该方法包括从血清中提取视黄醇，使用高效液相色谱法（HPLC）进行分离，并通过气相色谱-质谱联用法（GC-MS）测定标记与非标记的视黄醇同位素。利用标记与非标记视黄醇的比值来估算体内维生素A的总储存量。
本文内容
摘要
摘要
本方法描述了血清中视黄醇氘代富集度的测定以及体内维生素A储存量的估算。该过程包括使用0.5 mL 0.85%生理盐水溶液、100 µL内标溶液和5 mL氯仿-甲醇（2:1 v/v）溶液从0.4 mL血清中提取视黄醇。经离心并移除下层氯仿相后，将混合物在氮气下干燥，并重新悬浮于0.1 mL乙醇中，随后使用配备PE C18色谱柱的高效液相色谱（HPLC）系统将视黄醇组分与其他成分分离。视黄醇组分可手动或使用馏分收集器收集。随后，将视黄醇组分在氮气下干燥，并用含10%三甲基氯硅烷的O-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）进行衍生化。最后，采用配备19091z-431 HP-1甲基硅氧烷毛细管柱的气相色谱-质谱（GC-MS）系统，以氦气为载气、甲烷为电离试剂，在电子捕获负化学电离模式下对标记与非标记的视黄醇同位素进行定量分析。标记与非标记视黄醇的比值随后用于Olson、Green或质量平衡方程中，以估算体内维生素A的储存量。
引言
维生素A是一种必需营养素，对视觉系统以及细胞功能的维持至关重要，这些细胞功能涉及生长、上皮完整性、红细胞生成、免疫和生殖1。维生素A缺乏是一个全球性的严重公共卫生问题，影响超过100个国家，尤其对低收入国家的幼儿和孕妇影响更为显著。全球约有1.9亿儿童患有维生素A缺乏症，使其成为公共卫生和儿童发育的关键问题2。
针对这一情况，几十年来，许多低收入国家已实施了多项措施，包括为5岁以下儿童每半年补充一次高剂量维生素A，以及对某些食品进行维生素A强化。然而，这些干预措施常常重叠，导致部分人群无意中长期摄入过量的维生素A3,4。维生素A缺乏与过量的双重风险凸显出迫切需要一种生物标志物，能够准确评估从缺乏到中毒整个范围内的维生素A营养状况，以指导项目评估。
维生素A生物标志物对于评估营养状况至关重要。最常用的生物标志物是血清中视黄醇和视黄醇结合蛋白（RBP）的浓度。然而需要注意的是，感染和炎症可能会暂时抑制这些生物标志物的水平，从而在某些人群中降低维生素A评估的特异性5,6,7。
尽管肝活检或尸体解剖样本被认为是评估维生素A营养状况的金标准，但目前最敏感的间接指标是视黄醇同位素稀释法（retinol isotope dilution, RID）8。RID方法可对从缺乏到过量的整个范围内的肝脏总维生素A储备提供定量估计9。在大多数研究应用中，RID方法包括口服给予氘（2H）或13C标记的视黄醇乙酸酯，该标记物在14至21天内与体内储存池混合。在此之后采集血液样本，并将血清储存在-80 °C。随后通过质谱分析标记视黄醇与总视黄醇的比值，以估算维生素A储存量10，并采用Olson公式11、质量平衡方程12或Green公式13进行计算。本文所介绍的方案适用于给予氘（2H）或13C标记的视黄醇乙酸酯，其依据为Tang等人的研究工作14。该方法的总体目标是准确评估和监测体内的维生素A营养状况11。这是一种强大的方法，能够对从缺乏到过量广泛范围内的维生素A浓度提供定量估计15。与其他通常依赖间接指标的方法相比，该方法具有更高的准确性和精确性9。
方案
该方案已获公共卫生部伦理委员会批准（编号：2015/02/550/CE/CNERSH/SP），并已从受试儿童父母或监护人处获得知情同意。
注意：由于维生素A对光敏感，所有操作必须在暗光或金色荧光灯下进行16。所用材料详见材料表。
1. 试剂准备
- 氯化钠溶液（0.85% w/v）：将 0.85 g 氯化钠溶解于 100 mL 容量瓶中的蒸馏水中，加蒸馏水至刻度线，混匀。
- 氯仿-甲醇溶液（2:1 v/v）：用刻度量筒将 300 mL 氯仿转移至 500 mL 容量瓶中，加入 150 mL 甲醇，混匀。
- 高效液相色谱流动相 A：乙腈/四氢呋喃/超纯水（50/20/30, v/v/v）：将 500 mL 乙腈转移至 1000 mL 容量瓶中，加入 200 mL 四氢呋喃和 300 mL 水。混合溶液，用孔径为 0.45 µm 的膜过滤器过滤，并进行超声处理（振幅 100%，频率 40 kHz，时间 15 min）。
