优化 体外 使用色谱在线监测进行mRNA生产中的转录反应

摘要

优化 体外 体外转录（IVT）对于经济高效地生产mRNA至关重要。本方案详细描述了一种用于IVT反应在线分析的分析型色谱方法，可监测分批或补料分批模式下的核苷三磷酸（NTP）消耗和mRNA生成，适用于多种RNA形式，有助于提高生产效率并降低成本。

摘要

体外转录反应（IVT）是一种复杂的多组分酶促反应，由RNA聚合酶（例如T7）催化，以线性DNA为模板合成mRNA。由于IVT试剂成本较高， IVT是mRNA药物原液生产过程中的关键步骤，也是该领域重点优化的环节。为了降低mRNA生产的成本，必须对试剂进行最优利用。有效的优化需要全面了解各个试剂对反应动力学的影响，即核苷三磷酸（NTPs）的消耗和mRNA的生成情况。传统上，人们采用低通量、终点式的分析技术对mRNA进行分析。尽管这些方法能够提供有关mRNA含量的有价值信息，但要充分理解IVT反应过程，仍需采用在线或近实时的分析手段。我们展示了如何使用一种液相色谱分析方法，在近实时条件下同时分离NTPs、质粒DNA（pDNA）和mRNA，以研究IVT反应动力学。通过掌握不同IVT组分对反应动力学和产率的影响，可利用快速色谱分析将批次IVT反应转化为补料分批模式，从而进一步提高生产效率并降低反应的总体成本。

引言

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行推动了生物医学领域的空前变革，促使基于信使RNA（mRNA）的疫苗在欧洲和美国迅速研发并获得授权，例如拜恩泰科/辉瑞的Comirnaty和莫德纳的Spikevax^1,2,3。这些疫苗展现出的显著有效性与快速开发能力，凸显了mRNA技术巨大的治疗潜力，其应用不仅限于传染病，还包括癌症免疫治疗、蛋白质替代疗法、再生医学以及细胞重编程等领域^4,5。这一常被称为“mRNA革命”的时代，凸显了建立高效且低成本mRNA生产流程的迫切需求。

mRNA 的制备涉及多个单元操作，其中体外转录（in vitro transcription, IVT）反应是关键且成本最高的单元操作^6,7,8。IVT 反应利用 RNA 聚合酶（通常为 T7 RNA 聚合酶）以及核苷三磷酸（NTPs），在镁离子存在下以 DNA 为模板合成 mRNA。该过程相对简单，可在短时间内大量生产 mRNA，数小时内即可实现 2–5 g/L 的反应产率，某些报道中最高可达 14 g/L^9,10,11。然而，优化 IVT 反应产率对于降低生产成本、确保 mRNA 疫苗和治疗药物的可放大性至关重要¹²，并且由于不同序列对 NTP 消耗的影响，可能需要针对每种构建体或构建体家族单独进行优化。

该反应通常以分批方式进行，但近年来补料分批工艺和在线分析技术的进步为优化mRNA生产开辟了新的途径^7,13。补料分批反应通过一次性或连续添加试剂，有望延长反应时间并提高产量，其机制在于防止底物抑制以及辅因子依赖性的产物降解^14,15。

快速的旁线分析技术的开发是体外转录（IVT）领域的一项重要进展，能够以极短的分析延迟监测NTPs和mRNA等关键反应组分^13,16，为体外转录（IVT）监测增加了额外维度，而该过程通常仅关注mRNA浓度¹⁷传统上，mRNA 的分析通常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等技术。这些方法属于终点检测，因此无法用于体外转录（IVT）过程的实时监测。本方案中所述分析方法的替代方案包括使用荧光增强型 RNA 适配体与荧光染料配对的技术。在该方法中，将荧光增强型 RNA 适配体标记到 RNA 上，并与荧光增强染料共同孵育，通过检测荧光强度即可可视化转录活性。¹⁷这使得在体外转录（IVT）过程中能够实时分析转录出的mRNA的数量和质量21，但无法同时监测其他IVT组分，例如NTPs。另一种可能实现NTP和mRNA实时定量的替代方法是拉曼光谱法。¹⁸但迄今为止，尚无研究报告表明其在体外转录（IVT）监测中的有效性，提示该方法仍需进一步优化，以获得必要的选择性和灵敏度。

