小鼠骨髓来源中性粒细胞的ATAC-Seq文库制备

摘要

本文概述了一种从小鼠骨髓中分离中性粒细胞并构建ATAC-seq文库的实验方案，旨在确保中性粒细胞的高存活率和高质量文库的制备。文章提供了骨髓细胞制备、免疫磁珠分选及文库构建的详细步骤，为中性粒细胞研究领域的新手研究人员提供了有价值的参考指南。

摘要

利用测序技术检测转座酶可及染色质（ATAC-seq）是一种功能强大的高通量方法，可用于评估染色质可及性并深入理解表观基因组调控机制。中性粒细胞作为免疫反应中一类关键的白细胞，在分化和活化过程中会发生显著的染色质结构重塑，这些变化对其功能相关基因表达具有重要影响。ATAC-seq 已被广泛应用于揭示中性粒细胞成熟过程中的关键转录因子，发现病原体特异性的表观基因组特征，并识别自身免疫性疾病的潜在治疗靶点。然而，中性粒细胞对外界环境高度敏感，这给获得高质量的 ATAC-seq 数据带来了挑战。本文提出了一种可扩展的实验方案，用于制备来自啮齿类动物骨髓来源中性粒细胞的 ATAC-seq 文库，该方案通过改进的免疫磁珠分离技术，确保细胞活性最佳并获得高质量文库。文中详细讨论了影响文库质量的关键因素以及方法拓展的优化原则。本方案将有助于致力于研究中性粒细胞染色质结构与表观基因组重编程的研究人员，推动基础免疫学与临床免疫学领域的深入发展。

引言

中性粒细胞是脊椎动物体内数量最多且至关重要的免疫细胞类型之一，占人类白细胞的50%–70%¹。中性粒细胞在宿主识别和清除微生物过程中发挥核心作用。在脓毒症期间，成熟的中性粒细胞是最早响应的细胞之一²。它们通过趋化作用迅速迁移至感染部位³，到达炎症部位后，通过吞噬微生物（吞噬作用）、产生活性氧自由基（依赖NADPH氧化酶的呼吸爆发）、释放颗粒内容物（脱颗粒）以及形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）来捕获并杀灭胞外细菌⁴。在趋化因子的作用下，未成熟的中性粒细胞也会迅速从骨髓动员进入外周循环^5,6。这些被招募至感染部位的中性粒细胞还会释放参与多种生理过程（如造血、血管生成和伤口愈合）的细胞因子^7,8。患有先天性或获得性导致中性粒细胞数量减少疾病的患者对感染更为易感^9,10。然而，中性粒细胞的活化是一把双刃剑。过度活化及细胞因子的大量释放可导致组织和器官损伤，若感染未能及时控制，可能引发多器官功能障碍<....

方案

以下所有动物实验均遵守中国国家伦理和动物福利指南及相关法规，并已获得中国北京首都医科大学动物护理研究伦理委员会的批准（sjtkl11-1x-2022(060)）。

1. 骨髓细胞（BMC）悬液的制备

1. 选取6-8周龄、体重19-21 g的雄性C57BL/6J小鼠。使用CO₂麻醉舱处死小鼠，在深部反射消失后进行颈椎脱位，随后在解剖垫上用70%乙醇喷雾消毒小鼠体表。
2. 使用小型剪刀和镊子小心分离股骨与髋关节及胫骨的连接，去除附着的皮肤和骨骼肌，并在10 cm培养皿中用冷磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗股骨。
3. 剪除股骨两端的骨骺，将连接于2 mL注射器的28 G针头轻轻插入骨髓腔，用含2%胎牛血清（FBS）的冷PBS冲洗骨髓。
4. 重复上一步骤，直至冲洗出的深红色液体变为透明。通常需要冲洗三次。
   注意：避免将针头插入骨髓腔过深，以确保获得最佳的细胞产量。
5. 使用70 µm细胞筛将细胞悬液过滤至荧光激活细胞分选（FACS）管（5 mL）中。
6. 使用不含多聚甲醛的商用红细胞裂解缓冲液裂解骨髓细胞（BMCs）中的红细胞。
   1. 将试管在25 °C下以500 x g离心5分钟，小心吸除上清液，底部保留约100 µL液体，轻弹试管使沉淀松散。
   2. 加入2 mL由10....

