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通过结合CRISPR/Cas9技术与细胞计数评估造血干细胞和祖细胞的异常生长相关基因

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DOI：

10.3791/67508

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2025年5月2日

 ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种将CRISPR/Cas9技术与细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测相结合的实验方案，用于鉴定对造血干细胞和祖细胞异常增殖能力至关重要的候选基因。

摘要

造血干细胞具有长期自我更新的能力，并能分化为多种成熟的血细胞。然而，造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中癌性突变的积累可能阻断正常分化过程，诱导异常增殖，最终导致白血病的发生。为了鉴定和/或评估这些癌性突变，我们整合了CRISPR/Cas9技术与细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测方法，研究了一个对HSPCs异常增殖能力至关重要的模型基因Trp53。具体而言，从表达Cas9的小鼠中分离出富含HSPCs的骨髓细胞，随后通过病毒转导方式导入靶向一个或多个候选基因的单导向RNA（sgRNAs），以在HSPCs中引入遗传改变。然后，采用CCK-8检测法评估转导后HSPCs的增殖能力。sgRNA的靶向效率通过插入缺失追踪分解分析（Tracking of Indels by Decomposition assay）进行验证。这些被鉴定出的基因可能在白血病发生过程中发挥关键作用，并可作为潜在的治疗靶点。

引言

造血作用在整个生命过程中产生所有谱系的血细胞，这一过程由一小群细胞——造血干细胞（HSCs）维持。HSCs通过自我更新维持自身数量，并产生多种定向祖细胞，进而分化为完全成熟的有功能的血细胞1,2,3。该过程受到严密调控。然而，造血干/祖细胞（HSPCs）中致癌突变的积累会阻碍正常分化，赋予其异常增殖能力，并最终将HSPCs转化为白血病起始细胞（LICs）4,5,6,7。识别并验证致白血病突变仍是癌症研究面临的一大挑战。

近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）系统已被开发并成为一种高效且精确的基因编辑方法，该系统由 Cas9 核酸酶和单导向 RNA（sgRNA）组成8。sgRNA 通过 RNA-DNA 互补配对将 Cas9-sgRNA 复合物引导至基因组特定位点，在该位点 Cas9 核酸酶诱导产生双链断裂。断裂的 DNA 随后通过内源性基因编辑机制进行修复：在存在同源模板的情况下，通过精确的同源定向修复进行修复；或通过易发生错配的非同源末端连接方式进行修复，后者会导致小片段的插入或缺失9。目前，CRISPR/Cas9 系统已成为靶向基因编辑和转录调控的有力工具10。

本研究中，我们利用 CRISPR/Cas9 技术在造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中引入基因突变，随后进行细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测，以探究所引入的突变是否对 HSPCs 的异常增殖具有关键作用。具体而言，从 Cas9 转基因小鼠中分离富集 HSPCs 的骨髓细胞，并通过病毒转导方式导入靶向候选基因的单导 RNA（sgRNAs）。随后，采用 CCK-8 检测方法评估这些突变是否赋予转导后的 HSPCs 更强的增殖能力。最后，通过插入缺失追踪分解法（TIDE）11 或靶向深度测序12 验证 CRISPR/Cas9 所引入的突变。该实验方案为评估白血病相关致癌突变及潜在治疗靶点提供了有力工具。

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方案

本方案下进行的所有动物实验均经北京中医药大学动物护理与福利委员会批准。

1. 靶向候选基因的sgRNA质粒构建（4–5天）

  1. 使用在线sgRNA设计工具设计靶向sgRNA。将目标基因组DNA序列输入在线sgRNA设计工具（例如， https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public）。选择合适的sgRNA靶点，并订购所需的寡核苷酸。
  2. 制备sgRNA寡核苷酸插入片段。将每个sgRNA（步骤1.1）设计的上游和下游链寡核苷酸分别重悬，使其终浓度为100 µM。根据以下方案配制混合物： 表1 磷酸化并退火sgRNA寡核苷酸。使用以下热循环参数：37 °C孵育30分钟；95 °C孵育5分钟；以5 °C/min的速率降温至25 °C−1.
  3. 将1 µL磷酸化并退火的寡核苷酸加入199 µL室温ddH₂O中2O 以达到 1:200 的稀释比例。
  4. 线性化载体质粒。
    1. 使用参考的骨架载体（参见 材料表)，使用限制性内切酶 Esp3I (BsmBI) 消化载体质粒。按照说明书设置反应体系 表1 并在55 °C孵育1小时。
    2. 向同一管中加入0.5 µL虾碱性磷酸酶（rSAP），在37 °C孵育30分钟，以降低线性化质粒自连接的可能性。
    3. 检测线性化是否成功。将已线性化的质粒和未切割的质粒分别上样，进行0.8–1%（w/v）琼脂糖凝胶电泳。
    4. 使用PCR纯化试剂盒纯化线性化质粒，用20 µL ddH₂O洗脱2O，并定量DNA浓度。
  5. 根据每个sgRNA设计，将sgRNA寡核苷酸克隆至载体质粒中，设置相应的连接反应 表116 °C孵育4小时。
  6. 转化：取10 µL步骤1.5的产物加入50 µL预冷的感受态Stbl3细胞中，冰上孵育30 min，42 °C热激90 s，然后立即放回冰上2 min。向同一离心管中加入200 µL不含抗生素的LB培养基，37 °C、220 rpm振荡培养30 min，随后涂布于含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB平板上。37 °C过夜培养。
  7. 第二天，观察平板上的菌落生长情况。从每个平板中挑选6-8个菌落，通过菌落PCR检测sgRNA是否正确插入。挑选阳性菌落，用无菌枪头挑取单个菌落接种至5 mL含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中。37 °C振荡培养过夜。
  8. 使用质粒DNA小量提取试剂盒从培养物中分离质粒DNA。从U6启动子处进行测序，以确认20-nt的引导序列已正确插入。

