比较经腹膜腹膜后通路和经皮穿刺对兔腰椎间盘退行性变建模的影响

摘要

该方案比较了兔椎间盘退化 （IVDD） 模型中的经皮和经腹膜后穿刺。两种方法都诱导了 IVDD;然而，经腹膜后入路导致更广泛的变化和更低的死亡率。

摘要

本研究比较了两种方法诱导兔椎间盘变性 （IVDD） 的疗效:经皮和经腹膜后穿刺纤维环。将 15 只健康的雄性新西兰白兔随机分为 3 组:假手术、经皮穿刺和经腹膜后穿刺。进行了全面评估，包括死亡率、形态学和组织学评估、放射学成像和生物标志物分析，以确保两种方法之间的准确和详细比较。结果表明，两种穿刺技术都成功地在兔模型中诱导了 IVDD。然而，与经皮入路相比，经腹膜后入路导致椎间盘退行性变化更明显，同时保持显着较低的死亡率。这些发现突出了经腹膜后入路在 IVDD 建模中的优势。这项研究为建立 IVDD 模型提供了有价值的见解，并为未来研究腰痛的有效治疗策略奠定了基础，最终改善患者的预后。

引言

在过去的几十年里，腰痛 （LBP） 已成为影响生活质量的最严重的肌肉骨骼疾病¹。LBP 已成为一个日益重要的公共卫生问题，由于劳动力损失和额外的医疗费用，给社会带来了沉重的经济负担 ^2,3。仅在美国，每年与 LBP 相关的直接和间接成本就超过 1000 亿美元，包括医疗支出、收入损失和劳动力损失⁴。LBP 通常是由椎间盘退化 （IVDD） 引起的5,6,7,8。鉴于 LBP 的高患病率和经济影响，准确建模 IVDD 对于探索治疗策略至关重要。

为了了解 IVDD 的病理生理学并评估治疗策略，已经开发并使用了各种临床前 体内 动物模型⁹.这些模型已采用多种方法来诱导椎间盘退化，包括手术或化学椎间盘损伤、非侵入性机械应力、基因改造和自然发生¹⁰。在这些方法中，手术损伤占 IVDD 诱导的 64.9%，其中针刺是主要的手术技术¹¹。针穿刺模型的特点是易于建立且对实验动物的损伤最小。常见的穿刺方法包括开放腹膜后进入腰椎间盘间隙和经皮后外侧穿刺。插入深度可以通过放射学监测或针头长度来确定。值得注意的是，与开放手术方法相比，经皮入路可以减少医源性组织损伤，而腹膜后通路提供了直接可视化的好处——这些特征在以前的文献中没有进行定量比较。虽然研究调查了使用不同直径的针头¹² 和穿刺不同椎间盘¹⁰ 对 IVDD 诱导的影响，但针对不同针刺方法的比较研究仍然有限。鉴于其解剖学与人类椎间盘的相似性以及在大小和结构方面优于啮齿动物模型的优势，所选的兔子模型为需要具有成本效益的纵向研究和频繁成像评估的研究人员提供了特别的实用性¹³。

在本研究中，使用两种方法建立腰椎 IVDD 的兔模型: 开放腹膜后通路穿刺腰椎间盘间隙和经皮后外侧穿刺。分析了一套全面的结局指标，包括形态学、组织学和放射学变化。

方案

动物实验程序严格遵守美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》，并获得成都中医药大学实验动物伦理委员会的批准（伦理批准文号:2021-23）。使用了 15 只健康的 4 个月大的干净级新西兰白兔 （2.25 公斤± 0.25 公斤），包括 7 只雄性和 8 只雌性。将动物饲养在室温为 23 °C ± 3 °C 的环境中，湿度约为 60% ± 10%，适应一周，可自由获得水和食物。实验前，将 15 只兔子随机分为 3 组:假手术组（A 组）、经皮纤维环穿刺组（B 组）和经腹膜后间隙纤维环穿刺组（C 组），每组 5 只兔子。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 经 皮纤维环穿刺建立兔 IVDD 模型