结果

本方案用于从C57BL/6小鼠的骨髓中分离中性粒细胞，并通过ATAC-seq技术比较其在脂多糖（LPS）刺激前后染色质可及性的差异。通常，可从一只6至8周龄的C57BL/6小鼠的双侧股骨中收获约2 × 10⁷个骨髓细胞（BMCs），并进一步分离出2–5 × 10⁶个中性粒细胞。其中，1 × 10⁵个细胞用于ATAC-seq分析，其余细胞可用于中性粒细胞的全面分析。

采用FACS免疫表型分析来确定免疫磁珠分选后中性粒细胞的纯度和活力（图2）。尽管仅通过前向散射面积（FSC-A）和侧向散射面积（SSC-A）的分布即可进行初步估计，但本实验使用特异性中性粒细胞标志物染色以更明确地展示分选效果。在基于FSC-A和SSC-A设门后，进一步利用FSC-A与前向散射高度（FSC-H）进行设门，以区分单细胞与聚集细胞。分选后约99%的细胞被鉴定为单细胞。随后排除7-氨基放线菌素D（7AAD）——一种可被活细胞有效排出的DNA染料——对细胞进行标记，从而鉴定出分选后单细胞中>.......

讨论

本论文报道了一种针对来自啮齿类动物骨髓样本的中性粒细胞优化的ATAC-seq文库制备实验方案。由于中性粒细胞是高度敏感且易于活化的免疫细胞，优化工作优先考虑维持分离后中性粒细胞的活性。不当处理可能导致NETosis及其他形式的细胞死亡，从而释放大量非染色质化的DNA，增加背景噪声²³。我们在细胞核提取前简化了操作流程，并选用不含多聚甲醛的红细胞裂解缓冲液。与外周血样本不同，骨髓细胞中红细胞含量极少，因此仅需将骨髓细胞与红细胞裂解缓冲液进行短暂孵育，即可有效减少中性粒细胞的丢失，同时确保红细胞充分溶解。为尽量减少不必要的刺激，所有试剂在与骨髓细胞孵育前必须预热至37 °C，并需极其轻柔地操作，避免涡旋振荡、反复使用细胞筛过滤、长时间或过高转速离心等操作。上述步骤的改进提高了分选后中性粒细胞的存活率，从而为构建高质量的ATAC-seq文库创造了有利条件。

我们探讨了三种广泛使用的分选技术，以获得具有最佳活性的中性粒细胞：免疫磁珠分离法、密度梯度离心法和流式细胞术分选。在进行密度梯度离心时，中性粒细胞可能穿过分离液层，从而引发渗透压变化并诱.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.4% 台盼蓝	Scientific	T10282
1× 磷酸盐缓冲液	Biosharp	BL302A
20 bp–5000 bp 片段长度标记物	Bioptic	C109102-100A	DNA片段分析仪配套产品
5k 片段长度标记物（标准 50 bp Ladder）	Bioptic	C109101-100A	DNA片段分析仪配套产品
扩增子纯化磁珠	Beckman	A63881	扩增子纯化磁珠是一种核酸纯化试剂盒，用于获得高质量的DNA产物。
Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, mouse	miltenyi	130-120-337	Anti-Ly-6G MicroBeads UltraPure, mouse 专为从小鼠骨髓单细胞悬液中正向筛选或去除小鼠中性粒细胞而开发。
Anti-mouse CD11b-BV605 (1:200)	BD	Cat#563015
Anti-mouse CD48-PE-Cy7 (1:400)	BD	Cat#560731
Anti-mouse Ly6G-BV510 (1:200)	BD	Cat#740157
C57BL/6J 小鼠，野生型，8周龄，雄性	中国医学科学院实验动物研究所	中国医学科学院实验动物研究所
DNA分离缓冲液	Bioptic	C104406	DNA片段分析仪配套产品
大肠杆菌来源的超纯LPS（血清型0111:B4）	Sigma-Aldrich	Cat#L-2630
DNA定量试剂	vazyme	EQ111	DNA定量试剂是一种简单、灵敏且准确的双链DNA（dsDNA）荧光定量检测试剂盒。
红细胞裂解缓冲液（10×）	BioLegend	Cat#420301
胎牛血清	Gibco	Cat#10099141C
MS 分离柱	miltenyi	130-042-201	MS柱专为细胞正向筛选而设计。
RPMI 1640 培养基	Gibco	C11875500BT
S2 凝胶电泳进样针	Bioptic	C105101	DNA片段分析仪配套产品
手术器械：手术刀、解剖剪、显微解剖剪、精细镊子、钝头解剖镊、持针器	Fisher Scientific	https://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-tools	可从其他合格供应商处采购
注射器（1 mL）	Fisher Scientific	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464	可从其他合格供应商处采购
TruePrepTM DNA文库构建试剂盒 V2 for Illumina	vazyme	TD501-01	TruePrep DNA文库构建试剂盒 V2 for Illumina 是专为Illumina高通量测序平台设计的专用试剂盒。使用该试剂盒可将DNA制备成适用于Illumina高通量测序平台的测序文库。
TruePrepTM Index试剂盒 V2 for Illumina	vazyme	TD202	TruePrep Index试剂盒 V2 for Illumina 是TruePrep DNA文库构建试剂盒 V2 for Illumina 的配套试剂盒，可用于制备96种不同的双端Index文库。