方法文章

用于研究体外宿主-病原体相互作用的器官型组织模型系统

DOI：

10.3791/67487

⸱

2025年3月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oral Sciences Research Group, Glasgow Dental School, School of Medicine, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, 2Glasgow Biofilm Research Network, 3Department of Restorative Dental Sciences, College of Dentistry, Jouf University, 4Department of Biological and Biomedical Sciences, Glasgow Caledonian University, 5Safeguarding Health through Infection Prevention Research Group, Glasgow Caledonian University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案概述了器官型组织模型在 体外研究宿主-病原体相互作用的应用。具体来说，所描述的模型系统在口腔健康与疾病的背景下使用暴露于与生物膜（牙菌斑）相关的微生物的多层口腔上皮。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在 体外 概括上皮或粘膜屏障的宿主-病原体界面对于感染生物学家来说仍然是一个具有挑战性的前景。虽然内部培养的 2D 上皮单层缺乏 体内情况的 真实表示，但由于其成本和实用性，市售的组织模型经常被忽视。但是，通过仔细规划，此类模型为大量不同的应用程序提供了可重现的平台。在这里，我们报告了上皮模型的使用，这些模型可用于各种实验目的，以研究各种生态位（如口腔、皮肤和阴道粘膜）中的宿主-病原体相互作用。从简单的浮游细胞到复杂的生物膜共培养，上皮模型用于评估微生物的粘附和侵袭，并在转录和/或蛋白质水平上评估宿主反应，并可以使用不同的组学方法进行更详细的分析。此外，这些生物系统可以用作更准确的测试台，用于评估体外复杂宿主病原体 微环境中的常规和新型抗菌活性。此处描述的协议记录了模型在到达时如何处理并在实验室中准备用于与生物膜群落共培养刺激。这些方法详细说明了如何从模型系统获得实验输出，包括组织处理、共培养设置和数据生成。这些实验包括通过单重和多重 qPCR 分析进行宿主基因表达，以及使用 ELISA 进行炎症蛋白检测。总之，上皮模型为简单或复杂的宿主-病原体相互作用的临床前研究提供了有用的 体外 系统。

引言

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体外模型系统为研究宿主-病原体相互作用提供了极好的测试平台。这些器官型系统旨在概括容易受到微生物扰动的不同生态位的微环境。已经发表了许多研究文章，利用 EpiSkin（前身为 SkinEthic）组织模型来评估口腔 1,2,3,4,5、皮肤屏障 6、7、8、9、10、11 和阴道粘膜 5,12,13 中的宿主-病原体相互作用，其中包括14,15 人。与依赖于使用暴露于微生物的单层上皮细胞系的"二维"或"2D"细胞培养不同，这些市售模型由在气液界面生长的多层分化细胞组成。尽管 2D 培养系统更便宜且通常被认为更具可重复性，但在与微生物一起培养时，细胞容易受到细胞损伤，这并不总是准确代表体内的上皮或粘膜屏障 16,17。

最近的证据表明，"三维"或"3D"培养技术在各种科学学科中越来越受欢迎，包括癌症科学、干细胞研究和药物发现16,18。在感染生物学的背景下，3D 组织模型可用于研究体外受控微环境中上皮或粘膜屏障界面处的宿主-细菌、真菌或混合物种相互作用。这些模型对 2D 培养系统具有许多优势，允许评估病原生物或复杂生物膜群落的组织定植和/或侵袭17，并在多组分水平上评估不同生物标志物的宿主反应，其中 2D 模型有时受到其转录或蛋白质组学谱的限制 16,17,18.归根结底，这种 3D 系统的临床前应用非常广泛，提供了重要的探索性数据，可以用于体内模型或临床研究。

