

  1. 实验第一天，请执行以下操作。
    1. 从笼子中移除标准的水瓶。
    2. 可选：大鼠在觅食时常会晃动笼盖，可能导致溢出，而溢出笼无法纠正此类问题。在笼内使用食杯可缓解这一问题。如采用此方法，请立即移除笼顶的食物，将食杯放入笼内并装入饲料。确保分配给大鼠的笼内地面空间仍符合机构指南，具体依据大鼠笼尺寸和食杯尺寸而定。
    3. 视情况向饲养管理人员说明，在实验期间将由研究人员提供食物和饮水。
    4. 更换笼具可能干扰数据采集。建议将笼具更换与体重测量同步进行。选择此操作方式的研究人员应相应通知其饲养管理人员。
  2. 在后续各天，请遵循以下程序。
    注意：请注意，任何笼具和水瓶的移动都可能造成溢出。因此，操作时动作应轻柔，并在溢出笼上使用与大鼠笼相同的水瓶安装和移除方法。
    1. 在更换水瓶前进入房间，确保有足够时间完成以下步骤，并在指定的实验开始时间将新水瓶放置到各笼具上。
    2. 移除笼具的滤膜盖。若为周一、周三、周五（MWF）操作，请进入步骤 2.2.3；若为周二、周四、周六（TRS）操作，请进入步骤 2.2.4。
    3. 在周一、周三和周五，从笼顶移除 TRS 水瓶。称量 MWF 水瓶（一个 EtOH 瓶和一个 H2O 瓶），记录今日饮酒阶段的起始重量。如有需要，向笼顶或食杯中补充饲料。在指定的实验开始时间，将水瓶放置到每只大鼠笼顶，确保胶带朝上，以防大鼠啃咬瓶身标签。
      注意：通常情况下，TRS 阶段不记录或报告饮水量，但研究人员可根据需要选择收集相关数据，方法如下文步骤 2.2.3 和 2.2.4 所述，通过获取水瓶放置前后重量进行记录。为避免产生潜在的偏好侧位，从而无意中影响摄入量数据，每次饮酒阶段后应交替 EtOH 水瓶的放置侧位。
      1. 可选：先前研究表明，许多大鼠在饮酒阶段开始时表现出类似暴饮的行为8,32,33。大多数在此期间记录暴饮行为的研究人员会报告饮酒开始后前 30–60 分钟的摄入量。如需获取此潜在暴饮阶段的摄入数据，请遵循以下步骤。
      2. 在最后一个笼具放置水瓶后设置计时器。在计时期间保持房间不受干扰。
      3. 计时结束后重新进入房间，移除 EtOH 和 H2O 水瓶并记录其重量。随后将 EtOH 和 H2O 水瓶重新放回笼顶。
        注意：若使用配备舔液检测系统的设备，则无需执行此步骤来记录暴饮事件。
    4. 在周二、周四和周六，在指定的实验结束时间（即开始时间后 24 小时）从笼具上移除 MWF 水瓶。称量每个水瓶并记录 MWF 饮酒阶段的结束重量。获取并记录每只大鼠的体重。如有需要，向笼顶或食杯中补充饲料。将 TRS H2O 水瓶放置到每只大鼠笼顶，确保胶带朝上，以防大鼠啃咬瓶身标签。
    5. 将滤膜盖重新装回笼具，并离开动物房。
      注意：可选地，可覆盖 EtOH 水瓶的吸管口以防止蒸发。若由研究人员执行换笼操作，建议在每周 TRS 操作期间指定一天完成此任务。在获取体重后，将每只大鼠转移至清洁的笼具中。
  3. 根据机构的动物护理与饲养规程，定期（每周或每两周）清洗水瓶并更换液体。执行这些操作时应注意避免中断饮酒阶段。例如，可在 MWF 阶段移除 TRS H2O 水瓶后立即进行清洗和重新灌装；同样，可在 TRS 阶段移除 MWF H2O 和 EtOH 水瓶后进行清洗和重新灌装。

3. 双瓶选择实验中的舔舐检测

注意：希望采集高分辨率饮水数据的研究人员可通过为饮水瓶添加舔舐检测功能来改进上述实验流程。LIQ HD30 是一种低成本的自助式（DIY）系统，可用于小鼠的此类数据采集。以下所述步骤介绍了将 LIQ HD 改装用于大鼠（称为 LIQ HDR）所需的修改。有关构建一套可同时采集最多18只大鼠双瓶选择数据的舔舐检测系统所需的所有 commercially sold（商业采购）和定制3D打印部件的清单，请参见材料表。3D打印用的.stl文件及操作说明可在作者网站获取（www.ejgloverlab.com/3dprints）。