持续开发更快、更具选择性的分析方法，有助于优化体外转录（IVT）工艺，以提高分批和补料分批模式下的产量。该反应仍是一个复杂的多参数过程，涉及多个相互作用的因素，不同构建类型（例如 mRNA 与自扩增 RNA）的最适条件可能不同。Mg²⁺离子与核苷三磷酸（NTPs）的浓度及其比例尤为关键，必须精确平衡其最佳水平，以在最大化mRNA产量的同时，尽量减少双链RNA（dsRNA）的生成——dsRNA是先天免疫系统的强效激活剂^19,20。最近有研究报道，通过在稳态水平下持续补充UTP可减少dsRNA的形成²¹。对UTP水平进行近实时监测将为工艺控制提供更进一步的保障。

在本方案中，我们展示了如何通过在线监测体外转录（IVT）反应，提高批次和补料批次模式下的mRNA产量。

方案

1. 缓冲液配制

注意：所有缓冲液必须以无 RNase 的方式配制，即所有化学试剂和玻璃器皿必须专用于无 RNase 的实验操作，并谨慎处理。用于缓冲液配制和玻璃器皿清洗的水必须经认证为无核酸酶。在开展实验前，所有工作表面和玻璃器皿必须喷洒可去除 RNase 的去污试剂。使用玻璃器皿或工作区域前，必须用无 RNase 的水将去污试剂彻底冲洗干净。如有可能，应使用无菌且一次性耗材。

1. 体外转录（IVT）缓冲液的制备：通过加入400 mM Tris、10 mM DTT、20 mM 亚精胺，调至pH 7.9，配制10x IVT缓冲液。配制含100 mM EDTA、pH 8.0的终止缓冲液。将每种缓冲液均经0.22 µm PES滤膜过滤。
2. 流动相的制备：加入50 mM HEPES、pH 7.0配制流动相A（MPA）；加入50 mM HEPES、100 mM Na₄P₂O₇、pH 8.3配制流动相B（MPB）；加入0.1 M NaOH、1 M NaCl配制流动相C（MPC）；加入0.5 M HEPES、pH 7.0配制流动相D（MPD）。每种缓冲液均经0.22 µm PES滤膜过滤。

2. 准备 体外 体外转录反应（IVT）

注意 1：体外转录（IVT）反应可以是批次反应，即所有试剂在反应开始时加入，待核苷三磷酸（NTP）耗尽或 mRNA 产量达到平台期后终止反应；也可以是补料批次反应，即在 NTP 耗尽后补充新的 NTP，从而进一步提高 mRNA 产量。IVT 反应中使用的线性化质粒 DNA（pDNA）模板可通过限制性内切酶切割质粒 DNA 中 poly(A) 序列下游的位点获得，也可通过 PCR 反应制备。无论采用哪种方法，反应后均需进行纯化处理，可选择层析法或商用 DNA 纯化试剂盒进行纯化。