在口腔健康和疾病的背景下，了解口腔粘膜表面涉及的炎症途径对临床医生很重要，因为这可能会指导治疗方式。先前的研究表明，"健康相关"生物膜可以引起最小的炎症反应 3,19,20,21。这可能是由于与口腔健康相关的微生物生物负荷较低，或者是由于链球菌属被广泛认为具有免疫调节作用的生物膜组成22,23。另一方面，由疾病相关微生物（如核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌）组成的生物膜本质上是促炎的 3,20,24,25,26,27。Mountcastle 等人在 2020 年的一项综述描述了当时存在的口腔微环境的所有相关共培养模型17。尽管这样的器官型模型很多，而且自28,29 年以来生产了几个，但创建此类 3D 模型仍然存在许多具有挑战性的障碍。仅举几例，这些模型需要大量优化，并且生产起来需要高度劳动和资源;除非仔细控制，否则可重复性也可能高度可变16,17。市售模型规避了这些问题，为研究口腔内和人体其他生态位的宿主-病原体相互作用提供了平台。

总而言之，目前的方案旨在概述器官型组织模型在口腔健康和疾病背景下研究 体外 宿主-病原体相互作用的应用。具体来说，所描述的模型系统使用多层市售口腔上皮暴露于代表口腔炎症性疾病牙龈炎的确定生物膜群落。

方案

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以下方案涉及制备代表牙龈炎的多物种生物膜，总共包含 7 种 （spp.）7,30。包括三种链球菌属、碎链球菌 （NCTC 12261）、中间链球菌 （DSM 20753） 和口腔链球菌 （NTCC 11427） 以模拟口腔健康，充当唾液表膜的初始定植者。接下来添加四种与从口腔健康转变为疾病相关的厌氧微生物:Veillonella dispar （NCTC 11831）、Actinomyces naeslundii （DSM 17233） 和两种梭杆菌属。Nucleatum 梭杆菌 （ATCC 10953） 和 Fusobacterium nucleatum 亚种 （subspp.）vincentii （DSM 19507）。所涉及的所有步骤均在火焰或 II 级安全柜中无菌进行。用于微生物制剂的所有培养基和磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 在使用前都经过高压灭菌，并在方案期间定期评估无菌性。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在材料表中。

1. 共培养微生物群落的制备

注意:该协议描述了代表与牙龈组织炎症相关的联盟的多物种生物膜的产生，也称为牙龈炎。如前所述，这种模型已用于评估宿主对口腔健康和疾病的反应3。

  1. 从含有储存在 -80°C 的微生物的多孔珠子（商业获得）的冷冻库存中，在血琼脂平板（含有 5% 无菌去纤维马血的 Columbia 血琼脂基础）上恢复所有三种链球菌种类。 这是通过使用接种环和条纹板技术来实现的。
    1. 在 37 °C、5% CO2 下孵育 24 小时，然后分离 3-4 个菌落以增殖到 10 mL 胰蛋白胨大豆肉汤培养基中。将肉汤在 37 °C、5% CO2 下培养 16-18 小时。
  2. 对于中间病原体，恢复 V. dispar、 A. naeslundii、 F. nucleatum 和 F. nucleatum subspp. vincentii 在含有 5% 无菌去纤维马血的 Fastidious 厌氧琼脂基础上在 37 °C 下厌氧 48 小时，然后在相同条件下在 Schaedler 肉汤中再培养 24-48 小时。
  3. 生长后，通过在 20 °C 下以 3000 x g 离心 5 分钟沉淀细胞悬液，然后在 10 mL 无菌 PBS （pH 7.2-7.6） 中洗涤沉淀。 通过 离心 5 分钟，在 20 °C 下以 3000 x g 再次沉淀细胞悬液，然后第二次重复洗涤步骤。将洗涤后的细胞重悬于 10 mL 无菌 PBS 中以进行标准化。
  4. 使用 550 nm 的分光光度计单独标准化所有三种 链球菌 属。吸光度值为 0.50（范围为 0.45-0.55 可接受）表示细胞计数为 ~1 x 108 个细胞/mL，如前所述使用 Miles 和 Misra 细胞计数技术31。为了获得此吸光度读数，请在无菌 PBS 中进一步稀释 10 mL 洗涤的细胞悬液。
  5. 标准化后，在 Todd Hewitt 肉汤 （THB） 和罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 的 1:1 混合物中以 1:10 的比例稀释所有 链球菌 属至 1 x 107 个细胞/mL。通过移液到含有 13 mm 直径羟基磷灰石圆盘的 24 孔微量滴定组织培养板中，加入 500 μL 细胞悬液。让生物膜在 37 °C、5% CO2 下成熟 24 小时。
    注:多物种生物膜可以在不同的口腔相关基材上生长，例如牙釉质、牙本质32 和聚甲基丙烯酸甲酯义齿表面33,34。这些模型也可以使用替代培养基，例如人工或合成唾液，但应根据所使用的微生物群落仔细考虑:研究表明，生长培养基的选择对混合群落生物膜的生长具有重要意义35,36。
  6. 第二天，以与上述类似的方式标准化四种厌氧微生物（步骤 1.2-1.4）。沉淀细胞悬液，洗涤两次，然后将 V. dispar 标准化为 0.50 吸光度（范围为 0.45-0.55），其余三种微生物标准化为 0.20 吸光度（范围为 0.18-0.22）。标准化后，以 1:10 至 1 x 107 个细胞/mL 的比例在 THB 和 RPMI 的 1:1 混合物中进一步稀释所有悬浮液。
  7. 小心地去除未粘附的细胞和用过的培养基，并通过移液将它们从 链球菌 生物膜中丢弃。用 500 μL 四种厌氧菌的标准化 1 x 107 个细胞/mL 悬浮液替换微量滴定板孔。在 37 °C 厌氧条件下培养生物膜 24 小时。
  8. 24 小时后，从 7 种生物膜中去除未粘附的细胞和用过的培养基，并替换为 500 μL 无菌 1:1 THB:RPMI 培养基混合物。将生物膜在 37 °C 下厌氧成熟 4 天，每天去除并补充培养基（总共更换四次培养基）。
  9. 第 7 天，多物种生物膜完全成熟，可用于下游实验。用 500 μL 无菌 PBS 洗涤生物膜两次，用于共培养。
    注:可以使用一系列生物方法对生物膜进行分析，例如 qPCR（用于成分评估）和如前所述，使用共聚焦或电子显微镜进行显微镜分析3。