  1. 设置电容式传感器单元
    注意：每个 LIQ HDR 系统包含三个电容式传感器单元，可同时采集 36 个瓶子的舔水数据，对应 18 只单笼饲养的大鼠。每个传感器单元由一块差分 I2C 通信 breakout 板和一块 12 键电容式传感器板组成，通过六对颜色编码的 2 针电缆连接至六个独立笼具的舔水检测器（图 2A）。
    1. 准备构建全部三个电容式传感器单元所需的材料（如 图 2B 所示），以及必要的焊接工具。
    2. 开始构建传感器单元 A 时，将一个 2 针母接头电缆用一段 7 英寸长的红色热缩管包裹，将其红、黑导线末端分别插入传感器板的 #0 和 #1 引脚（图 2C-1），并进行焊接固定（图 2C-2）。确保电缆位于传感器板前方，以便在动物房内从左到右按数字顺序排列笼具时，电缆不会交叉，避免干扰记录（见步骤 3.6 和 图 6）。
    3. 用不同颜色的热缩管包裹其余五根电缆，并按图示焊接到 #2–11 引脚（图 2C-3）。确保所有红色导线焊接到偶数引脚（连接左侧所有瓶子），所有黑色导线焊接到奇数引脚（连接右侧所有瓶子）。
    4. 在所有焊点周围涂上热熔胶以提供保护（图 2C-4）。按数字顺序标记接头，为每个舔水检测器提供唯一标识号（图 2C-4）。
    5. 组装传感器单元 A：使用一根 50 mm 的 4 针电缆将传感器板 A 连接到通信 breakout 板的 EndPoint，再使用一根 100 mm 的 4 针电缆将 EndPoint 连接到 5V-to-3V 电平转换器的 3.3 V 输出端（图 2D-1）。尽管传感器板和通信 breakout 板均有两个相同的 4 针接口，但仍需确保布线完全如图所示（图 2D-1 和 图 2F），以便使用 3D 打印的传感器外壳和推荐的动物房布局（见步骤 3.6 和 图 6）。将传感器单元 A 安装进 3D 打印外壳中（图 2D-2）。轻轻合上顶盖，注意不要压到电平转换器电缆（图 2D-3）。
    6. 通过将跳线从 ADDR 引脚焊接到 3Vo 或 SDA 引脚，修改传感器板 B 和 C 的 I2C 地址（如 图 2E 所示）。
    7. 使用与板 A 相同的顺序，将六根颜色编码的母接头电缆焊接到传感器板 B 和 C 上。用相应的舔水检测器 ID 编号标记每个接头。使用 50 mm 的 4 针电缆将板 B 连接到通信 breakout 板的 MidPoint，板 C 连接到 EndPoint（图 2F）。
    8. 将传感器单元 B 和 C 分别装入其对应的 3D 打印外壳中。使用以太网电缆将三个传感器单元串联连接，完成传感器设置（图 2G）。
  2. 设置微控制器接口
    注意：LIQ HDR 微控制器接口（补充图 1A）与 LIQ HD30 所描述的基本相同，仅有细微修改。以下步骤概述了设置接口所需的流程，其中步骤 3.2.6 和 3.2.8 描述了具体修改。研究人员可参考原始协议及作者 GitHub 页面提供的视频教程，获取更详细的逐步说明30。
    1. 准备构建微控制器接口所需的材料和焊接工具（补充图 1B）。在触摸屏屏蔽板背面（补充图 1C-1），在背光焊盘之间创建一个焊锡跳线（补充图 1C-2）。
    2. 在数据记录屏蔽板背面，切断 CS 引脚的跳线焊盘走线（补充图 1D-1）。在数据记录器正面，用一根短跳线将 CS 引脚焊接到 #7 引脚（补充图 1D-2）。
    3. 安装屏蔽堆叠插针时，先将其堆叠到触摸屏屏蔽板背面（补充图 1E-1）。将数据记录器堆叠到触摸屏上，用胶带固定，然后将所有插针焊接到数据记录器上（补充图 1E-2）。随后取下触摸屏。
    4. 将剩余的 2×3 插针堆叠到微控制器上（补充图 1F-1），然后将数据记录器堆叠到微控制器上，再焊接插针（补充图 1F-2）。
    5. 将纽扣电池插入数据记录器（补充图 1G-1）。将触摸屏堆叠到数据记录器上（补充图 1G-1）。将 microSD 卡及其适配器插入数据记录器（补充图 1G-2）。
    6. 制作额外的接地线：从一根跳线中剪下一端的公接头，并将末端剥去约 1/4 英寸（补充图 1H-1）。将一段剥皮的实心导线焊接到跳线上，并用热缩管覆盖焊点（补充图 1H-2）。
    7. 将 4 针跳线和额外的接地线插入微控制器（黑色 - GND，红色 - 5V，黄色 - #21 引脚，蓝色 - #20 引脚，补充图 1I-1）。用热熔胶固定连接（补充图 1I-2）。可选：用热缩管包裹跳线（补充图 1I-2）。
    8. 将完全组装好的微控制器接口装入 3D 打印外壳中，4 针跳线和接地线从顶部开口穿出（补充图 1J）。
    9. 按照原始协议安装微控制器接口的软件30。
  3. 构建 LIQ HDR 舔水检测器
    注意：用于固定瓶子的定制 3D 打印件专为标准啮齿类饮水瓶设计，适配 8 mm 吸管直径（见 材料表，图 3A）。该瓶架可轻松适配类似尺寸的瓶子和吸管，通常无需或仅需少量修改。
    1. 准备构建一个舔水检测器所需的材料、3D 打印件和焊接工具（如 图 3B 所示）。注意每个 LIQ HDR 系统最多可支持 18 个舔水检测器，对应 36 个瓶子。
    2. 为延长公接头电缆，将其两端及延长用的黑色和红色导线均剥去约 1/4 英寸长度（图 3C-1）。
    3. 将延长导线焊接到接头电缆上（图 3C-2），并用热缩管覆盖焊点（图 3C-3）。用与传感器单元上对应母接头电缆颜色匹配的热缩管包裹公接头电缆（图 3C-4）。
    4. 为与传感器板布线一致（图 2），将红色和黑色导线分别穿过瓶架左侧和右侧的内部电缆通道（图 3D-1）。
    5. 将每根导线焊接到 1 ¾ 英寸导电铜箔的末端（图 3D-2），然后将铜箔对折（图 3D-3）。
    6. 撕去铜箔背胶，使用镊子小心将其置入吸管支架内部（图 3E-1），然后牢固粘贴到吸管支架内壁上（图 3E-2）。确保铜箔的焊接面粘贴在靠近瓶架中线的一侧（如图所示，图 3E-2）。将吸管穿过支架，压紧铜箔并固定支架。
    7. 为加固粘性较差且易脱落的铜箔焊接面，在焊点处涂上一滴热熔胶（图 3E-3）。涂抹胶水以覆盖铜箔及 3D 打印件上相邻的裸露部分（图 3E-4）。
    8. 将电缆穿过电缆保护套的内部通道（图 3F）。为使用推荐的动物房布局（见步骤 3.6 和 图 6），请为每个舔水检测器选择合适的电缆保护套（左向或右向）。“注意：当前设置中以蓝色或紫色电缆表示的舔水检测器 5–6、11–12 和 17–18 需使用左向电缆保护套（图 4D-1），其余所有舔水检测器需使用右向电缆保护套（图 4D-2）。”
    9. 安装电缆夹时，先将一根导线放入电缆夹一半的凹槽中（图 3G-1），再将另一半覆盖在第二根导线上，然后用螺母拧紧两半（图 3G-2）。
    10. 用相应的舔水检测器 ID 编号标记公接头（图 3H）。重复上述步骤，直至完成全部 18 个舔水检测器的制作。
  4. 安装 LIQ HDR 舔水检测器
    注意：LIQ HDR 设计用于安装在带有金属丝网顶的标准鞋盒式大鼠笼具上（图 4A-1）。
    1. 在金属丝网笼顶上找到两对中心间距约为 75 mm 的金属杆，以适配瓶架。使用钳子轻微撑开吸管孔周围的金属杆，并用绝缘胶带包裹这些金属杆，防止吸管与笼顶之间发生金属接触（图 4A-2）。
      注意：尽管绝缘胶带无法被大鼠接触，因此不易被啃咬，但仍建议在研究结束时丢弃，且不得在不同研究间重复使用。
    2. 使用两组 M5 螺丝和螺母将舔水检测器和 1/8 英寸厚的激光切割亚克力板安装到笼顶上（图 4B）。确保舔水检测器和亚克力板上的吸管孔对齐，且吸管不与笼顶任何部分接触。
    3. 将电缆夹固定在金属丝网笼顶最外侧的金属杆（直径约 4 mm）上（图 4C）。根据需要调整电缆夹，确保笼顶与笼底紧密贴合，且电缆不受过度拉扯或弯曲。确保每个舔水检测器使用正确的电缆保护套（图 4D，参见步骤 3.8.8）。
    4. 根据需要调整吸管，使仅约 2 cm 的吸管从瓶盖伸出（图 4E-1）。安装瓶子时，将吸管穿过瓶架的吸管支架直至无法再推进（图 4E-2）。仅吸管最尖端应略微突出于亚克力板之外（图 4E-3）。必须确保吸管其他部分完全被遮蔽，以避免因非摄食行为（如大鼠触碰或玩耍吸管）导致的假阳性舔水信号。滤膜盖应能紧密覆盖在金属丝网笼顶和电缆夹上，且不干扰电缆本身（图 4F）。
      注意：对于需要吸管更深入笼内的实验（例如测量幼年大鼠饮水行为，因其可能难以触及较短吸管），可使用更厚的亚克力板或叠加多层 1/8 英寸板，以完全封闭较长的吸管。
  5. 安装和使用吸管阻断器
    注意：吸管阻断器（图 5A）设计用于在更换瓶子期间限制大鼠接触吸管，并确保每次饮水会话开始时舔水检测器的校准准确。
    1. 准备一个吸管阻断器所需的 3D 打印部件及一个 M5 螺丝、螺母和垫圈（如 图 5B 所示）。
    2. 将 SIPPER_Gear 插入 SIPPER_Base 中（图 5C-1）。确保 SIPPER_Gear 的方向与 3D 渲染图中的插入图完全一致。将 SIPPER_Worm 插入 SIPPER_Base 顶部的开口中，边插入边顺时针旋转，直至其头部与基座齐平（图 5C-2）。
    3. 从基座底部将 SIPPER_Nut 拧到 Worm 末端（图 5C-3）。使用镊子在旋转 Worm 旋钮的同时拧紧螺母。将 SIPPER_Blockers 的圆形细颈插入 Gear 的槽口中（图 5C-4）。
    4. 使用 M5 螺丝组件将组装好的吸管阻断器安装到笼顶上（图 5D）。确保两个吸管阻断器与吸管孔对齐。
    5. 为阻断吸管访问，顺时针旋转 Worm 旋钮，降低阻断器，直至完全覆盖吸管孔（图 5E）。
    6. 为允许访问吸管，逆时针旋转旋钮，使阻断器升至垂直于笼顶的位置（图 5F-1）。手动向上拉动每个阻断臂，使头部刚好位于金属丝网笼顶下方。将阻断器旋转 90°，使头部与笼顶金属杆平行，臂部锁定到位（图 5F-2）。继续逆时针旋转旋钮，直至两个阻断器完全升至笼顶上方（图 5F-3），吸管完全可接触（图 5F-4）。
  6. 在动物房中使用 LIQ HDR 系统
    注意：以下动物房设置经过优化，可使用单个微控制器接口连接 18 个标准鞋盒式大鼠笼具，实现双瓶选择饮水实验。所有电子组件（包括微控制器接口、传感器单元及各类电缆）均固定在承载笼具的壁挂式金属丝网架上（图 6A）。根据动物设施和用户需求，可能需要进行部分修改。
    1. 使用定制的 3D 打印安装螺丝将每个传感器单元固定在动物房架子上（图 6B）。确保每个传感器单元安装在对应黄色舔水检测器的笼具正下方，以避免不必要的电缆张力（图 6A）。
    2. 排列并固定每根母接头电缆，确保它们互不重叠，且焊点处无过度弯曲，以免影响舔水检测效果（图 6B）。若使用金属杆架子，可通过扎带将接头电缆分别固定在架子的不同金属杆上实现。
    3. 使用相同的 3D 打印安装螺丝将微控制器接口安装在传感器单元 A 旁边，并将其 4 针接头插入连接至传感器单元 A 的 5V-to-3V 电平转换器的 5 V 输入端口（图 6C）。
    4. 使用绝缘胶带将额外的接地线固定到接地源（如金属架子）上（图 6D）。
    5. 根据已安装舔水检测器的颜色和 ID 编号排列每个笼具（参照 图 6A 的布局），以最小化电缆重叠和张力。
    6. 将所有舔水检测器的公接头电缆牢固连接到对应的传感器母接头电缆上（图 6E）。接通电源以启动微控制器接口（图 6F）。
    7. 在主图形用户界面（GUI）页面（图 6G）上，点击 设置符号 打开设置页面。用户可根据动物房作息时间调整“灯开”和“灯关”时间，确保在暗周期开始时界面显示自动变暗（图 6H-1）。
    8. 点击 编辑传感器设置 （图 6H-1）将触碰阈值调整为 8，释放阈值调整为 2，此设置在当前系统下可实现最稳定的舔水检测（图 6H-2）。但若对当前系统进行任何修改，用户可能需要尝试不同参数。
    9. 若数据采集周期仅为 24 小时或更短，请取消勾选 自动校准（图 6H-2）。