2. 慢病毒包装（2 - 3 天）

  1. 在添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS）和1%（v/v）青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基中，于37 °C和5% CO2条件下培养HEK 293T细胞。
  2. 传代HEK293T细胞时，吸去培养皿中的旧培养基，用3 mL PBS轻轻洗涤培养皿2次。向10 cm培养皿中加入1 mL胰蛋白酶，于37 °C孵育1分钟。加入3 mL预热的DMEM培养基以终止胰蛋白酶消化，将细胞收集至15 mL离心管中，以800 × g离心5分钟。弃去上清液，用5 mL新鲜培养基重悬细胞，并根据需要接种至新的培养皿中。
    注意：用于慢病毒生产的HEK 293T细胞传代次数应少于10代。
  3. 转染前16至24小时，将HEK293T细胞以每10 cm培养皿2–4 × 106个细胞的密度接种至培养皿中。确保所使用的DMEM不含抗生素。
  4. 确保转染当天细胞融合度达到70–80%。每10 cm培养皿转染10–15 µg质粒，保持质粒与PEI的摩尔比为1:3。根据表2配制转染用混合液1和混合液2。
  5. 将混合液2静置5分钟。将混合液2加入混合液1中（注意不可颠倒加入顺序），充分混匀后室温静置15–20分钟。
  6. 将复合物（步骤2.5）加入细胞中，轻轻摇动培养皿混匀，置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。6至8小时后，更换为含10% FBS的DMEM培养基。
  7. 慢病毒转染开始后两天，收集各培养皿中的慢病毒上清液。于4 °C以4,000 × g离心10分钟，并通过0.45 µm微孔滤膜过滤。分装慢病毒液并储存于-80 °C。
    注意：收集的慢病毒可根据需要进行浓缩。避免因反复冻融导致病毒滴度下降。

3. 骨髓细胞提取与培养（12 - 13 天）

注意：所有小鼠品系均维持在纯合的 C57BL/6 遗传背景上。将 LSL-Cas9 小鼠（T002249）与 Mx1-Cre 小鼠13杂交，以生成 LSL-Cas9/+; Mx1-Cre/+ 小鼠。本研究中，我们从小鼠 Mx1-Cre/+; LSL-Cas9/+ 及其同窝对照小鼠中收集骨髓细胞。

  1. 为了诱导Cre重组酶的表达，在第1天和第3天通过腹腔注射的方式向小鼠（8-12周龄）注射150 µL聚胞苷酸-聚肌苷酸（1.5 mg/mL）；在第6天通过腹腔注射5-氟尿嘧啶（5-FU，150 mg/kg）。
    注意：Mx1-Cre转基因小鼠经过基因工程改造，可在可诱导的Mx1启动子控制下表达Cre重组酶13。腹腔注射聚胞苷酸-聚肌苷酸可有效激活Mx1启动子并诱导Cre重组酶的表达14。注射5-FU用于清除骨髓中增殖的细胞，从而诱导造血干细胞（HSCs）进入细胞周期，导致造血干/祖细胞（HSPCs）相对富集15。经5-FU处理后，每只小鼠可收获约2-4 × 106个骨髓细胞。
  2. 在第11天，通过CO2窒息法处死小鼠。取出小鼠的股骨和胫骨，使用1 mL无菌注射器以含2% FBS的PBS冲洗骨髓腔，并按照Gavrilescu等人的方法收集骨髓细胞16。
    注意：在从小鼠体内取出胫骨和腓骨后，应立即将骨骼转移至超净工作台，以确保骨髓细胞收集过程中的无菌条件。
  3. 将骨髓细胞反复吹打（30-50次）以分散成单细胞悬液，随后将细胞混合物转移至50 mL离心管中，并涡旋振荡使其充分混匀。
  4. 取10 µL细胞悬液加入40 µL红细胞裂解缓冲液中，冰上放置5分钟以裂解红细胞。加入50 µL台盼蓝溶液，充分混匀后计数活细胞。
  5. 在4 °C条件下以800 × g离心15分钟，吸除上清液。
  6. 按照表3所述方法，将细胞重悬于骨髓预刺激培养基中，浓度为1-2 × 106 个细胞/mL。每10 cm培养皿接种10 mL细胞悬液，37°C孵育24小时。

