通过普鲁士蓝/DAB染色法评估5xFAD小鼠脑内铁沉积

摘要

本方案介绍了评估组织（尤其是脑组织）中铁沉积分布和含量的方法。方案详细说明了样本制备、普鲁士蓝/DAB染色、图像采集和数据分析的操作步骤。

摘要

阿尔茨海默病（AD）是一种常见的神经退行性疾病，是老年人群中痴呆症的主要病因。铁沉积与AD的发病机制密切相关。在AD患者脑组织中，铁水平升高与典型的AD病理特征显著相关，包括β-淀粉样蛋白斑块、tau蛋白神经原纤维缠结以及细胞凋亡。越来越多的证据表明，由于铁代谢紊乱所导致的氧化应激在AD的病理生理过程中发挥着重要作用。因此，明确铁蓄积在AD病理过程中的作用，对于AD的治疗至关重要。一套完整的铁染色实验方案对于检测脑组织中铁的表达与分布具有重要意义。本方案旨在介绍一种评估脑组织中铁沉积量及其分布的方法。我们详细描述了试剂配制、小鼠处理以及脑切片制备的相关步骤。此外，本文还提供了一套详细的组织化学铁染色操作流程，用于脑组织切片中的铁检测，并配套提出一个系统性的分析框架，结合定量评估与形态学评价，以确保对染色结果进行全面解读。该实验方案将有助于研究人员深入理解脑内铁沉积现象，并推动阿尔茨海默病的相关研究。

引言

阿尔茨海默病（AD）是最常见的神经退行性疾病，已成为社会面临的严重问题。AD 的患病率随年龄增长而急剧上升^1,2,3,4。阿尔茨海默病（AD）的主要病理特征包括 β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块的沉积以及因 tau 蛋白异常磷酸化导致的神经纤维缠结（NFTs）。Aβ 是通过 β-分泌酶和 γ-分泌酶对淀粉样前体蛋白（APP）进行连续切割而生成的。Aβ 的生成或清除失调会导致其在脑内积聚，形成淀粉样斑块，这些斑块被认为是 AD 最早的病理标志之一。这些斑块不仅直接造成神经元损伤，还会引发一系列有害效应，包括神经炎症、氧化应激和突触功能障碍。这些过程共同导致神经元死亡以及 AD 中所观察到的进行性认知衰退⁵。尽管数十年的研究主要集中在阿尔茨海默病（AD）的病理特征上，如 Aβ 斑块沉积和过度磷酸化 tau 蛋白的聚集，但具有临床意义的治疗突破仍难以实现，现有干预措施在改变疾病进展方面疗效有限⁶。

铁是一种对维持大脑功能至关重要的金属元素，参与氧气运输、DNA合成、线粒体呼吸、髓鞘合成、神经递质合成及代谢过程。然而，当铁浓度超过细胞螯合能力....

方案

所有操作均按照徐州医科大学实验动物管理和使用委员会的指南以及中国关于实验动物护理和使用的政府法规进行。

1. 动物灌注

1. 配制固定液：将4%多聚甲醛（PFA）溶解于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中（见表1）。
2. 通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（15 mg/kg）对小鼠进行麻醉。小鼠麻醉后，使用四枚图钉将其固定在灌注手术托盘上，以固定四肢。
   注意：为确保充分麻醉，需检查小鼠是否丧失对脚趾夹捏的反应、四肢肌肉是否松弛，以及呼吸是否深、慢且平稳。
3. 用剪刀剪开胸部以暴露心脏，并剪开右心房。用注射器向左心室注入20 mL 1× PBS以冲洗血液，随后注入20 mL 4% PFA进行固定。
   注意：控制针头的深度和方向，避免刺穿室间隔。需注意，理想的灌注效果表现为肝脏呈苍白色，且在初始震颤后四肢变得僵硬。
4. 将完成灌注的小鼠断头，用精细剪刀剪开颅骨周围骨骼，用钝头镊子小心抬起颅骨并取出脑组织。随后将脑组织置于4% PFA中，4 °C下过夜浸泡固定。
   注意：4% PFA具有强烈呼吸道刺激性，操作时需佩戴合适的口罩，并在通风橱内进行。
   注意：本实验所采用的安乐死方法已获徐州医科大学动物护理与使用计划IACUC批准，符合《安乐死指南：小鼠/大鼠》规定。

结果

为了研究阿尔茨海默病（AD）小鼠模型中铁的分布与蓄积情况，我们对8月龄5xFAD小鼠的矢状脑切片进行了普鲁士蓝/DAB染色。如图3所示，在8月龄5xFAD小鼠、8月龄野生型小鼠以及2月龄野生型小鼠中均观察到普鲁士蓝/DAB染色信号。在5xFAD小鼠中，海马和皮层区域，尤其是海马下脚区域，显示出强烈的普鲁士蓝/DAB染色信号。野生型小鼠作为经过验证的阴性对照，无论是2月龄还是8月龄组，其铁沉积信号均显著减弱（图3A），且可检测到但无显著差异的随年龄增长而积累的趋势。在40×放大倍数下，5xFAD小鼠中的信号出现在类似Aβ斑块的结构中，这与先前的研究结果一致^9,10（图3B）。采用4×放大倍数图像拼接以观察5xFAD小鼠脑组织中铁染色的分布情况，结果显示皮层、海马和小脑区域的染色信号明显强于其他脑区（图3C.......

讨论

铁沉积与阿尔茨海默病密切相关。一方面，铁可通过多种机制促进 Aβ 的生成，包括增加淀粉样前体蛋白{NOTE:20}²³的表达，以及增强 γ-分泌酶活性，从而加速 Aβ 的产生²⁴；另一方面，铁水平升高所诱导的脂质过氧化可促进 tau 蛋白的聚合，并进一步导致神经元中 tau 蛋白异常磷酸化的增加²⁵。普鲁士蓝染色（Perls' Prussian blue staining）是一种成熟的组织化学技术，用于在生物样本中特异性显示三价铁（Fe³⁺）的沉积。三价铁与亚铁氰化物反应生成蓝色的亚铁氰化铁（即普鲁士蓝）¹⁴。Perls'/DAB 染色是传统 Perls 染色的一种改良方法，将反应后的样本置于含 DAB（二氨基联苯胺）的溶液中，使普鲁士蓝形成棕褐色化合物。利用该方法，我们观察了 5xFAD 小鼠脑内铁沉积的空间分布，并对阿尔茨海默病模型小鼠与野生型小鼠的铁沉积水平进行了定量比较。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 M PBS	biosharp	BL601A	加入去离子水配制溶液
4% PFA	Beyotime	P0099	4 °C 保存以备使用
20X DAB 溶液	Bioss	C-0003	取溶液 A 10 μl、溶液 B 10 μl 与 PBS 180 μl 混合
酒精	Supelco	107017
HCl	Sigma	7647-01-0	加蒸馏水至 50 ml
ketamine	中国医药集团	H20193336	麻醉剂量为 100 mg/kg
显微镜	Olympus	CX43
最佳切割温度包埋剂（OCT）	Sakura Finetek	4583
亚铁氰化钾溶液	Sigma	14038-43-8	加蒸馏水至 50 ml
蔗糖	Sigma	57-50-1
xylazine	Y-S 生物技术公司	YS-(BC)-2842	麻醉剂量为 15 mg/kg
二甲苯	Sigma	1330-20-7