4. 使用舔舐检测法进行双瓶选择家庭笼具饮水的每日操作流程

  1. 按照第2步中所述的标准双瓶选择实验步骤进行操作，但需进行以下修改。
  2. 在周一、周三和周五，于安装MWF瓶之前，使用饮水管阻塞器覆盖所有笼子的饮水管开口（参见步骤3.5.5及 图5E).
  3. 在记录之前，选择正确的 实验部分 在主图形用户界面页面上，即当天乙醇瓶所在的一侧（图6G).
  4. 安装所有MWF瓶后，轻触 开始！ 在主页上（图6G) 开始校准传感器，建议用户此时远离系统，并确保大鼠未舔舐饮水管（图6I-1）。校准过程需要几秒钟完成，完成后系统将进入主记录页面，显示每个舔瓶计数器上每只瓶子的累积舔水次数。图6I-2).
  5. 将所有饮水管阻隔器抬升至笼顶上方，以允许动物接触饮水管（参见步骤 3.5.6 及 图5F），并按照所述方法轻轻放回所有滤膜盖（参见步骤 3.4.4 和 图4F).
  6. 轻敲 刷新 以更新屏幕上的舔舐次数，屏幕不会自动实时更新（图 6I-2).
  7. 每周二、周四和周六，轻触 保存 & 退出 停止录制并返回主页面（图 6I-2）后，再移除MWF瓶。
  8. 为传输数据而取出SD卡时，轻触 弹出SD卡 在拔下 SD 卡之前（图6G）。将SD卡插入任意计算机，并复制/粘贴以瓶子开启日期命名的.csv数据文件到该计算机中（图 6K）。要为下一次录制重新安装SD卡，请将卡插入接口并轻触 安装SD (图6J).
    注意：我们建议每天备份数据文件。
  9. 建议在符合动物模型和动物使用方案的前提下，将体重测量频率限制为每周一次，并在指定换笼日进行，以尽量减少对舔舐监测仪和传感器的不必要干扰。移动笼子前，应先拔下所有雄性舔舐监测仪的电缆与相应的雌性传感器电缆的连接。每次称重后，立即将大鼠放回清洁的笼子中。必要时，将舔舐监测仪转移至新的笼盖，并重新将每个舔舐监测仪与对应的传感器连接。
  10. 对于测试干预措施（例如药物注射）对乙醇摄入量和饮酒微结构影响的实验，应尽可能在饮酒阶段开始前实施干预。当无法做到时，研究人员可通过轻敲来中断舔舐检测 暂停 (图6I-2）并通过点击恢复数据采集 简历 干预结束后。我们建议在每次饮酒阶段的暂停期间收集瓶子的重量，以记录干预前后乙醇摄入量的变化，同时计入在移开笼盖以接触动物时可能发生的液体洒漏。
  11. 研究结束时，所有笼内组件在用于新动物之前均应彻底消毒，以限制动物间污染物的传播。建议使用70% EtOH溶液轻轻喷洒并擦拭舔舐测量仪，注意避免损坏内部电子元件。吸管阻断器和亚克力板可用温肥皂水清洗。