2. 器官型组织处理和实验设置

注:下面描述的实验装置涉及由在惰性聚碳酸酯膜过滤器上培养的 TR146 细胞组成的人口腔上皮 （HOE） 组织。存在其他模型，包括表皮模型、膀胱、食管、角膜、牙龈和阴道上皮。所有模型的处理和准备方式都类似于下面描述的用于研究宿主-病原体相互作用的方式。

  1. 到达后，拆箱并将 HOE 组织和培养基转移到 II 级安全柜中。将总共 1 mL 随组织供应的维持培养基添加到 12 孔板中。
  2. 用无菌镊子从 24 孔板和用于运输的营养琼脂中取出含有 HOE 的聚碳酸酯插入物，并将它们转移到含有培养基的 12 孔板中，确保组织下方没有气泡。确保使用额外的镊子或薄纸小心地去除附着在插入物侧面或底部的多余琼脂。
  3. 在实验设置之前，将组织模型在 37 °C、5% CO2 下孵育 24 小时，以适应运输后的实验室条件。值得注意的是，额外的维护培养基或生长培养基可用于组织模型的长期维护或进一步成熟。
  4. 现在可以进行共培养实验。对于此处提供的示例，通过超声处理从其底物中去除如上所述创建的 7 种生物膜（步骤 1.1-1.9）。为此，使用 24 G 针头和镊子从 19 孔板底部去除含有生物膜的 HA 盘，然后转移含有 1 mL 无菌 Dulbecco PBS 的 bijoux。在超声水浴中以 35 kHz 超声处理 10 分钟。
  5. 使用镊子从过夜驯化中小心去除含有组织模型的插入物，并通过移液将 100 μL 生物膜超声处理悬浮液直接添加到组织中。使用未刺激的对照组织进行比较。对于这些对照组织插入物，加入 100 μL 无菌 Dulbecco 的 PBS，不含生物膜悬浮液。
    注:浮游细胞、含有分散细胞的用过的生物膜上清液或整个生物膜可用于共培养模型，以代替生物膜超声处理。这些使用不同微生物刺激剂的宿主病原体模型的不同应用如图 1 所示，如其他地方记录的那样3、5、6、8、13、37、38。
  6. 添加后，将小室转移到另一个含有 1 mL 新鲜维持培养基的 12 孔板中，再次确保小室下方没有气泡。在组织处理下游应用之前，将含有组织模型的板在 37 °C、5% CO2 下孵育 24 小时。
    注:组织供应商可以提供额外的培养基，以支持在暴露于超声聚集体或生物膜后组织的持续培养。为此，已经发表了几个研究长时间组织生物膜接种的先前模型 21,28,39。为了使用当前的器官型模型获得类似的结果，对组织进行超声处理（如上所述，步骤 2.6）并让微生物附着 24 小时。丢弃任何剩余的微生物悬浮液，并在所需的实验时间内继续在气液界面培养。