- 高效液相色谱流动相 B：乙腈/四氢呋喃/超纯水（50/44/6, v/v/v）：将 500 mL 乙腈转移至 1000 mL 容量瓶中，加入 440 mL 四氢呋喃和 60 mL 水。混合溶液，用孔径为 0.45 µm 的膜过滤器过滤，并进行超声处理。
2. 标准溶液的制备
- 按照表1所示，将40 mg标准品溶于乙醇中，并在100 mL容量瓶中定容至刻度线，充分混匀，配制储备液。
- 稀释储备液的配制：按照表2所示，用移液管将1 mL储备液转移至50 mL容量瓶中，用适当的溶剂定容至刻度线，充分混匀。
- 稀释储备液浓度的测定：取1 mL稀释后的溶液置于石英比色皿中，以乙醇为空白，在分光光度计上于指定波长（见表3）测定其吸光度。使用朗伯-比尔定律17计算浓度。分析前应确保分光光度计已校准：仪器预热15–30分钟，选择所需波长，并将空白溶液放入样品池中调零。使用以下公式计算浓度：
浓度 = (吸光度 / 吸收系数) × 106 (µg/dL)
注：将传统单位（µg/dL）转换为国际单位制（µmol/L）时，需将传统单位数值乘以以下换算因子：全反式视黄醇乙酸酯为0.0304，视黄醇为0.034918。 - 工作标准品的配制：使用容量移液管将2 mL稀释储备液转移至100 mL锥形瓶中，用乙醇定容至刻度线，充分混匀后用塞子密封。
- 为确定各溶液的准确浓度，使用配备C18色谱柱和二极管阵列检测器（设定波长为340 nm）的高效液相色谱仪（HPLC）评估各组分的纯度。根据表4所示程序设定泵流动相A和流动相B的梯度洗脱程序。分析前应校准HPLC系统，验证泵、检测器、自动进样器及整个系统的性能。
- 将1 mL稀释储备液转移至压盖小瓶中，按照常规操作程序注入HPLC系统。使用以下公式计算纯度：
公式1
根据纯度校正结果，计算标准溶液中各组分的准确浓度。
- 内标溶液的配制（视黄醇乙酸酯，光密度OD ~ 0.2）：使用容量移液管将30 mL视黄醇乙酸酯工作标准品转移至100 mL锥形瓶中，用乙醇定容至刻度线，充分混匀后用塞子密封。
- 工作溶液的配制：向非标记视黄醇（20 µg）中分别加入0.00、0.33、1.00、3.33和10.00 µg的标记视黄醇，得到标记与非标记视黄醇的比例分别为0.00、0.0167、0.050、0.167和0.500。
3. 样品分析
注意：本研究中使用的血清样本于第14天采集th 从喀麦隆一项旨在监测和评估儿童维生素A营养状况的研究中，采集了接受口服剂量（2 mg 视黄醇当量）D8-视黄醇的儿童的样本。
- 血清中类视黄醇的提取：该提取方法基于 Folch 等人19 的工作，并经 Tang 等人14 修改。请按照以下步骤操作。
- 在分析前，将冷冻的血清样本在室温（20–25 °C）下缓慢解冻。取 400 µL 血清加入一个 16 × 100 mm 的一次性培养管中，加入 500 µL 0.85% 生理盐水、100 µL 内标物以及 5 mL 氯仿-甲醇（2:1 v/v）溶液。
- 涡旋振荡 30 秒，然后在 4 °C 下以 1157 × g 离心 10 分钟。使用玻璃巴斯德吸管小心地将下层氯仿相转移至一个 13 × 100 mm 的一次性培养管中。在 40 °C 水浴中用氮气吹干，将残留物重悬于 100 µL 乙醇中。涡旋并超声处理 30 秒。将样品转移至带衬管的压盖小瓶中，密封并标记。样品即可用于 HPLC 视黄醇收集。
- 按以下所述进行 HPLC 视黄醇收集。
- 将每份血清样品 70 µL 注入配备 C18 色谱柱和设定在 340 nm 的二极管阵列检测器的 HPLC 系统中。设定泵以 1 mL/min 的恒定流速输送流动相 A 和 B，程序见 表 4。
- 在注入血清样品前，先注入 70 µL 视黄醇工作溶液至 HPLC 系统，记录视黄醇峰的保留时间。然后设置馏分收集器，在带磨口塞的 5 mL 试管中收集在特定时间范围内洗脱的视黄醇馏分。本实验中，视黄醇馏分在 7.5–10.5 分钟之间（共 3 分钟）进行收集。