5. 数据分析

  1. 在评估因变量之前，需校正每日更换瓶子时不可避免发生的液体洒漏所导致的摄入数据误差。为此，计算在整个研究期间，洒漏对照笼中 EtOH 和 H2O 瓶子重量变化的平均值。
  2. 排除每个瓶子重量变化中大于平均值两个标准差以上的数值。排除这些异常值后，从含动物笼子中 EtOH 和 H2O 瓶子的重量变化数据中减去上述计算所得的平均洒漏量。通过减去该数值，研究人员可确保在摄入量测量中未计入因溶液洒漏造成的平均损失。减去平均洒漏量后，某些动物在某些时间点可能出现负值，应将其转换为零，并解释为该溶液无任何摄入。
  3. 双瓶选择饮酒实验的主要因变量为 EtOH 摄入量（g/kg）和偏好度（%）。根据 EtOH 瓶重量变化（g）计算摄入量，并通过以下步骤将其标准化为体重（kg）：
    1. 使用以下公式将瓶子重量变化（g）转换为体积变化（mL）：
      体积变化计算公式示意图；通过重量变化和乙醇密度系数计算。
      纯乙醇的密度为 0.789 g/mL。因此，20% EtOH 的贡献密度为 0.1578 g/mL。H2O 的密度为 1 g/mL，因此 80% H2O 的贡献密度为 0.80 g/mL。因此，每毫升 20%（v/v）EtOH 溶液由 0.1578（EtOH）+ 0.80（H2O）= 0.9578 g/mL 构成。因此，使用 20%（v/v）EtOH 浓度时的最终公式为：
      体积变化计算公式；重量与体积之间的关系；科学分析。
    2. 使用以下公式计算乙醇摄入剂量。使用与摄入数据同期测得的动物体重，以计算按体重标准化的乙醇摄入量（g/kg）。
      剂量计算公式；基于浓度、体积和体重的给药剂量方程。
    3. 使用以下公式计算偏好度：
      偏好度计算公式；通过乙醇和水的体积计算百分比。
  4. 与小鼠版本类似30，LIQ HDR 可捕获多种饮酒微结构变量，包括舔饮持续时间、饮次次数、饮次持续时间、每次饮次中的舔饮次数以及每次饮次中的舔饮持续时间（图 6K）。一次饮次定义为：以1秒内完成至少3次舔饮开始，并在连续3秒无进一步舔饮后结束。这些数据可用于计算平均单次舔饮持续时间、平均单次饮次持续时间、每次饮次平均舔饮次数、平均舔饮频率、估计的舔间间隔以及估计的饮次间间隔。
    注：微控制器接口以1分钟分辨率在 .csv 文件中提供这些微结构数据（图 6K）。研究人员可使用原始 LIQ HD 方案配套提供的分析应用程序30 或其偏好的后期处理平台，根据研究需求整理和汇总数据。微结构数据通常在整个24小时周期内进行总和，以在宏观层面比较平均差异，或按30分钟至1小时的时间段分组，以分析光-暗周期中的饮酒模式变化。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

标准间歇性双瓶选择法在家庭笼具中饮酒数据
采用标准操作流程（图7A），研究人员可记录24小时的摄入量（图7B-D），并在饮酒阶段开始后不久称量瓶子重量，从而获得类似暴饮的饮酒数据（图7E-F）。通过计算乙醇摄入量相对于水摄入量的比值，研究人员还可获得所有测量时间点的偏好数据（图7D、F）。如图7C所示，大鼠在双瓶选择实验的最初几天内通常表现出乙醇摄入量逐渐上升的阶段。随后进入平台期，摄入量保持相对稳定。尽管该模式在雄性大鼠中 consistently 被观察到7,32,33,34,35,36，但在雌性大鼠中并不总是出现。相反，一些研究报道雌性大鼠在整个实验期间乙醇摄入水平保持稳定37,38。此外，部分研究表明，随着可获取乙醇时间的延长，摄入量可能进一步上升36,39。个体间的每日摄入量可能存在显著差异。然而，对于酒精研究中最常用的品系，其平均每日摄入量已有明确特征描述，可用于分析群体数据时的成功参考标准7,8,33,34,35,39。

如图7E所示，许多大鼠在饮酒阶段开始后不久即摄入其每日大部分乙醇量8,33。这种类似暴饮的乙醇摄入模式通常伴随着对乙醇而非水的显著偏好（图7F）。然而，研究人员不应对此感到意外：24小时内的偏好可能并未超过50%。对于远交系或对酒精无偏好的啮齿类品系，以及仅限于相对较短的双瓶选择获取期的研究而言，这一情况尤为常见7,32,33,35,37。

LIQ HDR 在双瓶选择饮酒微结构分析中的验证
将LIQ HDR系统加入标准的大鼠双瓶选择实验范式，可使研究人员利用采集到的饮水数据准确且精确地预测摄入量。这一点通过所检测到的累积舔舐次数与乙醇瓶（EtOH）和水瓶重量变化之间的强显著相关性得以证实（R2 = 0.7789，F(1,113) = 398.1, p < 0.0001）和 H2O型瓶（R2 = 0.7910，F(1,117) = 442.9，p < 0.0001）持续24小时（图8A）。对于大鼠接受两个装有 H 的瓶子的日子，情况也是如此2O (R2 = 0.8875，F(1,188) = 1484, p < 0.0001; 图8B).