3. 实验输出的组织处理

注意:共培养后，处理组织模型以获得实验输出。以下步骤记录了如何从组织中提取 RNA 进行转录分析，以及如何使用用过的组织培养基进行蛋白质检测。如前所述，组织也可以固定在福尔马林、多聚甲醛或类似的固定剂中以进行组织学评估 3,6。

  1. 首先，在 2.0 mL 螺帽 O 形圈管中制备 350 μL RLT 裂解缓冲液，其中含有 1% 的 β-巯基乙醇和 ~100 μL 相当于 0.5 mm 酸洗玻璃珠。
  2. 使用镊子从培养基中取出含有组织的插入物，并从插入物中丢弃任何残留的微生物悬浮液。接下来，握住，倒置，与眼睛齐平，以便轻松。使用 19 G 针头，从插入物底部小心地切片组织和膜，然后转移到 RLT 缓冲液中。
    1. 使用台式珠子打浆器匀浆器在 30 秒时匀浆组织，然后按照 RNA 提取试剂盒的制造商说明从裂解物中提取 RNA（参见 材料表）。
      注:提取的 RNA 用于 cDNA 合成，以使用定量 PCR （qPCR） 或 RNA 测序分析细胞因子和趋化因子基因作为炎症标志物的表达。qPCR 是使用多重阵列实现的，例如 RT2 PCR profiler 阵列，其中包含带有特定基因即用型引物的孔，或带有内部设计的引物序列和无核酸酶 ddH2O3 的 SYBR 绿色试剂。
  3. 收集剩余的用过的组织培养基 （~850-900 μL），使用低通量和高通量方法（如 ELISA、多重免疫测定或多重蛋白质生物标志物分析）进行蛋白质组学分析7。
  4. 使用用过的组织培养基，在蛋白质水平上评估一系列与炎症相关的标志物。用过的培养基可以直接用于上述方法（步骤 3.3）或储存在 -20 °C 或 -80 °C 下。 避免对培养基进行多次冻融循环以进行此类分析。
    注:培养基可能需要以 1:10 的比例稀释，具体取决于组织兴奋剂，以便使用 ELISA 进行准确的蛋白质组学分析。

结果

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在这个实验中，HOE 暴露于含有 7 种生物膜超声处理物的生物体中，这些生物体代表了从口腔健康到牙龈炎症（称为牙龈炎）的转变。这种疾病是由牙龈或口腔上皮组织的炎症引起的，这是由于牙菌斑在牙齿表面堆积引起的微生物扰动引起的。如上所述，刺激后，组织和用过的培养基用于转录和蛋白质组学分析。在本实验中，在用生物膜超声处理后刺激的组织中检测到一组炎症生物标志物的基因表达（图 2）。这是通过使用包含 16 个不同基因的定制 RT2 PCR profiler 阵列实现的，基因表达表现为在看家基因 GAPDH 正常化后相对于未刺激组织的倍数变化。微生物刺激增加了除 CXCL5 外所有基因的表达， NFKB、 CCL2、 CXCL1、 CXCL3、 CSF2、 CSF3、 TNF、 IL1A、 IL1B 和 TLR4 存在统计学差异（图 2A）。观察到 CCL2 、 CXCL1 和 CSF3 的倍数变化最大，分别增加了 16.9 、 10.3 和 15.1 （图 2B）。

