本文介绍了一种将CRISPR/Cas9技术与细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测相结合的实验方案，用于鉴定对造血干细胞和祖细胞异常增殖能力至关重要的候选基因。
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本文内容
摘要
摘要
造血干细胞具有长期自我更新的能力，并能分化为多种成熟的血细胞。然而，造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中癌性突变的积累可能阻断正常分化过程，诱导异常增殖，最终导致白血病的发生。为了鉴定和/或评估这些癌性突变，我们整合了CRISPR/Cas9技术与细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测方法，研究了一个对HSPCs异常增殖能力至关重要的模型基因Trp53。具体而言，从表达Cas9的小鼠中分离出富含HSPCs的骨髓细胞，随后通过病毒转导方式导入靶向一个或多个候选基因的单导向RNA（sgRNAs），以在HSPCs中引入遗传改变。然后，采用CCK-8检测法评估转导后HSPCs的增殖能力。sgRNA的靶向效率通过插入缺失追踪分解分析（Tracking of Indels by Decomposition assay）进行验证。这些被鉴定出的基因可能在白血病发生过程中发挥关键作用，并可作为潜在的治疗靶点。
引言
造血作用在整个生命过程中产生所有谱系的血细胞，这一过程由一小群细胞——造血干细胞（HSCs）维持。HSCs通过自我更新维持自身数量，并产生多种定向祖细胞，进而分化为完全成熟的有功能的血细胞1,2,3。该过程受到严密调控。然而，造血干/祖细胞（HSPCs）中致癌突变的积累会阻碍正常分化，赋予其异常增殖能力，并最终将HSPCs转化为白血病起始细胞（LICs）4,5,6,7。识别并验证致白血病突变仍是癌症研究面临的一大挑战。
近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）系统已被开发并成为一种高效且精确的基因编辑方法，该系统由 Cas9 核酸酶和单导向 RNA（sgRNA）组成8。sgRNA 通过 RNA-DNA 互补配对将 Cas9-sgRNA 复合物引导至基因组特定位点，在该位点 Cas9 核酸酶诱导产生双链断裂。断裂的 DNA 随后通过内源性基因编....
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方案
本方案下进行的所有动物实验均经北京中医药大学动物护理与福利委员会批准。
1. 靶向候选基因的sgRNA质粒构建（4–5天）
- 使用在线sgRNA设计工具设计靶向sgRNA。将目标基因组DNA序列输入在线sgRNA设计工具（例如， https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public）。选择合适的sgRNA靶点，并订购所需的寡核苷酸。
- 制备sgRNA寡核苷酸插入片段。将每个sgRNA（步骤1.1）设计的上游和下游链寡核苷酸分别重悬，使其终浓度为100 µM。根据以下方案配制混合物： 表1 磷酸化并退火sgRNA寡核苷酸。使用以下热循环参数：37 °C孵育30分钟；95 °C孵育5分钟；以5 °C/min的速率降温至25 °C−1.
- 将1 µL磷酸化并退火的寡核苷酸加入199 µL室温ddH₂O中2O 以达到 1:200 的稀释比例。
- 线性化载体质粒。
- 使用参考的骨架载体（参见 材料表)，使用限制性内切酶 Esp3I (BsmBI) 消化载体质粒。按照说明书设置反应体系 表1 并在55 °C孵育1小时。
- 向同一....