LIQ HDR 还能够以高时间分辨率精确分析饮酒模式，这是标准的双瓶选择范式所无法实现的。利用该方法，研究人员有机会考察不同溶液之间、光照周期内、不同性别之间、不同药物处理组之间的饮酒模式差异等。举例而言，将平均舔舐次数按30分钟区间分段，可便于分析24小时内的平均饮酒模式。正如预期，该分析显示乙醇（EtOH）和水（H2O 在黑暗周期（大鼠通常处于清醒状态）期间高于光照周期（大鼠通常处于睡眠状态）期间图8C）。采用类似方法，研究人员可探究饮酒模式的组间差异。例如，通过比较雄性和雌性大鼠对乙醇（EtOH）的平均舔舐次数，可分析其饮酒微结构的差异。图8D）或水（图8E）在24小时内的变化。为了研究前置饮酒（front-loading）和/或类似暴饮的行为，研究者可提高分析的时间分辨率，采用更小的时间分段窗口，重点分析实验开始后短时间内发生的饮酒行为，并以此汇总数据。这种方法使研究者能够在无需在24小时内多次收集瓶子重量的情况下，探究暴饮样饮酒的特定时段。如图所示 图8C （插图）该分析显示，通过在实验开始后30分钟测量瓶重所记录的大部分饮酒行为集中在前5分钟内发生，而非均匀分布于整个30分钟期间。此类数据有助于确定采集血液样本以测定血液乙醇浓度（BEC）的最佳时间点。事实上，在另一独立饮酒日中也观察到了类似的前载式饮酒模式，该次实验以高分辨率记录了短至15分钟时间窗口内的饮酒行为。图8F). 本阶段记录的平均舔舐次数能够可靠地预测瓶子重量的变化（EtOH：R2 = 0.6316，F(1,10) = 17.15，p = 0.0020；H2O: R2 = 0.8601，F(1,10) = 61.47，p < 0.0001; 图8G）。此外，实验开始15分钟后采集的血样中的BEC与检测到的舔舐次数具有良好的相关性（R2 = 0.4327，F(1,10) = 7.627，p = 0.0201； 图8H即使摄入相对较低水平的乙醇（EtOH）也是如此。

LIQ HDR 可捕获多种饮酒微结构指标，这些指标在饮酒过程中实时检测并计算，以类似舔水检测的方式按每分钟时间段进行存储图6K这些措施在步骤5.4中简要说明，且此前已有定义。30研究人员可以对个体饮酒微结构的变化进行详细分析，并考察饮酒模式在何种程度上导致总体摄入量的差异。例如，我们发现尽管雄性和雌性大鼠的舔舐次数、饮酒事件次数和每次饮酒持续时间相似，图9A- C）饮用饮水时，雌性小鼠的总体摄入量（g/kg）高于雄性（t检验；t=2.882，df=10，p=0.0163； 图9D）。考虑到体重的性二型性，雌性按体重计算的摄入量高于雄性，因此在舔舐次数相同的情况下，这一结果是可预期的。值得注意的是，这与乙醇（EtOH）摄入微结构模式中性别差异的比较形成鲜明对比，后者显示雌性和雄性具有相似的饮酒微结构，且与相似水平的乙醇摄入量相关。图9E- H）。这些数据表明，尽管两性大鼠对水的舔舐量相似，但与雄性相比，雌性大鼠对乙醇（EtOH）的舔舐量较小。综合这些微观结构数据支持了以下观点：在家庭笼环境中，雄性和雌性大鼠可能根据所摄入液体的类型在自主饮酒策略上存在差异。先前的研究也报道过依赖于液体类型的饮水策略上的性别差异。40,41，尽管这些研究中观察到的差异不仅限于饮水量。饮酒史的长短可能影响了各研究之间的差异，因为当前数据集中的双瓶选择饮酒实验仅限于5周，而在之前的研究中则超过了12周。40,41.

啮齿类动物乙醇摄入示意图、带有消耗量图表的实验装置、偏好分析。
图1：双瓶选择法在饲养笼内的饮酒实验。（A）研究人员可采用标准方法，通过测量瓶子重量的变化来计算动物在饲养笼内自发摄入乙醇的量及其对乙醇的偏好性（相对于水）。（B）通过使用LIQ HDR——一种低成本、DIY设计、适用于大鼠的饲养笼内舔水检测系统，研究人员不仅能获得与标准双瓶选择实验相同的数据，还可在整个记录期间获取高分辨率的饮水微结构信息。请点击此处查看该图的放大版本。

微控制器传感器集成示意图与设置。DIY电子设备组装，包含布线和组件。
图2：构建电容式传感器单元。（A）电子元件与接线图。（B）构建一套LIQ HDR系统所需的三个电容式传感器单元的材料。（C）将笼子#1-6的2针母接头电缆焊接到电路板A的引脚#0-11上，并用热熔胶固定焊点。使用彩色热缩管对电缆进行颜色编码，并为每根电缆标注唯一的舔水计ID编号。（D）使用4针电缆（1）将电路板A和5V转3V电平转换器连接至差分I2C通信扩展端点，并将电路板A与通信扩展模块安装在3D打印外壳中（2-3）。（E）通过分别将ADDR引脚与3Vo和SDA引脚用跳线焊接，更改电路板B和C的I2C地址。（F）将2针母接头电缆焊接到传感器电路板B和C上，标注相应的舔水计ID编号，并使用4针电缆将电路板B连接至通信扩展中继点，电路板C连接至端点。（G）将传感器单元B和C分别装入其对应的3D打印外壳中，并使用以太网电缆将所有三个单元串联连接。请点击此处查看此图的放大版本。

使用2针电缆和组件的3D打印电子项目的焊接与组装示意图。
图3：构建LIQ HDR舔水检测仪。（A）笼内组件的3D渲染图。（B）搭建一个双瓶舔水检测仪所需的材料。注意，一套LIQ HDR系统可支持18个双瓶舔水检测仪。（C）使用一对黑色和红色导线延长2针公头连接线的长度，并用热缩管进行颜色编码。（D）将黑色和红色导线分别穿过饮水瓶支架左侧（L）和右侧（R）的开口（1），并将导线末端焊接到铜箔带（2-3）上。（E）将铜箔带粘贴至吸水管支架内壁（1-2），并用热熔胶加固（3-4）。（F）将导线穿过电缆保护套。（G）安装电缆夹。（H）用对应的舔水检测仪编号标记连接器。请点击此处查看该图的放大版本。

动物研究中带有坡度测量装置和数据采集线路的行为学实验装置。
图4：舔舐测量仪的安装。（A）使用电工胶带将金属笼顶饮水口周围的金属杆进行绝缘包裹。（B）使用两组M5螺丝和螺母将舔舐测量仪和亚克力面板安装到笼顶上。（C）将电缆夹固定在金属丝笼顶最外侧的金属杆上。（D）确保每个笼子使用相应的电缆保护套（左侧L或右侧R）。（E）确保饮水瓶吸管仅露出约2 cm（1），这样当瓶子放置在笼子上时（2），只有吸管的最尖端伸出亚克力面板，供大鼠接触。（F）滤膜盖应能套在电缆夹上，且不干扰电缆本身。请点击此处查看该图的放大版本。