注:兔 IVDD 模型是使用经皮纤维环穿刺法建立的。该程序遵循 Luo TD 等人 ¹⁴ 描述的穿刺建模方法，并在 X 射线引导下进行（图 1）。

1. 准备兔子。
   1. 手术前将兔子禁食 24 小时，确保获得水。
   2. 通过向耳静脉静脉注射 3% 戊巴比妥钠 （1.3 mL/kg） 进行麻醉（遵循机构批准的方案）。
   3. 通过检查是否不动、肌肉松弛、缺乏角膜反射和无疼痛反应来确认麻醉成功。
2. 定位并标记兔子。
   1. 将兔子固定在固定板上的俯卧位置。
   2. 剃须并准备手术区域，然后触诊骨标志。
   3. 触诊兔子腰背上的骨质标志。找到兔子上最低的肋骨，它通常对应于 L1 棘突上方的椎骨。
   4. 确定该椎骨正下方的棘突以确定 L1 棘突。
   5. 找到髂嵴的最高点，与 L6 椎骨大致齐平。
   6. 从 L1 棘突向下追溯，按顺序识别每个棘突，直至 L7。
   7. 用记号笔在兔子的背上清楚地标记 L1 棘突。
   8. 移动到下一个棘突并将其标记为 L2。
   9. 继续将每个后续棘突标记为 L3、L4、L5、L6 和 L7。确保每个标记都是不同的，并且按顺序排列，以便清晰识别。
3. 找到并标记穿刺部位。
   1. 触诊横突并定位 L5 和 L6 远端之间的中点。
   2. 标记这一点并准备将穿刺针插入其上方约 1 厘米处。
4. 插入穿刺针。
   1. 水平握住穿刺针并将其朝向地面插入，从而打破皮肤。
   2. 将针推进以到达 L4 椎体，并在 X 射线引导下验证正确定位。
   3. 将针头以大约 20° 的角度向 L4-5 椎间盘略微倾斜头部。穿刺椎间盘并在 X 射线检查下确认穿刺的准确性。
5. 进行椎间盘穿刺。
   1. 精确穿刺纤维环，必要时使用 X 射线引导。
   2. 对 L2-3 和 L3-4 椎间盘重复穿刺过程，分别穿刺一次。
   3. 保持大约 5 毫米的穿刺深度，每个光盘的停留时间为 5 秒。
6. 术后护理
   1. 对穿刺部位进行消毒和包扎。
   2. 将青霉素肌肉注射到臀大肌中，剂量为每天每只兔 40,000 U，持续 3 天。
      注意: 如果针头遇到硬组织，请调整方法。使用 X 线引导进行精确穿刺。监测兔子的恢复情况并提供适当的照顾。

2. 经 腹膜后间隙纤维环穿刺建立兔 IVDD 模型

注意:兔 IVDD 模型是使用经腹膜后间隙纤维环穿刺法¹² 建立的（图 2）。

1. 手术前将兔子禁食 24 小时，让水进入。
2. 通过将 3% 戊巴比妥钠 （1.3 mL/kg） 静脉注射到耳静脉中来麻醉兔子（遵循机构批准的方案）。
3. 确保兔子不动，肌肉放松，无角膜反射，对压力无疼痛反应，确认麻醉成功。
4. 将兔子固定在固定板上的俯卧位置。
5. 剃须并准备手术区域。
6. 触诊骨标志，用记号笔在兔子的腰背上标记 L1-L7 腰椎棘突。
7. 重新触诊兔子的横突以确定手术切口位置。
8. 放置无菌窗帘并对局部皮肤进行消毒，以确保无菌条件。
9. 使用后腹膜后入路逐层解剖筋膜和肌肉，露出腰椎间盘的外侧。
10. 用穿刺针刺穿纤维环至约 5 毫米的深度和 5 秒的停留时间。
11. 依次穿刺 L3-4、L4-5 和 L5-6 椎间盘，确保每个椎间盘只穿刺一次。
12. 使用直径为 0.25 毫米的缝合线逐层缝合组织。
13. 造模后对穿刺部位进行消毒和包扎。
14. 每天将青霉素肌肉注射到兔的臀大肌中，剂量为每只兔 40,000 U，连续 3 天。
    注:使用规格为 800,000 单位/瓶且批准号为兽药140051251的青霉素。