注意：此步骤也可通过视黄醇标准品的校准曲线及内标物回收率计算视黄醇浓度。
- 按以下所述进行视黄醇的衍生化。
- 将 HPLC 收集的视黄醇馏分在 40 °C 水浴中用氮气吹干至少 3 小时。加入乙醇以促进干燥过程中水分的蒸发（样品必须完全干燥，因衍生化对水分敏感）。向管中加入 20 µL 含 10% TMCS 的 BSTFA。
- 将管置于设定为 70 °C 的干式金属浴中，孵育 30 分钟。使用玻璃巴斯德吸管将反应混合物转移至带衬管的压盖小瓶中，用压盖器密封，标记。样品现已准备好用于 GC/MS 分析，可暂存于 4 °C 干燥器中直至分析。
- 此外，将一组 100 µL 的工作标准溶液同样吹干并按上述方法进行衍生化，用于 GC/MS 校准。
注意：使用 BSTFA 对视黄醇进行衍生化时，视黄醇的羟基（-OH）被三甲基硅基（-Si(CH3)3）取代，生成视黄醇三甲基硅醚。该过程提高了视黄醇的挥发性和稳定性，使其更适用于 GC/MS 分析20。
- GC/MS 分析：采用 Tang 等人14 描述的方法进行 GC/MS 分析。请按以下步骤操作。
- 使用自动进样器将 3 µL 衍生化后的视黄醇样品注入气相色谱仪，进样口为冷柱头进样，通过零死体积连接器连接一根 15 m × 0.25 mm 内径的熔融石英毛细管柱，固定相为 DB-1，膜厚 0.25 µm。
- 设定色谱柱温箱和柱头进样口温度从 50 °C 升至 285 °C，升温速率为 15 °C/min，设定 GC/MS 接口温度为 285 °C。使用氦气作为载气，约 12 分钟内洗脱视黄醇的三甲基硅基衍生物。
- 使用四极杆质谱仪在 0.5 torr 甲烷负离子化学电离模式下检测 GC 洗脱物，离子源温度设为 150 °C。设定质谱仪在 260 至 280 道尔顿范围内扫描。
4. 数据分析
- 使用气相色谱-质谱（GC/MS）数据分析软件。
- 根据质荷比（m/z）提取所有目标离子，对峰面积进行积分（可采用手动积分方式调整峰的起始点和终止点），并将结果导入电子表格文件。
注意：根据所使用的同位素，目标离子的 m/z 范围如下：内源性视黄醇为 268–270 m/z；[2H4]标记视黄醇为 271–274 m/z；[13C]标记视黄醇为 278–280 m/z；[2H8]标记视黄醇为 276–280 m/z。 - 通过加和 m/z 274、275、276、277 和 278 处的峰面积，计算标记视黄醇的峰面积总和（ΣD）；通过加和 m/z 268、269 和 270 处的峰面积，计算未标记视黄醇的峰面积总和（ΣH）。
- 使用以下公式计算标记视黄醇的富集度（D）：D = ΣD/(ΣH + ΣD)。使用以下公式计算未标记视黄醇的含量（H）：H = 1 - D。
注意：视黄醇三甲基硅醚采用气相色谱-电子捕获负化学电离质谱分析时，不产生分子离子峰，但会产生主要碎片离子峰：未标记视黄醇在 m/z 268 至 271 处，D4-视黄醇在 m/z 272 至 275 处，D8-视黄醇在 m/z 276 至 280 处14。 - 为控制系统的准确性，计算校准标准品的质量比与标记视黄醇及非标记视黄醇积分峰面积之间的线性回归方程。
5. 维生素A储存量的估算
注意：此步骤可用于评估个体的维生素A营养状况。
- 使用 Olson 公式计算维生素 A 总肝储量11
维生素 A 总肝储量 = F × 剂量 × [S × a × (H/D - 1)]
其中 F 为口服给予剂量的吸收与储存效率系数（F = 0.50），剂量为口服给予的标记维生素 A 量（µmol），S 为校正血浆与肝脏中标记与非标记视黄醇比例不等的系数（S = 0.65），a 为校正标记维生素 A 在混匀期间不可逆丢失的系数；具体而言，a = e-kt，其中 k 为估计的系统性分数分解速率（儿童中 k = ln 2/32 天），t 为自给药以来的时间（以天为单位）；D/H 为血清中标记与非标记视黄醇的同位素比值，减 1 是为了校正所给予的标记维生素 A 剂量对体内总维生素 A 池的贡献。 - 计算维生素 A 总体储量（TBS）时，使用 Green 公式13
TBS = Fa × S × (1/SAp)