吸管装置的组装，包含组件和步骤示意图；包括在笼盖上的安装设置。
图5：吸管阻断器的安装与使用。（A） 吸管阻断器的3D渲染图。（B） 一个吸管阻断器的定制3D打印部件。（C） 组装3D打印部件。（D） 使用M5螺钉+螺母+垫圈将组装好的吸管阻断器安装到笼盖上。（E） 顺时针旋转旋钮以阻断对吸管的接触。（F） 逆时针旋转旋钮以从吸管上移除阻断器（1），抬起阻断器并旋转90°（2），继续逆时针旋转旋钮，直到阻断器完全升至笼盖上方（3-4）。请点击此处查看该图的放大版本。

Animal behavior study setup diagram; drinking monitor; behavioral data results.
图6：动物饲养设施设置与图形用户界面操作。（A） 推荐的动物饲养室设置与布线图 (B) 将每个传感器单元安装到货架上，并将传感器电缆在货架上布置并固定。 (C) 将微控制器接口安装到支架上，并将其4针跳线连接至与传感器单元A相连的5V转3V电平转换器。 (D) 用绝缘胶带固定额外的接地线。 (E) 将传感器电缆连接到相应的舔水计电缆上。 (F) 接通电源以启动微控制器接口。 (G) 图形用户界面的主页面。 (H) 轻敲 设置 调整灯光开关时间以匹配动物房的光照时间表（1），然后轻触 传感器设置 调整大鼠的触碰和释放阈值（2）。 (I) 要记录数据，请选择 乙醇瓶侧面 在主页上, 轻敲 开始！ 校准传感器（1），并开始记录（2）。轻触 刷新 更新屏幕上显示的舔舐次数，然后点击 保存 & 退出 停止记录。 (J) 轻敲 弹出SD卡 在主页面上点击以取出SD卡并传输数据。轻触 安装SD卡 插入SD卡后。 (K) 微控制器界面以1分钟为时间间隔保存微结构数据的代表性原始数据文件截图。 请点击此处以查看此图的放大版本。

饮酒行为分析，24小时/30分钟，液体/乙醇摄入量图，多日偏好图，示意图。
图 7：使用标准程序获取的代表性双瓶选择饮酒数据。 在间歇性进入双瓶选择家庭笼具乙醇饮酒范式中，(A) 大鼠在周一、周三和周五（MWF）提供20%（v/v）乙醇溶液（橙色）和 H2O（蓝色），在周二、周四和周末则提供两瓶 H2O。(B) 每日液体摄入量的测量显示，尽管大鼠在整个研究期间的总液体摄入量（mL）保持相对稳定，(C) 大鼠通常在前几次饮酒阶段表现出乙醇摄入量的逐步上升，之后摄入水平趋于平稳。(D) 这种上升并维持的模式同样反映在对乙醇的偏好上。研究人员还可以捕捉类似暴饮的乙醇摄入行为 (E)，前提是记录饮酒开始后前30-60分钟的瓶子重量。(F) 这通常与对乙醇相对于 H2O 的高偏好相关。阴影误差线表示 ± 标准误（SEM）（雄性 n = 32，雌性 n = 16）。请点击此处查看此图的放大版本。

行为分析图表：总舔舐次数与瓶重、时间的关系；比较水和乙醇的摄入量。
图8：LIQ HDR 能够以高时间分辨率准确捕捉摄入行为。 LIQ HDR 系统的精确性和准确性部分通过以下事实得以验证：在大鼠接受 (A) H2O 和 EtOH 以及 (B) 两个瓶中均为 H2O 的日子里，舔舐次数与瓶重变化之间存在显著的正相关关系。(C) 通过将平均舔舐次数按30分钟区间分段，可以轻松评估在整个24小时饮酒周期内 H2O（蓝色）与 EtOH（橙色）饮用模式的差异。插图对应瓶被打开后前30分钟内（灰色高亮区域）5分钟区间的平均舔舐次数，此阶段大鼠常表现出明显的前置大量摄入行为。组间饮用模式的差异也可采用类似方法进行分析，如 (D) EtOH 和 (E) H2O 的舔舐微结构所示，数据涵盖雄性和雌性大鼠24小时内的表现。(F) 饮用模式也可在较短测试周期内以高时间分辨率进行评估，(G) 在此期间 LIQ HDR 仍能准确追踪摄入量，并 (H) 预测血液乙醇浓度（BEC），即使在相对较低的 EtOH 摄入水平下亦然。阴影误差线表示 ± 标准误（SEM）（每性别 n = 6）。请点击此处查看该图的放大版本。

比较水与乙醇摄入的提琴图；指标：舔舐次数、饮用事件次数、单次饮用时长和摄入量。
图9：代表性饮酒微结构数据。 LIQ HDR 能够捕捉饮酒微结构的多种测量指标，包括（A）舔舐次数、（B）饮用事件次数和（C）单次饮用时长，以及通过瓶重变化测量（D）总水摄入量。（E-H） 同样可获得乙醇摄入的相关指标。对这些指标的组间比较可识别出不同的饮酒模式，如本示例所示，揭示了不同性别在饮用不同溶液时的饮酒策略差异。实线表示中位数，虚线表示四分位数（每性别 n = 6）；非配对 t 检验；*p < 0.05。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：微控制器接口的设置。（A）电子元件及接线图。（B）构建一个LIQ HDR系统所需的微控制器接口材料。（C）在电容式触摸屏蔽板背面，跨接背光焊盘添加一个焊锡跳线。（D）在数据记录屏蔽板背面，切断CS引脚的跳线焊盘走线（1）；将一根跳线从CS引脚焊接到第7号引脚（2）。（E）使用触摸屏蔽板作为基板，将排针焊接到数据记录器上。（F）将剩余的2x4排针堆叠到微控制器上（1），再将数据记录器堆叠到微控制器上，并将排针就地焊好（2）。（G）将纽扣电池插入数据记录器（1），将触摸屏堆叠到数据记录器上，并将SD卡插入数据记录器（2）。（H）制作额外的接地导线时，从跳线一端剪下一个公头连接器，并将导线末端焊接到一段剥皮的实心导线上。（I）将4针跳线和额外的接地导线连接到微控制器（1），并用热熔胶固定（2）。（J）将微控制器接口安装到定制的3D打印外壳中。请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案提供了使用间歇性双瓶选择家庭笼具程序采集乙醇饮用数据的逐步操作说明。该方法实施相对简便，几乎无需额外成本或专用科研设备。通过本文提供的方法构建和实施LIQ HDR——一种用于大鼠的舔舐检测系统——研究人员除可获得摄入量和偏好性的常规测量指标外，还可采集高分辨率的饮水微结构数据。