用过的 HOE 培养基用于蛋白质组学分析，以检测刺激后组织产生和释放的蛋白质。这对于确定基因表达是否与蛋白质产生相关很有用。为此，在对照组织和生物膜超声刺激组织中评估了 IL8 基因表达和 IL-8 蛋白释放（图 3）。如前所述，使用基于 SYBR-green 的 qPCR 和 IL8 和 GAPDH 引物评估基因表达3。用生物膜超声刺激后，HOE 中的 IL8 mRNA 表达增加了 8.67 倍（图 3A）。在蛋白水平上，使用 IL-8 ELISA 试剂盒定量 IL-8 水平。用过的培养基中 IL-8 的浓度从对照组织的 ~1.005 ng/mL 增加到生物膜超声刺激组织中的 ~4.245 ng/mL（图 3B）。

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图 1:器官型组织共培养模型的不同应用。 将微生物的标准化悬浮液直接应用于组织，以研究物种-宿主相互作用 （A）。这些通常用于评估短时间内（例如，<24 小时）的微生物定植。对复杂的生物膜进行超声处理，以研究分散细胞或生物膜聚集体对组织 （B） 的影响。这很重要，因为先前已经表明，与浮游或生物膜对应物相比，此类细胞具有独特的表型;为此，可以使用额外的较小插入物将完整的生物膜直接添加到组织中，以产生与宿主 （C） 的相邻暴露。最后，将浮游细胞添加到适当培养基中的组织中，以评估组织上的微生物定植、生物膜形成和生长动力学 （D）。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 2:用 7 种生物膜超声处理物刺激后 HOE 组织的基因表达。 在对照、未刺激样品和暴露于 100 μL 7 种生物膜超声处理物的 HOE 组织中，总共 15 个炎症基因的 mRNA 表达倍数变化归一化为看家基因 GAPDH （A）。mRNA 表达变化最大的三个基因 （CCL2、 CXCL1、 CSF3） 如 （B） 所示。使用参数非配对 T 检验进行统计分析，显著变化分别表示为 *p < 0.05、**p < 0.01 和 ***p < 0.001。使用统计和绘图软件绘制和分析数据。 请单击此处查看此图的较大版本。

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图 3: HOE 组织产生的 IL8 基因表达和 IL-8 蛋白水平。 通过基于 SYBR-green 的 qPCR 测定 HOE 组织中 IL8 的 mRNA 表达倍数变化 （A） 和使用 ELISA 方法从用过的组织培养基中定量的 IL-8 蛋白水平 （B）。使用参数非配对 T 检验进行统计分析，显着变化分别表示为 *p < 0.05 和 ****p < 0.0001。使用统计和绘图软件绘制和分析数据。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

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在这里，描述了产生代表牙龈炎的复杂多物种生物膜模型的方法，用于与 HOE 组织共培养以评估微生物刺激后的宿主反应。该方案可用于研究浮游细胞、单、双或混合物种生物膜或生物膜分散的细胞与来自人体不同生态位的上皮组织之间的宿主-病原体相互作用。使用组织模型研究宿主-病原体相互作用为以前的共培养系统提供了重要的进步，这些系统仅限于 2D 单层，这些单层并不总是真正概括体内情况，其中上皮组织包含多个细胞层 16,17,18。此外，与多层组织模型的体外生长相关的挑战很多，使用多种细胞系和/或在容易受到污染的气液界面处生长细胞层。市售组织提供了一个可重复的平台，具有始终如一的高质量模型，这些模型在重复和批次之间具有可比性，如以前的出版物 3,7 所示。

对于"共培养微生物群落的准备"部分，根据与从口腔健康转变为疾病相关的常见共生体和病原体，选择了将这些微生物纳入 7 种牙龈炎模型。与体外所有复杂的生物膜模型系统一样，微生物的纳入是由与特定健康或患病生态位相关的微生物组研究指导的。为此，我们和其他人报道了使用含有共生微生物（例如链球菌和 Rothia 属）的口腔健康相关生物膜模型。3,40,41。此外，可以将其他病原体添加到这些模型中，以产生与其他疾病相关的生物膜。例如，可以将三种微生物添加到此处描述的 7 种物种中，以创建与牙周炎3 相关的疾病模型，同时可以添加真菌病原体白色念珠菌以增加多微生物性，并增加一层界间复杂性33。事实上，与仅细菌生物膜相比，促进真菌-细菌相互作用可以对在体外使用此类生物膜模型的各种实验输出产生巨大影响42。最后，强烈建议在为此类研究创建新的多物种生物膜模型时仔细考虑。虽然从广泛的文献搜索中应该很容易识别所包含的微生物，但对于大多数生态位和/或疾病，由于不同的原因，它们可能无法很好地整合到体外的复杂模型中。下面描述了应该考虑的其他一些潜在注意事项:

生物膜形成动力学
体内生物膜的形成通常涉及特定微生物的早期、中期和晚期定植。龈上和龈下牙菌斑形成的显著特征是先锋物种（例如链球菌属）最初附着在牙釉质上的唾液膜，中间和后期病原体需要这些作为定植的支架43。在细菌性阴道病期间的阴道环境中也提出了类似的现象，其中阴道加德纳菌被认为是最初的定植者，其次是随后的厌氧菌44。然而，重要的是要注意，其他生态位中的其他疾病可能并非如此。

每种微生物的接种密度
在体外培养时，微生物将具有不同的大小和/或生长动态;因此，在标准化过程中考虑这一点很重要。例如，白色念珠菌的大小是细菌细胞45,46 的 100-150 倍，因此，可能需要以较低的浓度（例如 1 x 106 个细胞/mL）添加到此类生物膜模型中。

物种拮抗
用于这些模型的一些微生物（包括相同物种但不同的分离株、实验室和/或临床菌株）可能会在生物膜形成过程中与其他微生物竞争，从而抑制某些微生物物种的生长47。Sadiq 等人的一项研究强调了微生物的不同组合如何影响微生物协同作用（或拮抗作用）产生的生物膜生物量48。尽管研究小组可能对研究生物膜模型中的这种相互作用感兴趣（例如，测试益生元或益生菌处理），但其他人可能无法解释这种拮抗作用，这可能会影响创建模型时的多物种复杂性。

生物膜成熟的持续时间
优化生物膜成熟时间框架至关重要，因为这可能取决于所包含微生物的生长动态和用于培养的模型系统（包括基质）。较长的成熟时间可能导致后期病原体的更好定植，但在模型内导致更多的细胞死亡，尤其是早期定植者。相反，如果要研究未成熟生物膜模型对宿主的影响，更短的孵育时间可能很重要。Brown 等人的一项研究描述了相同的 10 种伤口生物膜模型在成熟 24 小时、48 小时和 72 小时后在人 THP-1 细胞中具有不同的炎症特征，这表明生物膜越不成熟，它的促炎性就越强7。在多层组织模型中可以观察到类似的结果。同样重要的是要注意，定期更换每日培养基对于最大限度地减少生物膜中的细胞死亡是必要的，尽管这可以根据正在进行的治疗方案进行修改，例如，如果评估长期抗菌干预的效果。

对于"器官型组织处理、实验设置和组织处理"部分，可以根据研究人员的需要调整孵育时间范围。根据研究问题，可以在较早的时间点（例如 1-12 小时）到 48 小时和 72 小时的较晚时间点研究宿主 - 病原体相互作用。其次，提供所有含有抗生素的维持培养基;因此，根据实验设计，需要在订购时向公司提出移除这些要求的请求。尽管插入物下方的介质不与组织的上边缘直接接触，但除非在模型 6,8 中造成伤口，否则如果研究微生物侵入组织，则可能值得考虑去除抗生素。

如上所述，也可以更改用于共培养刺激的微生物材料，范围是评估浮游生物、用过的生物膜上清液（过滤和未过滤）、整个生物膜或生物膜与组织的超声孵育。例如，先前的证据表明，EpiSkin 提供的组织模型为研究浮游真菌与宿主的相互作用提供了有用的模型:白色念珠菌、耳念珠菌、糠秕马拉色菌和红毛癣菌细胞已被证明会附着在 HOE、重建人表皮 （RHE） 或人阴道上皮细胞中的外周组织层并相互作用，其中一些研究表明刺激宿主反应真菌感染后 1,5,6,11,12,49。关于细菌-宿主相互作用存在类似的出版物，例如，痤疮杆菌的生物膜形成，痤疮杆菌是一种与头皮屑中的头皮微生物群相关的常见病原体，已在 RHE 表面研究，当单独培养时以及与真菌皮肤生物体 Malassezia restricta10 一起培养。其他人研究了葡萄球菌属附着在 RH 上的能力，测量了这种细菌-宿主相互作用的物理化学和微生物特性50。N'Diaye 和合著者探讨了人类来源的神经肽降钙素基因相关肽如何影响 RHE 组织模型中的金黄色葡萄球菌毒力51。其他人研究了益生菌干预对人角膜上皮14 铜绿假单胞菌感染的保护作用。同时，从多微生物的角度来看，不同的小组研究了混合物种生物膜对不同组织基质的影响 2,3,7,13。