其中 Fa 为在时间 t 时，口服标记剂量的维生素 A 被吸收并存在于体内可交换储存池中的分数，S 为在时间 t 时血清中视黄醇特异性活性与储存库中特异性活性的比值（对于儿童，在 14 天时 Fa × S = 0.642）21。SAp 为血清中剂量分数每 µmol 剂量（即：血清中[标记视黄醇] /（[未标记 + 标记视黄醇]）除以口服给予的标记视黄醇剂量（µmol））。
结果
将含有约 50 pM/µL 校准物（视黄醇和 D8-视黄醇）的干燥溶液的衍生化样品 3 µL 注入气相色谱/质谱仪（GC/MS）后，未检测到分子离子，但在 m/z 268 处出现视黄醇的主要碎片离子（图 1），在 m/z 278 处出现 D8-视黄醇的主要碎片离子（图 2）。这表明在视黄醇和 D8-视黄醇衍生化过程中生成的视黄基三甲基硅醚分子离子，在GC/MS所用的电离条件下不稳定，会断裂为更小的碎片，主要通过α裂解途径。这种常见的裂解模式涉及与三甲基硅醚基团相邻的化学键断裂。α裂解导致失去三甲基硅基团（TMS，分子量为 73 Da）和一个氢原子，从而生成视黄醇的 268 Da 碎片离子和 D8-视黄醇的 278 Da 碎片离子22。该机制有助于通过分析质谱过程中产生的特定碎片离子，鉴定并确认样品中视黄醇及其衍生物的存在。注入视黄醇与 D8-视黄醇的混合物后，在 m/z 268（视黄醇）和 m/z 276（D8-视黄醇）处观察到两个主要碎片离子（图 3），表明样品中存在这些化合物。校准曲线表现出优异的线性关系，相关系数较高（图 4），表明峰面积比与质量比之间具有非常直接且可预测的关系。
对血清样本（接受口服2 mg维生素A当量D8-视黄醇的儿童血清）进行进样后获得的GC/MS响应（图5）显示存在视黄醇和D8-视黄醇，其中两个主要碎片离子的质荷比（m/z）分别为268和274。在提取D8-视黄醇的m/z 274、275、276、277和278离子以及未标记视黄醇的m/z 268、269和270离子并积分其峰面积后所得结果见表5。这些数据可用于Olson方程11或Green方程13，以计算体内维生素A储存量。
稳定同位素稀释技术可提供其他方法无法获得的维生素A水平测定结果，从而实现对维生素A营养状况的准确评估。该方法在营养学研究、临床诊断和流行病学研究中具有重要价值。
图1：视黄醇的色谱图与质谱图。该图显示了衍生化视黄醇标准品经气相色谱/甲烷电子捕获负化学电离-质谱法分析所得的色谱图（上图）。下图为视黄醇的质谱图，显示 m/z 268。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：D8-视黄醇的色谱图与质谱图。 该图显示了衍生化D8-视黄醇标准品分析所得的气相色谱/甲烷电子捕获负化学电离质谱色谱图（上图）。下图为D8-视黄醇的质谱图，显示m/z 278。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：视黄醇与D8-视黄醇混合物的色谱图和质谱图。该图显示了衍生化的视黄醇与D8-视黄醇标准品混合物经气相色谱/甲烷电子捕获负化学电离-质谱法分析所得的色谱图（上图）。下图为质谱图，显示视黄醇的m/z为268，D8-视黄醇的m/z为276。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：校准曲线。 本图展示了气相色谱-质谱（GC/MS）响应与未标记及标记视黄醇浓度之间的关系。该关系由方程 y = 9.8379x + 0.7019 描述，其中 y（面积比）代表仪器响应，9.8379 为灵敏度，x（重量比）代表分析物浓度，0.7019 为背景信号。请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：血清样品的色谱图与质谱图。 本图展示了对衍生化后血清中视黄醇组分进行分析所得的气相色谱/甲烷电子捕获负化学电离-质谱法色谱图（上图）。下图为质谱图，显示 D8-视黄醇在 m/z 274 处的信号。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 标准品 | 重量 (mg) | 容量瓶 (mL) | 溶剂 |