3. IVDD 模型的选择和结果评估

1. 兔子的死亡率和一般状况评估
   1. 每周观察兔子以确定存活率并记录一般状况，包括精神状态、活动模式、食物和水的摄入量，以及粪便和尿液排出量。
   2. 准确记录观察结果并记录状况的任何变化。
2. 兔子的体重监测
   1. 记录模型建立前后以及组织收集前兔子的体重。
   2. 确保准确记录重量并记录任何重大变化。
3. 放射学评估
   1. 在模型建立前和模型建立后 4 周获得每只白兔的整个腰椎外植体序列的矢状面 1.5T T2 加权磁共振成像。
   2. 观察椎间盘退化的程度。
   3. 使用 Griffith 等人提出的改良 Pfirrmann 分级系统对椎间盘退化进行定量评估¹⁵。让三名独立的盲法放射科医生根据既定标准评估 T2 加权 MRI 序列:椎间盘高度、髓核信号强度和纤维环完整性。
   4. 当差异超过一个年级时，通过共识确定最终成绩。使用标准化的 DICOM 查看软件和校准的显示设置进行所有评估。
4. 组织病理学评估和评分
   1. 使用静脉内过量的戊巴比妥钠建模 4 周后对兔子实施安乐死（遵循机构批准的方案），然后在冰¹⁵ 上快速收获 L2-L3、L3-L4 和 L4-L5 椎间盘。
   2. 将 L2-L3 圆盘固定在 4% 多聚甲醛中，并将剩余样品储存在 -80 °C。
   3. 将固定盘浸入脱钙溶液（如 10% EDTA）中，确保完全浸没。每 2-3 天更换一次脱钙液以保持效果。
   4. 定期监测脱钙过程，直到达到完全脱钙，这可能需要几天到一周的时间，具体取决于椎间盘的大小和厚度。
   5. 用流水彻底冲洗脱钙的椎间盘，以去除脱钙溶液的任何痕迹。
   6. 通过将圆盘浸入一系列分级乙醇溶液中来脱水，从 70% 乙醇开始，逐渐增加到 100% 乙醇。每个等级进行每个脱水步骤 1-2 小时。
   7. 用石蜡（熔点 56-58 °C）浸润脱水的圆盘至少 2 小时，确保完全浸润。
   8. 将浸润的圆盘嵌入蜡块中，定位以进行切片。让蜡块完全冷却并凝固。
   9. 使用切片机将包埋的圆盘切成薄而均匀的切片 （5-10 μm）。将切片贴在载玻片上进行进一步分析，例如组织学染色或免疫组化^12,13。
   10. 进行苏木精和伊红 （HE） 染色，在光学显微镜下捕获图像，并使用 IVD 组织病理学分级量表¹² 分配 HE 染色评分。
5. TUNEL 测定
   1. 对椎间盘组织切片进行脱蜡和再水化，然后进行抗原修复和膜透化。
   2. 以 1:9 的比例加入试剂 1 （TdT） 和试剂 2 （dUTP） 的混合物，并在加湿室中孵育。
   3. 用 PBS 缓冲液洗涤切片，应用 DAPI 染色，并在室温下避光孵育 10 分钟。
   4. 使用全自动全景扫描仪和处理软件捕获图像。
6. 细胞因子检测
   1. 对实验兔实施安乐死（步骤 3.4.1）并从腹主动脉收集血样。
   2. 在 25 °C 下以 2000 × g 离心兔血样 10 分钟，以将血清与血细胞分离。小心收集上清液（血清），确保不包含细胞碎片。
   3. 按照 ELISA 试剂盒中提供的说明检测血清样品中 TGF-β 的表达。
   4. 按照 ELISA 试剂盒中的指示制备试剂和标准品。
   5. 将血清样品添加到 ELISA 板的相应孔中。
   6. 根据试剂盒说明，在推荐的温度和持续时间下孵育板。
   7. 按照说明清洗板以去除未结合的试剂。
   8. 按照试剂盒的方案添加检测抗体和其他必要的试剂。
   9. 再次孵育板指定的时间和温度。
   10. 彻底清洗板以去除多余的试剂。
   11. 将底物溶液添加到孔中，并孵育建议的周期，以便进行显色。
   12. 使用分光光度计在试剂盒说明中指定的波长下测量光密度 （OD）。
   13. 通过将 OD 值代入提供的方程式或使用从已知浓度的标准品浓度生成的标准曲线来计算样品浓度。