4. 骨髓细胞的慢病毒转染（2 - 3 天）

  1. 第二天，从预刺激的培养板中收集细胞。用含有2% FBS的PBS 5–10 mL剧烈冲洗培养板。按照步骤3.4所述，加入台盼蓝对活细胞进行计数。
  2. 以 800 × g 离心细胞 g 室温下孵育10分钟。按以下步骤制备病毒离心感染溶液： 表4.
  3. 弃去上清液，并将细胞重悬于新配制的旋转感染溶液中（∼106 细胞/mL）。将悬浮细胞接种至6孔板中，每孔4 mL。用封口膜密封6孔板，以1,500 × g 32 °C 下孵育 90 分钟。
  4. 离心后，用移液器轻轻重悬细胞（但不更换培养基），然后将培养板置于培养箱中孵育4-6小时。
  5. 首次转染时，小心地从每个孔中尽可能吸出上清培养基（约 3 mL），并加入等体积的骨髓预刺激培养基。若操作过程中不慎吸出部分细胞，于 800 × g 室温孵育5分钟。弃去上清液，用少量预刺激培养基重悬细胞，然后将细胞重新加入孔中。
  6. 对于第二次转染，次日从每个孔中移除 2-3 mL 培养基，并加入等体积新鲜解冻的逆转录病毒储存液，同时根据前述方法加入适量的 HEPES 和 polybrene 表 4. 将培养板在 1,500 × g 90分钟，37 °C。
  7. 离心后，轻轻重悬细胞，并将培养板继续置于培养箱中孵育4-6小时。
  8. 按照步骤4.5更换培养基，孵育24小时。

5. 执行 体外 CCK-8 检测（3–4 天）

  1. 用力冲洗孔板以收集骨髓细胞。用含2% FBS的PBS洗涤孔板，以获得最大数量的细胞。通过70 µm滤网过滤细胞，并按步骤3.4所述用台盼蓝计数活细胞。
  2. 在室温下以800 × g 离心10分钟。
  3. 将细胞重悬于含10% FBS以及mIL-3、mIL-6（10 ng/mL）、mSCF（100 ng/mL）的DMEM培养基中，调整细胞密度至1 × 105 个细胞/mL。取约0.5–1 × 106 个细胞，在室温下以800 × g 离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀保存于-80 °C，用于基因组DNA提取。
  4. 将细胞以每孔1 × 104 个细胞的密度接种至96孔板中。每组设置六个复孔。在接种细胞的孔周围一圈孔中加入100 µL无菌PBS。分别在0、24、48和72小时进行培养。
  5. 在相应时间点小心吸去96孔板中的培养基。向各孔加入含1/10体积CCK-8试剂的110 µL培养基。设置空白对照组（仅含培养基和CCK-8，不含细胞）。在培养箱中孵育1小时。
  6. 使用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。
  7. 采用统计学软件分析实验数据，实验数据以均值±标准差（mean ± SD）表示。使用独立样本t检验分析两组间的差异，P < 0.05表示差异具有统计学意义。

6. 基因编辑验证（5 - 7 天）

  1. 根据制造商的建议，使用基因组DNA纯化试剂盒提取基因组DNA（步骤5.3）。
  2. 设计引物以扩增以sgRNA切割位点为中心的200至500 bp区域（表5）。
  3. 进行Sanger测序时，按照表6配制PCR反应体系。使用PCR仪扩增目标基因片段，程序如下：95 °C 预变性5 min，40个循环（95 °C 变性30 s，58 °C 退火30 s，72 °C 延伸9 s），72 °C 最终延伸10 min，4 °C 保存∞。
    注意：也可通过高通量测序（NGS）验证基因编辑效果，此时需使用纯化试剂盒对PCR产物进行纯化以用于NGS。
  4. 在TIDE网站（http://tide.nki.nl）上分析Sanger测序结果。将实验组和对照组的sgRNA序列及测序结果输入该在线工具，计算sgRNA的编辑效率。 
    注意：使用CRISPREsso2（http://crispresso.pinellolab.org/submission）17分析NGS结果。输入来自深度测序实验的双端测序数据（两个文件）或单端测序数据（单个文件），格式为fastq或fastq.gz，并提供参考序列和sgRNA序列。该软件将评估并量化靶向诱变结果。