| 视黄醇 | 40 | 100 | 乙醇 |
| 视黄醇乙酸酯 | 40 | 100 | 乙醇 |
| 氘代标记的视黄醇乙酸酯 | 40 | 100 | 乙醇 |
表1：储备液的配制。 本表展示了如何配制视黄醇和氘标记的视黄醇乙酸酯的浓缩溶液，这些储备液可进一步稀释至较低浓度，用于后续实验。
| 标准品 | 储备液 (mL) | 容量瓶 (mL) | 溶剂 |
| 视黄醇 | 1 | 50 | Ethanol |
| 视黄醇乙酸酯 | 1 | 50 | Ethanol |
| 氘标记视黄醇乙酸酯 | 1 | 50 | Ethanol |
表2：稀释标准溶液的配制。 本表展示了如何配制即用型视黄醇和氘标记的视黄醇乙酸酯溶液。
| 标准品 | 波长 (nm) | E1%1 cm |
| 视黄醇 | 325 | 1850 |
| 醋酸视黄酯 | 326 | 1550 |
表3：波长与E1% 1 cm（吸收系数）。
| 时间（min） | 流速（mL/min） | 流动相 A（%） | 流动相 B（%） |
| 0 – 6 | 1 | 100 | 0 |
| 6 – 13 | 1 | 100 → 50 | 0 → 50 |
| 13 - 18 | 1 | 50 | 50 |
| 18 - 20 | 1 | 50 → 0 | 50 → 100 |
| 20 - 28 | 1 | 0 | 100 |
| 28 - 29 | 1 | 0 → 100 | 100 → 0 |
表4：高效液相色谱流动相的时间安排。 本表展示了高效液相色谱分析过程中不同阶段的预定顺序和持续时间。
| SH | SD | D | H | |
| 受试者 1 | 64030809 | 566089.7 | 0.008763 | 0.991237 |
| 受试者 2 | 194354 | 43861.39 | 0.184125 | 0.815875 |
| 受试者 3 | 793490 | 80179.28 | 0.091773 | 0.908227 |
| 受试者 4 | 2002063 | 45286.7 | 0.02212 | 0.97788 |
| 受试者 5 | 80999193 | 355980.7 | 0.004376 | 0.995624 |
| 受试者 6 | 32196717.7 | 216152.7 | 0.006669 | 0.993331 |
| 受试者 7 | 40905724.5 | 334818.1 | 0.008119 | 0.991881 |
| 受试者 8 | 28336711.5 | 218924.1 | 0.007667 | 0.992333 |
| 受试者 9 | 8695135.5 | 542077 | 0.058684 | 0.941316 |
| 受试者 10 | 103260212 | 1717728 | 0.016363 | 0.983637 |
| SH：m/z 268、269 和 270 处峰面积之和 | ||||
| SD：m/z 274、275、276、277 和 278 处峰面积之和 | ||||
| D：标记视黄醇的富集度 | ||||
| H：未标记视黄醇的水平 |
表5：血清中衍生化视黄醇组分的气相色谱-质谱（GC/MS）分析结果。 本表列出了用于计算维生素A总储存量所需的气相色谱-质谱（GC/MS）输出数据。H为质荷比（m/z）268、269和270处峰面积之和；D为质荷比（m/z）274、275、276、277和278处峰面积之和；D表示标记视黄醇的富集度；H表示未标记视黄醇的水平；TBS表示维生素A总储存量。
讨论
成功实施本方案依赖于每一步骤的有效执行。正确配制溶液和标准品对于确保所收集数据的准确性和可靠性至关重要。本方案中描述的步骤已在不同条件下经过测试，适用于获得符合样品分析目标的溶液和标准品。
样品分析首先从血清中提取和分离视黄醇开始。为防止维生素A降解，血清样本必须在分析前保存于-80 °C条件下。此外，操作过程需在弱光环境中进行16。用于收集视黄醇组分的高效液相色谱（HPLC）程序旨在将视黄醇与其他脂溶性成分分离，以避免在衍生化过程中产生干扰。该方法还允许连续运行数百个样品而无需冲洗色谱柱。