1. 批量体外转录反应
   1. 将恒温混匀仪设置为 37 °C 和 300 rpm。解冻下列所列的所有试剂 表1 除酶以外的所有组分预热至37 °C，置于恒温金属块中。使用100 mM的ATP、CTP、UTP和GTP储备液配制25 mM的NTP混合液。
   2. 在试剂解冻的同时，准备时间进程实验所需的样品分装。取0.5 mL无菌离心管，每管加入2 µL的100 mM EDTA。用指定的IVT编号（如IVT001、IVT002等）和对应的时间点（如0 min、15 min、30 min、60 min等）标记每根离心管。
   3. 当试剂解冻并在37 °C下保温约15分钟后，从-20 °C冰箱中取出酶（T7 RNA聚合酶、焦磷酸酶、RNase抑制剂），并置于冷藏容器中，待使用完毕后及时放回冰箱保存。
   4. 混合单个体外转录（IVT）试剂（酶除外）时，使用涡旋振荡器。酶类通过轻柔吹打混匀。
   5. 按照实验设计设定的比例混合体外转录（IVT）试剂（例如，通用的IVT操作流程如下所示） 表1在1.5 mL离心管中进行。进行体外转录（IVT）优化时，最终IVT反应体系体积可在50–100 µL范围内调整。设计总IVT体积时，需考虑在时间进程实验中需取出的2 µL样品数量。确保所取样品总体积不超过总IVT体积的50%（例如，若每15分钟取样2 µL，持续3小时，则所取分装样品总体积为30 µL，因此IVT总反应体积至少应为60 µL）。
   6. 小心混匀体外转录反应液，最后加入T7 RNA聚合酶。所有试剂加完后，通过上下吹打充分混匀体外转录反应液，切勿使用涡旋振荡器。
   7. 在加入并混匀所有体外转录（IVT）试剂后，立即从离心管中吸取 2 µL IVT 混合物，移入预先准备好的含有 2 µL 100 mM EDTA 的 0.5 mL 离心管中（见步骤 2.1.2，0 分钟时间点）。
   8. 将含有体外转录反应混合物的反应管放入热循环仪中，在 37 °C 下孵育。
   9. 将计时器设定为所需的时间间隔（例如，15 分钟/30 分钟）。在每个时间点，从每份制备好的体外转录（IVT）反应混合物中取出 2 µL 样品，用移液器转移至预先准备好的含有 2 µL 100 mM EDTA 的离心管中（参见步骤 2.1.2）。这些分装样品将用于色谱分析（参见步骤 3）。
   10. 在色谱分析确认NTPs完全耗尽后，加入EDTA终止大量IVT反应，使EDTA终浓度为50 mM（例如，30 µL IVT反应液中加入30 µL 100 mM EDTA）。
2. 补料分批体外转录反应
   注意：通过添加NTPs和Mg，可进一步提高mRNA产量²⁺ NTP 耗尽后的离子变化。
   1. 混合体外转录反应体系，并按照步骤 2.1 所述取样。制备 NTP+MgCl₂ 补料分批培养用的补料液。制备方法示例：500 µL NTP+MgCl₂ 混合物，加入每种200 mM NTP各106 µL和76.25 µL的1 M MgCl₂₂ 和 5.5 µL 的 ddH₂O₂O. 混合物中的最终浓度为 42.4 每种 NTP 各 mM 和 152.5 mM MgCl₂.
   2. 使用第3步中所述的在线分析方法监测NTP消耗情况。当在线分析确认NTP浓度降至起始浓度的10%以下时，加入含有NTP+Mg的补料²⁺ 进行大规模体外转录。
   3. 测量/计算在取完所有用于分析的等分试样后，1.5 mL 离心管中剩余的体外转录（IVT）反应液的精确体积。向 IVT 反应液中加入适量的 NTP+MgCl₂ 混合液，使每种 NTP 的终浓度为 4 mM，MgCl₂ 的终浓度为 12 mM。₂例如，对于1.5 mL离心管中剩余的80 µL大量IVT反应液，加入16.8 µL NTP+MgCl₂ 混合物
   4. 按照步骤2.1中所述继续取样。当NTPs再次耗尽后，重复步骤2.2.2。持续进行补料和取样，直至达到目标mRNA产量。
   5. 在达到所需的mRNA产量后，按照步骤2.1.10的方法使整个反应失活。