总体而言，上面引用的这些协议和研究记录了器官型组织模型在研究宿主-病原体相互作用方面的大量应用。尽管研究表明 EpiSkin 模型，尤其是 RHE 皮肤模型，具有良好的适用性，可用于测试化妆品的腐蚀/刺激性 52,53,54,55，但这些模型与现实世界的离体组织外植体或其他市售组织供应商之间存在一些限制56,57.一个明显的限制是，所有市售的组织模型都是在无菌、"无菌"环境中从细胞系生成的，这意味着组织从未暴露于微生物扰动:这可能会加剧宿主的任何炎症反应，远远超过在体内或体外组织外植体刺激后看到的57.相反，这些实验室模型系统将不包含与体内组织相关的潜在结缔层或脉管系统、在离体组织移植过程中可以保留的特征以及影响炎症反应的特征。事实上，最近的一项系统评价强调，应仔细考虑使用使用各种工程技术（包括生物材料）创建的具有适当脉管系统的组织模型58。例如，最近的一项研究使用嵌入了牙龈成纤维细胞和微血管内皮细胞的基于纤维蛋白的基质来产生等效的血管化牙龈组织。作者描述了暴露于健康或疾病相关微生物后模型中的差异炎症反应59。从商业角度来看，现在存在更复杂的模型，例如"T 型皮肤模型"，它包含一个全层组织，该组织由覆盖在表皮上的成纤维细胞组成的真皮组成。看看这种复杂的模型与仅表皮系统相比如何会很有趣。

虽然没有模型是完美的，但器官型组织模型代表了临床前测试的有前途的替代方案，与三个 R 概述的框架一致，即在进行动物研究时进行替换、减少和细化。为此，尽管动物模型为生物膜相关人类疾病的复杂病理生理性质提供了重要的见解，但它们也有明显的缺点。这些 3D 模型易于作，无需道德批准即可对调查进行大而细微的更改。将这些模型与上述现有的复杂生物膜系统相结合，可以大大提高我们对宿主-病原体相互作用的理解，并在 体内 研究之前更好地预测新疗法的成功。