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结果

敲除Trp53对小鼠HSPCs增殖能力的影响
本研究以Trp53基因敲除为例，展示该实验方案。为探究Trp53敲除对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPCs）增殖能力的影响，我们采用慢病毒转染方法，将Trp53 sgRNA导入经5-FU处理后富集的、表达Cas9的小鼠骨髓HSPCs中。同时，将无关sgRNA转染至同窝小鼠的骨髓细胞中作为对照组。转染后的细胞分别培养0、24、48和72小时，并通过CCK-8法检测其增殖能力。实验设计见图1。CCK-8实验结果显示，与对照组相比，Trp53敲除显著增强了细胞的增殖能力（图2）。

利用 CRISPR/Cas9 技术高效编辑 Trp53

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讨论

CRISPR/Cas9 技术因其操作简便且高效，已被广泛应用于生物医学研究，推动了基因功能筛选18、疾病建模19、免疫治疗20以及活细胞标记与成像21等应用。近期研究已开展大规模 CRISPR 筛选，以鉴定多种癌症类型中的新型治疗靶点，包括白血病22,23,24。

本研究提出了一种结合CRISPR/Cas9技术与CCK-8检测方法评估HSPCs异常增殖能力相关必需基因的方法，旨在为这些基因在肿瘤发生中的作用或作为潜在药物靶点提供证据。该方法在评估癌性突变方面具有多项优势。首先，使用原代骨髓细胞而非细胞系，因为前者更能准确模拟内源性生理条件。其次，采用表达Cas9的转基因小鼠以获得稳定表达Cas9的骨髓细胞，并...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢北京中医药大学提供共享服务以完成本研究。本工作得到国家自然科学基金青年科学基金项目（No. 31701280，资助给 J. Zhang）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 μm 微滤膜Sartoriu16533K-1
1.5 mL EP管LABLEADMCT-150-CLD-1
10 cm 培养皿Corning430167
15 mL 离心管LABLEADLXG1500
1 mL 无菌注射器
2x Accurate Taq Master Mix（含染料）精准生物学AG11010用于菌落PCR
50 mL 离心管LABLEADLXG5000
5-氟尿嘧啶SigmaF6627-1
6孔板康宁3516
70 µm细胞筛Falcon®352350
96孔板Corning3599
ACK裂解缓冲液LeageneCS0001
琼脂BIODEEDE0010
氨苄青霉素SolarbioA8180
应用生物系统公司PCR用热循环仪赛默飞世尔科技
细胞计数试剂盒-8BimakeB34304
离心艾本德Centrifuge 5810R
CO2 培养箱Thermo SCIENTIFIC
DMEMGibcoC11995500BT
DNA 纯化&Concentrator-5ZYMOD4014
Dneasy 血液 & 组织试剂盒Qiagen69504
Esp3I (BsmbI)NEBR0580L
胎牛血清ExCellFSP500
GraphPad Prism 9.3
HEK-293TATCC；弗吉尼亚州，美国
HEPEsSigmaV900477
KOD-Plus-NeoTOYOBOKOD-401
lentiGuide-PuroAddgene52963骨架载体
LSL-Cas9小鼠模式动物
研究中心
南京大学 		T002249
微孔板吸光度分光光度计BIO-RADxMark™
NaclRhawnR019772
PBSSolarbioP1003
PEIProteintechB600070
青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩SolarbioP1400
pMD2.G 质粒Addgene12259
聚凝胺BeyotimeC0351
聚胞苷酸-聚肌苷酸钠盐SigmaP1530
psPAX2Addgene12260
QIAquick PCR 纯化试剂盒 Qiagen28104
重组小鼠IL-3Peprotech213-13-10ug
重组小鼠IL-6Peprotech216-16-2ug
重组小鼠SCFPeprotech250-03-10ug
普通琼脂糖BIOWESTBY-R0100
重组虾碱性磷酸酶（rSAP）NEBM0371S
SpectraMax QuickDrop 超微量分光光度计分子装置
Stbl3 感受态细胞生物医学BC108-01 
T4 多核苷酸激酶NEBM0201L
T4连接酶Takara2011B
TIANprep 快速质粒小提试剂盒TIANGENDP105-03
台盼蓝溶液LABLEADC0040-100ml
胰蛋白酶-EDTAGibco25200072
胰蛋白胨OXOIDLP0042
WEHI-CM南京福克赛生物科技 CBP50079
酵母提取物OXOIDLP0021

参考文献

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Trp53 TIDE

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