3. 色谱分析的准备

1. 标准品与系统适用性测试（SST）样品制备
   1. 通过混合加帽试剂、NTPs、pDNA 模板和 mRNA 制备 SST 样品。确保加帽试剂的终浓度约为 3 µM，每种 NTP 的终浓度为 5 µM，pDNA 模板的终浓度为 4 ng/µL，mRNA 的终浓度为 10 ng/µL。确保最终 SST 体系中含有 0.1 M NaCl。
   2. 每次分析前均需制备新的标准曲线。通过将已知浓度的纯化 mRNA 样品用 MPA 稀释来制备标准品。标准点浓度应分别为 0.5 ng/µL、2 ng/µL、5 ng/µL、10 ng/µL、15 ng/µL 和 20 ng/µL，每种标准品的终浓度均为 0.1 M NaCl。
   3. 如需要，为所有 NTPs 制备标准曲线。确保各 NTP 在标准品中的终浓度分别为 0.5 µM、2 µM、5 µM、10 µM、15 µM 和 20 µM。
2. 色谱柱平衡与分析前准备
   1. 在分析前，将 0.1 mL 分析柱在室温下平衡 12 小时。将色谱柱按照柱管上标注的方向连接至色谱系统。
   2. 以 1 mL/min 的流速冲洗色谱柱：首先用 50 柱体积（CV）的 ddH₂O 冲洗，随后用 50 CV 的 MPA 冲洗。
   3. 在正式分析前，至少运行 3 针空白样品（仅注入 MPA）以建立基线。采用 Skok 等人¹⁵所述的色谱方法。
   4. 当基线稳定且连续两次空白测定结果相近（基线可重现）时，开始运行 SST 样品及标准曲线样品。
   5. 若 SST 判定标准符合要求，且加帽试剂与 NTPs 的分离效果良好，则继续进行 IVT 样品的分析。在完成所有 IVT 样品分析后，再次注入 SST 标准品，以确认整个分析过程中系统条件保持稳定。
3. 样品制备
   注意：用于色谱分析的样品应在分析前立即制备。否则，样品应保存于 -20 °C 冰箱中（最长 24 小时）或 <-65 °C（超过 24 小时）。
   1. 在进行色谱分析稀释前，对已淬灭的 IVT 样品进行涡旋振荡并离心。所有经 EDTA 失活的 IVT 样品（见步骤 2.1.9）均应采用 Skok 等人¹⁵所述方法进行色谱分析。
   2. 分析前，将 IVT 样品稀释至标准曲线范围内。在整个时间进程实验中使用相同的稀释倍数，以确保可通过比较 NTP 峰面积判断 NTP 耗尽的时间点。
   3. 为确定 IVT 样品所需的最小稀释倍数，使用以下公式：所需稀释倍数 = （预期终末 mRNA 浓度）/（失活过程中的稀释倍数）/（最高标准品浓度）
      例如，若预期 IVT 反应中 mRNA 产量为 8 mg/mL，则淬灭后样品中浓度为 4 mg/mL。为使浓度落在标准曲线范围内，需进一步将样品稀释 200 倍。
      ​所需稀释倍数 = (8000 ng/µL) / 2 / (20 ng/µL) = 200
   4. 将 MPA 和 4 M NaCl 移取至锥形玻璃小瓶中。确保样品中 NaCl 的终浓度为 100 mM。最后加入已淬灭的 IVT 样品。
   5. 对制备好的样品进行涡旋振荡，并将其放入自动进样器中待分析。将自动进样器温度设置为 4 °C。
   6. 将 100 µL 稀释后的样品注入分析柱。测定每个 IVT 样品在 A260 和 A280 处的吸光度。
   7. 对于已知浓度的样品，或无需根据峰面积变化追踪 NTP 消耗的情况，可将样品稀释至目标浓度 10 ng/µL。

4. 样品定量与数据分析

1. 在对每个体外转录（IVT）样品进行峰面积积分前，需从样品色谱图中减去空白样品的信号。
2. 在A260处对所有NTP、pDNA和mRNA峰进行积分，并利用峰面积计算IVT反应中NTPs和mRNA的浓度。
   注意：或者，若所有时间点的稀释因子保持一致，也可使用峰面积比较各NTP在IVT反应中剩余的百分比。
3. 根据在线色谱分析测定的mRNA/NTP浓度，判断是否可终止IVT反应，或是否需要向IVT反应中补充额外的NTPs（参见步骤2）。

结果

本方案中所述的色谱分析可用于体外转录（IVT）反应的优化，或用于将批量IVT反应转化为补料分批反应（图1）。

为了测试不同缓冲液组成对体外转录（IVT）反应动力学的影响，按照表2中所述方案配制了三种不同的IVT反应体系。将pH用HCl调节的Tris缓冲液与pH用乙酸调节的Tris缓冲液进行比较。此外，将这两种Tris缓冲液均与pH用NaOH调节的HEPES缓冲液进行比较。所有1x IVT缓冲液的组成为40 mM Tris/HEPES、10 mM DTT、2 mM 亚精胺，pH为7.9。