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结果
敲除Trp53对小鼠造血干细胞和祖细胞增殖能力的影响
本实验以Trp53基因敲除为例，展示本方案的操作流程。为研究Trp53敲除对小鼠造血干细胞和祖细胞（HSPCs）增殖能力的影响，我们采用慢病毒转染技术，将Trp53 sgRNA导入经5-FU处理后富集且表达Cas9的小鼠骨髓细胞中。同时，将无关sgRNA转染同窝小鼠的骨髓细胞作为对照组。转染后的细胞分别培养0、24、48和72小时，并通过CCK-8实验检测其增殖能力。实验设计如图1所示。CCK-8实验结果显示，与对照组相比，Trp53敲除显著增强了细胞的增殖能力（图2）。
利用 CRISPR/Cas9 技术高效编辑 Trp53
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讨论
CRISPR/Cas9 技术因其操作简便且高效，已被广泛应用于生物医学研究，推动了基因功能筛选18、疾病建模19、免疫治疗20以及活细胞标记与成像21等应用。近期研究已开展大规模 CRISPR 筛选，以鉴定多种癌症类型中的新型治疗靶点，包括白血病22,23,24。
本研究提出了一种结合CRISPR/Cas9技术与CCK-8检测方法评估HSPCs异常增殖能力相关必需基因的方法，旨在为这些基因在肿瘤发生中的作用或作为潜在药物靶点提供证据。该方法在评估癌性突变方面具有多项优势。首先，使用原代骨髓细胞而非细胞系，因为前者更能准确模拟内源性生理条件。其次，采用表达Cas9的转基因小鼠以获得稳定表达Cas9的骨髓细胞，并.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢北京中医药大学提供共享服务以完成本研究。本工作得到国家自然科学基金青年科学基金项目（No. 31701280，资助给 J. Zhang）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.45 μm 微滤膜 | Sartoriu | 16533K-1 | |
| 1.5 mL EP管 | LABLEAD | MCT-150-CLD-1 | |
| 10 cm 培养皿 | Corning | 430167 | |
| 15 mL 离心管 | LABLEAD | LXG1500 | |
| 1 mL 无菌注射器 | |||
| 2x Accurate Taq Master Mix（含染料） | 精准生物学 | AG11010 | 用于菌落PCR |
| 50 mL 离心管 | LABLEAD | LXG5000 | |
| 5-氟尿嘧啶 | Sigma | F6627-1 | |
| 6孔板 | 康宁 | 3516 | |
| 70 µm细胞筛 | Falcon® | 352350 | |
| 96孔板 | Corning | 3599 | |
| ACK裂解缓冲液 | Leagene | CS0001 | |
| 琼脂 | BIODEE | DE0010 | |
| 氨苄青霉素 | Solarbio | A8180 | |
| 应用生物系统公司PCR用热循环仪 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 细胞计数试剂盒-8 | Bimake | B34304 | |
| 离心 | 艾本德 | Centrifuge 5810R | |
| CO2 培养箱 | Thermo SCIENTIFIC | ||
| DMEM | Gibco | C11995500BT | |
| DNA 纯化&Concentrator-5 | ZYMO | D4014 | |
| Dneasy 血液 & 组织试剂盒 | Qiagen | 69504 | |
| Esp3I (BsmbI) | NEB | R0580L | |
| 胎牛血清 | ExCell | FSP500 | |
| GraphPad Prism 9.3 | |||
| HEK-293T | ATCC；弗吉尼亚州，美国 | ||
| HEPEs | Sigma | V900477 | |
| KOD-Plus-Neo | TOYOBO | KOD-401 | |
| lentiGuide-Puro | Addgene | 52963 | 骨架载体 |
| LSL-Cas9小鼠 | 模式动物 研究中心 南京大学 | T002249 | |
| 微孔板吸光度分光光度计 | BIO-RAD | xMark™ | |
| Nacl | Rhawn | R019772 | |
| PBS | Solarbio | P1003 | |
| PEI | Proteintech | B600070 | |
| 青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩 | Solarbio | P1400 | |
| pMD2.G 质粒 | Addgene | 12259 | |
| 聚凝胺 | Beyotime | C0351 | |
| 聚胞苷酸-聚肌苷酸钠盐 | Sigma | P1530 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| 重组小鼠IL-3 | Peprotech | 213-13-10ug | |
| 重组小鼠IL-6 | Peprotech | 216-16-2ug | |
| 重组小鼠SCF | Peprotech | 250-03-10ug | |
| 普通琼脂糖 | BIOWEST | BY-R0100 | |
| 重组虾碱性磷酸酶（rSAP） | NEB | M0371S | |
| SpectraMax QuickDrop 超微量分光光度计 | 分子装置 | ||
| Stbl3 感受态细胞 | 生物医学 | BC108-01 | |
| T4 多核苷酸激酶 | NEB | M0201L | |
| T4连接酶 | Takara | 2011B | |
| TIANprep 快速质粒小提试剂盒 | TIANGEN | DP105-03 | |
| 台盼蓝溶液 | LABLEAD | C0040-100ml | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 胰蛋白胨 | OXOID | LP0042 | |
| WEHI-CM | 南京福克赛生物科技 | CBP50079 | |
| 酵母提取物 | OXOID | LP0021 |
参考文献
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nat Rev Genet. 21 (9), 541-554 (2020).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: Concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015)....
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