当前方案中描述的间歇性获取模式被广泛使用，主要原因在于该模式已知能够诱导出比许多其他乙醇获取模式更高的乙醇摄入水平。事实上，先前的研究表明，采用间歇性获取模式的大鼠其平均每日乙醇摄入量高于持续24小时自由获取乙醇的大鼠6,7。然而，根据具体的研究问题或其他实验设计参数，可能需要采用不同的乙醇获取模式。研究人员可以非常容易地修改本方案，以适应不同的获取模式（例如，持续获取、暗期饮酒等），只需简单调整瓶子的开启/关闭时间及操作的天数即可。

尽管双瓶选择饮酒实验是一种相对容易实施的范式，但仍可能出现影响数据采集的问题。因此，实验人员必须每天检查数据，以便及时发现潜在问题。研究人员应特别注意饮水瓶重量出现极大或极小的变化，这可能分别提示吸管漏水或堵塞。及早发现这些问题的迹象，可避免在分析中排除某个受试动物的全部数据。事实上，如果研究人员发现24小时内饮水瓶重量发生剧烈变化（或无变化），简单更换为新瓶子即可帮助确认该瓶子是否应停止使用。基于这些原因，准备额外的瓶子和吸管是明智之举。然而需要注意的是，某些大鼠天生乙醇摄入量极低，例如35。对于某些品系的大鼠尤其如此，详见文献8的综述。因此，若在某项实验中仅有少量动物表现出低水平或无乙醇摄入，研究人员无需担忧。同样，部分动物可能倾向于玩耍吸管或瓶子，从而导致液体洒出。尽管这种情况较为罕见，但如果反复出现与摄取无关的瓶子重量显著变化，则可能需要将该动物从实验中剔除。

我们详细的分步操作方案展示了在大鼠中实施和使用LIQ HDR系统的简便性。即使研究人员此前不具备微控制器电子学或编程方面的任何知识或技能，也可以轻松地将该系统根据实验需求进行调整，通常无需或仅需极少修改。我们的代表性数据进一步证明了该系统在大鼠笼内饮水研究中的成功应用，并展示了其以高时间分辨率捕捉多种饮水微结构参数的强大能力。相较于其用于小鼠的前代系统30，LIQ HDR在设计上进行了多项改进。这些改进不仅是为了成功适配大鼠使用所必需，同时也旨在提升系统的功能性和用户体验。笼内组件，包括3D打印的水瓶架、吸管阻断器和电子元件，均已移至笼顶，以防止动物啃咬，从而避免频繁且严重的数据丢失和硬件损坏。增加的激光切割丙烯酸板进一步有助于保护这些易损部件。除丙烯酸板（其材质与标准鞋盒式大鼠笼相同）外，所有其他LIQ HDR组件在笼内均无法被动物接触，或仅在更换水瓶的短暂过程中可接触。该设计最大限度地减少了设备部件被破坏的可能性，以及动物误食非食物物品带来的风险。与LIQ HD设计中相对费力的定制水瓶不同，LIQ HDR的3D打印水瓶架设计兼容市售的标准啮齿类动物饮水瓶。水瓶安装在笼顶，大鼠接触方式与常规饲养管理中的饮水瓶使用方式基本相同。吸管阻断器的加入是一种简单而有效的解决方案，可提高系统可靠性，防止宝贵数据的丢失——若无此阻断器，在通过Arduino界面启动数据采集前发生的饮水行为，或大鼠在日常校准期间与吸管互动所导致的错误舔舐记录，均可能造成数据损失。由于大鼠笼尺寸明显更大，需将原始硬件设计按比例放大，但使用过长的电缆可能因干扰而影响电容感应的灵敏度和准确性，同时也会损害串联传感器板与Arduino接口之间I2C通信的完整性。我们通过采用差分式I2C通信系统，利用以太网电缆实现超远距离、近乎无损的信号传输，从而规避了这一问题。笼内组件所用材料便于在使用间隙进行清洁和消毒。舔舐传感器可用70%乙醇溶液喷洒并擦拭，但需注意确保导电铜箔等电子元件保持完好。与动物直接接触的非电气设备，如吸管阻断器和丙烯酸板，可用温肥皂水彻底清洗。

任何舔舐检测系统的可靠性和有效性都依赖于正确的构建与安装，以及充分的测试、仔细的错误监控和有效的故障排除。所有自制组件都需要熟练且谨慎地制作和组装，其中涉及焊接的步骤尤其重要，初学者可能需要进行练习才能掌握。无论何种情况，在实际实验使用前，都必须对所有舔舐检测装置进行充分测试。如果系统需要根据特定实验需求进行修改，则可能需要进一步微调传感器设置（例如触碰和释放阈值），以实现准确的舔舐检测。对于首次使用者，我们建议先开展一项简短的小样本预实验，使用一种高度适口的溶液，以诱导较高的饮水水平。可通过观察传感器板上LED灯在每次检测到舔舐时的闪烁情况，实时验证舔舐检测是否正常工作。舔舐次数与瓶重变化之间应存在强效、显著且一致的相关性，该相关性可作为软硬件系统正确设置的基准。即使系统设置已最终确定，我们也建议在实验开始当天，先让大鼠接受两瓶水的处理，以排查可能在实验初期显现的设备问题。此外，在与换笼相关的给水日测试舔舐检测器功能也可能具有优势，因为此过程需要将舔舐检测器从传感器上断开并重新连接。个别舔舐检测器或传感器的随机故障会导致明显异常的数据（例如，尽管瓶重发生显著变化，但检测到的舔舐次数极少或为零），且该问题持续出现在同一检测器上，提示存在有缺陷的组件。我们建议预先为舔舐检测系统的每个部件准备额外的备用组件，以便必要时能够快速更换。最后，必须特别强调确保传感器电缆不相互重叠或过度弯折的重要性。若未做到这一点，可能导致随机出现的舔舐检测不良现象，表现为在瓶重发生一定变化时舔舐次数异常偏低，或舔舐持续时间极长（接近每分钟数据箱的60,000毫秒），甚至跨越数分钟或数小时。然而，在采用标准方法或配备舔舐检测器的方法、对多只动物连续多天进行24小时数据采集的研究中，少量数据丢失是不可避免的。研究人员可在数据分析时，针对极少数饮水会话中瓶重和/或舔舐次数明显不能反映实际摄入量的情况（如吸管堵塞、校准错误等），剔除这些异常数据。在此类情况下，可用该受试个体在整个研究期间对应指标（如摄入量（g/kg）、舔舐次数等）的平均值替代缺失值。此外，也可采用混合效应方差分析（mixed-effects ANOVA）作为处理缺失数据点的替代方法。

双瓶选择饮酒范式的一个优势在于乙醇摄入的自愿性。这具有良好的表面效度，特别是考虑到已有研究发现，实验者给予的酒精与自愿自我摄入的酒精对大脑功能和行为所产生的影响存在显著差异42。此外，该范式的自愿特性使研究人员能够捕捉到个体在摄入量上的差异，类似于人类中观察到的酒精偏好和饮酒模式的变异性。这些个体差异为研究人员提供了有力的机会，将摄入量（摄入量和/或摄入模式）与所观察到的病理效应程度进行相关性分析。