4. 统计分析

1. 使用市售软件执行统计分析。
2. 将连续变量表示为平均值±标准差。
3. 使用单因子方差分析可以检验组之间的差值。
4. 应用 LSD 测试进行成对比较。
5. 使用重复测度方差分析来分析重复测度数据。
6. 执行 Spearman 相关性分析以评估变量之间的相关性。
7. 将显著性水平设置为 α = 0.05，并将小于 0.05 的 P 值视为统计显著性。

结果

外科手术无并发症。B 组 （经皮穿刺组） 的 1 只兔子在手术后死亡。所有其他动物术后均恢复正常进食和活动模式，并在整个实验期间存活。手术部位未观察到长时间出血或感染。

死亡率和一般情况评估
A 组和 C 组的死亡率均为 0%，而 B 组的死亡率为 20%（表 1）。A 组兔子表现出正常的一般状况。在建模之前，B 组的兔子表现出与假手术组相似的条件。然而，在建模后的第二天，B 组兔子表现出活力下降、活动减少、喜欢蜷缩在笼子的角落、食物摄入量显着减少、饮水量相对不变、皮毛暗沉、粪便排出量增加和稀便。随着时间的推移，B 组中的一只兔子死亡，而其余的兔子逐渐恢复到建模前的水平。然而，它们的活力、活动、皮毛状况和粪便稠度仍然不如造模前的水平。相比之下，C 组的兔子在建模后的第二周开始，与 B 组的兔子相比，表现出更好的活力、活动、食物摄入量、皮毛光泽度和粪便稠度。

体重评估
建模前所有组的兔子体重相似。然而，在采样之前，B...

讨论

本研究的结果表明，经皮和经腹膜后穿刺方法均能有效诱导兔模型中的椎间盘变性 （IVDD）。值得注意的是，基于对一般情况、死亡率、组织病理学评估、TUNEL 测定和血清 TGF-β 水平的综合评估，经腹膜后穿刺模型导致椎间盘退行性变化更广泛，同时保持较低的死亡率。

手术损伤是建立 IVDD 模型最常用的方法。自从 Lipson 和 Muir （1981） 使用手术刀环切开术¹⁶ 成功开发兔子 IVDD 模型以来，出现了各种损伤技术，包括针刺 12,14,17，^纤维环切除术¹⁸，全椎间盘切除术，部分和全部核切开术 19，髓核穿刺^20,21,22

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.3 T 兽用磁共振成像（MRI）	宁波川山佳	CSJ-MR
酒精医用	LIRCON	20230107
苄基青霉素钾	江西科达动物制药	140051251
止血钳	SHINVA	20211239
注射注射器	CONPUVON	20153151307
刀片	Hons Medincal	20210615
医用吸水棉球	科福	20210006
医用缝合针	上海小艺医疗器械
Medullo 穿刺针	扬州江洲 医疗器械	20190902	用于穿刺腰椎间盘
生理盐水	NeilMed
聚维酮碘溶液	四川艾吉斯医疗科技
微量天平	Explorer
兔子解剖手术台	振华生物医学	ZH-BXT-3Z
剃须刀	AUX
统计分析软件	IBM	SPSS
无菌纱布	Cofoe	20202140675
外科手套	DR.LERSH	20172140028
手术刀	Hons Medinca	20210019
手术镊	SHINVA	20210233
USB-C 数据传输线	KINI
白光摄影显微镜	尼康	Eclipse Ci-L