披露

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作者没有什么可披露的。

致谢

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作者要感谢 Haleon 为 Saeed Alqahtani 提供资金支持，以运行与所描述的组织模型相关的相关项目，以及沙特阿拉伯教育部对 Muhanna Alshehri 的博士资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
13 毫米羟基磷灰石 （HA） 圆盘Plasma Biotal Limitedn/a （定制）生物膜形成的基材，模拟牙齿表面
19 G 针 （40 毫米） VWR613-2028用于帮助从板中取出HA盘，并从插入物中切出组织
24孔TC处理的平底微量滴定板带盖，科学实验室用品3524 （100包）用于培养生物膜和组织共培养实验的板
酸洗玻璃珠（425-600 &μ;m）默克：Sigma-AldrichG8772用于组织裂解以提高 RNA 提取的产量  
放线菌 DSM 17233 莱布尼茨研究所 DSMZn/a用于复杂生物膜模型的微生物之一
珠磨机 24 均质器（或同等产品） Fisher Scientific15-340-163用于组织裂解以提高 RNA 提取的产量  
珠宝 （7 毫升）Greiner Bio-One189170 （每袋 700 个）用于生物膜超声处理  
cDNA 合成试剂盒（高容量）Thermo Fisher Scientific4368814（用于 200 次反应）从组织 RNA
哥伦比亚血琼脂 （CBA） 基础合成 cDNA Thermo Fisher ScientificCM0331B（500 g）用于制备用于培养需氧微生物的 CBA 板
去纤维马血E&O LaboratoriesDHB用于补充 CBA 和 FAA 板，用于培养需氧和厌氧微生物
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（dPBS：不含 CaCl2 和 MgCl2）默克：Sigma-AldrichDB537dPBS，用于与生物膜超声
Nucleatum 梭杆菌 ATCC 10953美国典型培养物保藏中心n/a用于复杂生物膜模型的微生物之一
梭杆菌 nucleatum 亚种（亚属） vincentii DSM 19507莱布尼茨研究所DSMZ n/a用于复杂生物膜模型的微生物之一
GraphPad Prism（第 10 版）GraphPad Software， Incn/a用于图形创建和数据分析 
人 IL-8 ELISA 试剂盒（未包被 ELISA 试剂盒，带板）Thermo Fisher Scientific （Invitrogen）88-8086-86（用于 10 x 96 次检测）ELISA 试剂盒和板，用于用过的组织培养基人
口腔上皮细胞 （HOE） 的蛋白质评估 Episkinn/a （定制）用于共培养模型系统的上皮组织
接种环（一次性，10 个和微量;L 或同等产品） Fisher Scientific12870155（1000 支/包）用于固体和液体培养基中的微生物培养
MicroAmp 快速反应 96 孔 qPCR 板 （0.1 mL） Thermo Fisher Scientific4346907（10 块板）的 qPCR 基因表达谱
Pro-Lab DiagnosticsPL.170微生物的储存和冷冻保存 
无核酸酶水Thermo Fisher ScientificAM9935 （10 x 1.5 mL）RT-PCR 级水，用于 qPCR 实验 
培养皿 （90 mm）Fisher Scientific （Sterilin） 11309283（500 个装）用于制备用于微生物培养的琼脂板
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）Thermo Fisher Scientific 18912014（100 片/包）用于微生物标准化和生物膜洗涤步骤的 PBSRneasy
迷你试剂盒Qiagen74106（用于 250 次反应）用于组织的基于柱的 RNA 提取试剂盒 
罗斯威尔公园纪念研究所 1640 中等默克：Sigma-AldrichR7755-10L（10 升） 生物膜培养培养基 
RT2 profiler arrayQiagen330171（定制）qPCR 阵列，包含用于基因表达谱的即用型引物
Schaedler 厌氧菌琼脂基础Merck：Sigma-Aldrich （Millipore）91019（用于 500 g）用于制备 Fastdious 厌氧琼脂板 
Schaedler 厌氧菌肉汤Thermo Fisher Scientific CM0497B （500 g）厌氧微生物生长的液体培养基
螺旋盖 Beadbug O 形圈管 科学实验室用品Z763837-1000EA （1000 支装）用于珠磨机 24 均质器，裂解组织
Fisher Scientific （Fisherbrand）n/a用于 HA 盘生物膜的超声处理 
中间链球菌 DSM 20753 莱布尼茨研究所 DSMZn/a用于复杂生物膜模型的微生物之一
链球菌 mitis NCTC 12261国家类型培养物保藏中心n/a用于复杂生物膜模型的微生物之一
口腔链球菌 NTCC 11427 国家模式培养物保藏中心n/a用于复杂生物膜模型的微生物之一
SYBR-green （qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX）PCR生物系统PB20.12用于 qPCR 的 SYBR-green 混合物 
Todd Hewitt 肉汤默克公司：Sigma-AldrichT1438 生物膜培养培养基 
胰蛋白胨大豆肉汤 （TSB） 培养基默克：Sigma-Aldrich22092（500 g）用于需氧微生物生长的液体培养基
镊子（150 mm，不锈钢，锯齿状）RS-Pro 545-187用于移动 HA 圆盘和组织插入物/组织提取物
通用管 （30 毫升）Greiner Bio-One201150 （每袋 400 个）用于在液体培养物中培养微生物的容器 
Veillonella dispar NCTC 11831国家类型培养物保藏中心n/a'用于复杂生物膜模型的微生物之一
&β;-metacapthoethanolMerck：Sigma-AldrichM3148组织样品中的 RNase 失活
口腔处理的细胞共培养 用于组织微库微珠 用于

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