从100 µL的体外转录（IVT）反应混合物中，在孵育的第1小时内每15分钟取出2 µL IVT样品，并用2 µL 100 mM EDTA终止反应，随后每30分钟取样一次，直至孵育达到180分钟。该反应条件下预期的最终mRNA产量为15 mg/mL，这意味着由于终止反应导致2倍稀释后，再在MPA+NaCl中进行400倍稀释用于分析。样品总共被稀释了800倍，因此即使mRNA产量达到15 mg/mL，上样到分析型色谱柱中的mRNA浓度仍处于标准曲线的浓度范围内。

对每个单独样品在各个时间点（t_x）的 NTP 和 mRNA 在 A260 处的峰面积进行积分。然后利用 mRNA 校准曲线将峰面积转换为 mRNA 的浓度，同时以 0 分钟（t0）时 NTPs 在 A260 处的峰面积作为 100%，计算 NTPs 的消耗百分比（见下文公式）。

结果可以以每个体外转录（IVT）反应的折线图形式展示，其中横轴表示时间，纵轴表示mRNA浓度和剩余的NTP含量（图2A）。所有IVT反应的mRNA浓度随时间的变化也可汇总在同一张图中进行比较，从而研究mRNA的生成动力学并筛选最优的IVT反应条件（图2B）。

在补料分批实验中，按照表3所述配制IVT反应体系。从300 µL的IVT反应混合物中，每隔30分钟取出2 µL IVT样品，并加入2 µL 100 mM EDTA终止反应。此外，在每次批量添加NTP和MgCl₂后立即取样。预先配制一种补料溶液，其中包含每种NTP各42.4 mM和MgCl₂ 152.5 mM，配制方法为将每种106 µL的200 mM NTP溶液与76.2 µL的1 M MgCl₂溶液混合。建立补料程序，在孵育的第60分钟、120分钟、180分钟和240分钟时进行脉冲式补料。补料程序详见表3。样品采用与批量IVT反应相同的分析方法进行近实时分析。在监测300分钟后，终止IVT反应。

结果可以表示为孵育时间内残留的NTPs/ mRNA产量。由于脉冲式加料也会稀释体外转录（IVT）反应体系，因此在每次加料时IVT中的mRNA浓度都会下降（图3A）。mRNA质量的增加也可通过转录倍数（定义为m_mRNA/m_pDNA）进行测量和展示，显示mRNA产量随时间呈线性增长（图3B）。

图 1：示意图概览 (A) 采用在线色谱分析对NTPs和mRNA进行定量的体外转录（IVT）优化工作流程示意图。(B) 分批IVT反应在（i）t0、（ii）反应中点、（iii）反应终点取样的代表性色谱图。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：体外转录（IVT）反应批次图。 (A) 体外转录反应的代表性图示，纵轴显示mRNA生成量与NTP消耗量。在孵育120至180分钟时，mRNA浓度达到平台期，这与NTP的消耗相关，其中限制性NTP（ATP）在120分钟时基本耗尽。(B) 体外转录图示显示不同IVT缓冲液对IVT反应动力学的影响。含缓冲液A（Tris+乙酸）的反应显示出最快的mRNA生成速度，其次为缓冲液B（Tris+HCl），缓冲液C（HEPES+NaOH）最慢。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：补料分批体外转录（IVT）图。 (A) 在60、120、180和240分钟时添加NTP+MgCl₂补料的IVT图。由于加入NTP+MgCl₂补料导致稀释，IVT反应中的mRNA浓度在每次补料添加时均下降。(B) 转录因子显示的mRNA质量在整个反应孵育过程中呈线性增加。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：通用体外转录（IVT）方案。 请点击此处下载该表格。

表2：批次体外转录（IVT）方案。 请点击此处下载该表格。

表3：补料分批IVT方案。 请点击此处下载该表格。

讨论

本方法通过在孵育过程中于不同时间点取样，利用一种可分离核苷三磷酸（NTPs）、质粒DNA（pDNA）和信使RNA（mRNA）的多模式分析色谱柱对体外转录（IVT）样品进行分析，从而实现对NTP消耗和mRNA生成的密切监测。该方法基于指定时间点A260吸收峰面积的变化，以定量方式测定NTP和mRNA的浓度。由于该方法可提供NTP和mRNA浓度的信息，因此非常适用于IVT反应的优化——其主要目标通常是最大化mRNA产量并缩短反应时间；因此，理解不同IVT试剂对mRNA生成动力学的影响至关重要²²。我们展示了如何应用在线监测技术来优化批次反应和补料批次反应模式下的IVT反应。