然而，应考虑到双瓶家庭笼具饮酒范式存在一些局限性。例如，尽管个体间乙醇摄入量的差异在某些实验中可能具有优势，但在另一些实验中可能成为劣势，尤其是在需要保持一致的醉酒程度或乙醇暴露水平时。这一点在研究慢性乙醇暴露所导致的依赖性和戒断后果的实验中尤为明显。重要的是，即使大鼠长期接触乙醇，双瓶选择饮酒范式也不被视为依赖性模型。因此，在缺乏伴随戒断症状的情况下，研究人员在将长期乙醇摄入的后果解释为依赖性和/或戒断效应时应保持谨慎。事实上，即使并非完全确定，也有可能在双瓶选择实验过程中，摄入相对大量乙醇的大鼠表现出戒断症状，而那些在特定24小时时间段内总摄入量较低的大鼠则未表现出类似的依赖迹象。饮酒模式在此考量中也可能发挥重要作用，因为在24小时内摄入相同总量乙醇的两只动物，其醉酒程度（即血液乙醇浓度，BEC）可能因摄入模式的不同而存在显著差异22。这凸显了在双瓶选择实验中使用液体摄入高分辨率记录（LIQ HDR）技术的优势，因为它能够轻易识别出以较快速度（即“大口吞饮”）摄入特定剂量乙醇的大鼠，与以较慢速度（即“小口啜饮”）摄入相同剂量的大鼠之间的差异。尽管这种模式可能不利于研究固定剂量乙醇效应的实验，但检测特定实验干预后饮酒模式的变化（例如，暴饮发作减少）具有重要的转化价值，这与临床上日益采用的减害策略相一致。最后，在家庭笼具饮酒范式（包括本文所述范式）中，动物无需付出努力即可获得乙醇。因此，该范式的应用仅限于单独分析饮酒行为本身，而在研究人员希望考察酒精寻求行为（酒精使用障碍[AUD]的重要特征之一）时，则更倾向于采用操作式实验方法。

综上所述，本文所述方案为研究人员提供了在大鼠家庭笼环境中测量乙醇摄入量所需的全部信息和资源。我们提供了分辨率相对较低和较高的多种方法选择，使研究人员能够灵活地选用最符合其研究需求的方法。

披露

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所有作者均声明不存在利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢 Joseph Pitock 和 Katie Przybysz 博士在 LIQ HDR 方法开发过程中提供的技术协助。我们还感谢 Nicholas Petersen 和 Marie Doyle 博士在 LIQ HDR 开发期间参与的许多有益讨论。本研究由美国国立卫生研究院下属的国家酒精滥用与酒精中毒研究所资助（项目编号：P50 AA022538 和 R01 AA029130，授予 EJG）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
市售可得组件数量
12键电容式触摸传感器扩展板（MPR121）Adafruit19823
2针电缆配对（JST XH 2.5mm间距）Adafruit487218
4针面包板跳线（Qwiic）SparkFunPRT-179121
4针电缆（100mm Qwiic）SparkFunPRT-172591
4针电缆（50mm Qwiic）SparkFunPRT-172603
5V转3V电平转换扩展板Adafruit56371
电容式触摸扩展板（2.8英寸）Adafruit19471
导电铜箔胶带（1/4英寸）DigiKey4393-CFT-1/4-ND1
数据记录扩展板Adafruit11411
差分I2C通信扩展套件（QwiicBus）SparkFunKIT-172501
绝缘胶带DigiKey3M156004-ND1
热缩管（3/16英寸，多种颜色）Cable Ties and MoreHS357-S106
热缩管套件（4英寸，黑色）Jameco20959631
锂纽扣电池（3V，12.5mm）DigiKey1908-CR1220JAUCHSB-ND1
M5平垫圈Grainger54FN661
M5六角螺母Grainger6CA721
M5机螺钉（12mm）Grainger6GU881
M5机螺钉（25mm）Grainger 6GU912
公对公跳线Adafruit19571
微控制器板（Arduino Mega 2560 Rev3）DigiKey1050-1018-ND1
PETG线材（2.85mm，银色）MatterHackersM-DDH-UZR22
PLA线材（2.85mm，黑色）MatterHackersM-SEW-RUAW2
PLA线材（2.85mm，银色）MatterHackersM-66P-6CLE1
电源适配器（直流9V 1A）Newegg9SIBPPKJYR59911
SD/microSD存储卡（8GB）Adafruit12941
扩展板堆叠排针Adafruit851
实心导线（22AWG，红色）Adafruit2881
绞合导线（22AWG，黑色）Adafruit29761
绞合导线（22AWG，红色）Adafruit30681
带钢珠的旋盖式饮水管Alternative DesignTCCN8.5-ST2.5SB38
水瓶（8盎司）Alternative DesignWB8FS38
定制3D打印组件数量
3D打印Arduino外壳底座N/AARDUINO_Bottom.stl1
3D打印Arduino外壳顶盖N/AARDUINO_Top.stl1
3D打印电缆夹左件N/ACLIP_L.stl18
3D打印电缆夹螺母N/ACLIP_Nut.stl18
3D打印电缆夹右件N/ACLIP_R.stl18
3D打印舔舐测量仪瓶架N/ALICKOMETER_Bottle Holder.stl19
3D打印舔舐测量仪电缆保护左件N/ALICKOMETER_Cable Protector_L.stl6
3D打印舔舐测量仪电缆保护右件N/ALICKOMETER_Cable Protector_R.stl12
3D打印舔舐测量仪字母标识N/ALICKOMETER_Letters.stl19
3D打印安装螺钉N/AMount Screw.stl4
3D打印传感器外壳A底座N/ASENSOR_A_Bottom.stl1
3D打印传感器外壳A顶盖N/ASENSOR_A_Top.stl1
3D打印传感器外壳B底座N/ASENSOR_B_Bottom.stl1
3D打印传感器外壳B顶盖N/ASENSOR_B_Top.stl1
3D打印传感器外壳C底座N/ASENSOR_C_Bottom.stl1
3D打印传感器外壳C顶盖N/ASENSOR_B_Top.stl1
3D打印传感器外壳字母标识N/ASENSOR_Letters.stl1
3D打印饮水管阻挡器N/ASIPPER_Blocker.stl36
3D打印饮水管阻挡器底座N/ASIPPER_Base.stl18
3D打印饮水管阻挡器齿轮N/ASIPPER_Gear.stl18
3D打印饮水管阻挡器螺母N/ASIPPER_Nut.stl18
3D打印饮水管阻挡器蜗杆N/ASIPPER_Worm.stl18
激光切割舔舐测量仪亚克力面板N/ALICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf19

参考文献

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