该方法的主要优势在于可进行在线分析，能够在不到8分钟的时间内完成每个样品的分析，从而实现对体外转录（IVT）过程的近实时监测。样品前处理简单，仅需用MPA稀释，无需其他预处理步骤。分析所需的样品体积非常小，例如仅需1 µL的IVT样品。如此小的移液体积可能因移液误差而引起分析偏差。然而，由于该分析方法具有高通量特性，可进行三次重复测量，因此异常值易于识别，且偏离预期动力学曲线的情况也较易察觉。

该方法的一个局限性是UTP和CTP在色谱上发生共洗脱。通常情况下，mRNA序列中的限速NTP往往是ATP或GTP，因此对UTP和CTP进行精确单独定量通常并非必要。如果需要分别定量UTP和CTP，可利用UTP与CTP在260 nm和280 nm处紫外吸光度的差异，推算出色谱峰中每种NTP的相对丰度。

该分析方法无法分离长度超过100个核苷酸的RNA种类；因此，不能用于检测mRNA质量的差异，例如，无法区分非多聚腺苷酸化与多聚腺苷酸化的mRNA、双链RNA（dsRNA）或截短转录本与单链RNA（ssRNA），也不适用于稳定性研究，因为它无法区分已降解和未降解的mRNA。然而，该方法可用于其他RNA形式的定量分析，例如circRNA、tRNA和saRNA。尽管这些分子在大小和结构上存在差异，但仍可采用相同的分析方法来研究其在体外转录（IVT）反应中的产量。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm PES 膜过滤器，例如 Sartolab BT 500	Sartorius	180E14---------E
0.5 mL 塑料管；例如 DNA LoBind，PCR 级洁净	Eppendorf	30108035
1.5 mL 塑料管；例如 DNA LoBind，PCR 级洁净	Eppendorf	30108051
ATP 溶液	MEBEP BIOSCIENCE	R1331T2
台式冷冻冰箱 -20 °C	Brand	114935
CIMac PrimaS 0.1 mL 分析柱（2 µm）	Sartorius BIA Separations	110.5118-2, 2 µm 通道
CTP 溶液	MEBEP BIOSCIENCE	R3331T2
DTT	Sigma	10197777001
EDTA-Na2 × 2H2O	Kemika	例如 11368 08
GTP 溶液	MEBEP BIOSCIENCE	R2331T2
HEPES	Merck	1.10110.1000
HPLC 高回收小瓶	Macherey-Nagel	702860
MgCl2	Invitrogen	AM 9530G
微量分光光度计	Thermo Scientific	Nanodrop
mRNA 标准品，mFix4，4000 nt	Sartorius BIA Separations	BIA-mFix4.1.1
Na4P2O7 + 10 H2O	Sigma	S6422-500G
NaCl	Fluka	31434-1KG-M
NaOH	Merck	1064691000
PATfix mRNA 分析平台	Sartorius BIA Separations	PAT0021
移液器 100 – 1000 μL	Eppendorf	Reference 2
移液器 2 – 10 μL	Eppendorf	Reference 2
移液器 20 – 200 μL	Eppendorf	Reference 2
焦磷酸酶	MEBEP BIOSCIENCE	M2403L
RNase Away 去污染试剂	Thermo Scientific	10328011
RNase 抑制剂	MEBEP BIOSCIENCE	RNK3501
亚精胺	Sigma	85558-5G
T7 mRNA 聚合酶	MEBEP BIOSCIENCE	TR01
恒温金属块（Thermoblock）	Thermo Scientific	EPPE5382000.015
Trizma Base	Sigma	T6066-1KG
UTP 溶液	MEBEP BIOSCIENCE	R5331T2
小瓶盖	Macherey-Nagel	70245
涡旋振荡器	IKA	V1900