从HPLC收集的视黄醇组分在70 °C下与BSTFA反应30分钟进行衍生化。该衍生化步骤对于提高视黄醇的挥发性及其在GC-MS中的可检测性至关重要。由于该反应对水分敏感，因此在衍生化前必须将样品完全干燥，并在GC-MS分析前留出足够时间以确保衍生化反应充分进行。研究发现，与使用N-甲基-N-(叔丁基二甲基硅基)三氟乙酰胺（MTBSTFA）的方法相比，BSTFA的衍生化过程更为温和且高效23,24，所得衍生化视黄醇的色谱峰非常尖锐，在扫描的质量范围内无拖尾或背景峰干扰14。密封小瓶中的衍生化视黄醇可在4 °C的干燥器中保存1个月而不发生降解14。
进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析时，必须确保色谱柱的正确校准与维护，并优化进样体积、温度和载气流速。本研究中采用柱上进样的条件获得了良好且可靠的结果14。Tang 等人14在对氘代和非标记视黄醇进行 GC-MS 分析时发现，氘代视黄醇的峰不仅出现在给药剂量中，也出现在接受该剂量的受试者血清中，而这一现象在非标记视黄醇中未观察到。因此，他们得出结论：氘代视黄醇的峰是在给药剂量中预先形成的，而非质谱仪中发生碎片化所致，这表明氘代视黄醇在代谢过程中保持其结构完整性，可作为在生物学研究中追踪视黄醇的可靠标记物。在学龄前儿童中给予 2 mg D8-视黄醇后，血清中氘代视黄醇的富集程度从 7 小时开始上升，并在 14 天时达到峰值，此为较短的最佳采样时间点25。在 200 µL 人血清样本中，视黄醇最低可检测富集百分比为 0.01%，表明该方法具有足够灵敏度，可用于分析来自不同维生素 A 营养状况受试者的血清样本14。
尽管本文介绍的稳定同位素稀释技术在评估维生素A营养状况方面具有显著优势，但应注意，该方法需要复杂的仪器设备和技术专业知识，导致成本较高，且在许多情况下难以常规应用26。因此，在计划使用该技术时，必须充分考虑这一局限性。
披露
本手稿属于国际原子能机构（IAEA）资助的系列研究，题为“利用视黄醇同位素稀释法评估维生素A体内储存量及肝脏维生素A浓度”。
致谢
我们在美国波士顿塔夫茨大学让·梅耶美国农业部老年人营养研究中心的类胡萝卜素与健康实验室进行研修期间，师从汤光文教授，并在国际原子能机构（IAEA）的资助下，学习了本实验方案。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 13x100 mm 一次性培养管 | 99445-13 | PYREX 一次性无边培养管 | |
| 16x100 mm 一次性培养管 | 99445-16 | PYREX 一次性无边培养管 | |
| 24 位氮吹仪 氮气吹干仪 | Organomation Associates, Inc | 11250 | N-EVAP 112 氮吹仪，配备 OA-SYS 加热系统 |
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | 00687 | 乙腈，适用于高效液相色谱，梯度级 ≥99.9% |
| 琥珀色压盖小瓶，2 mL | SU860033 | 短螺纹自动进样瓶，棕色瓶，11.6 × 32 mm | |
| 分析天平 | Mettler Toledo | 30133525 | 精密天平 MS303TS/00 |
| C18柱 | Perkin-Elmer Inc | 2580195 | Brownlee Pecosphere RA C18 柱 - 33 mm x 4.6 mm 内径，每包 5 根 |
| 压盖钳 | MilliporeSigma | Z114243 | 手动铝制瓶盖压盖器，外径 20 mm |
| 毛细管柱 | J & W Scientific | 122-1011 | 15 m × 内径0.25 mm、涂有0.25 mm膜厚DB-1固定相的熔融石英毛细管柱 |
| 离心 | Sigma 3-18KS | ||
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 528730 | 氯仿，HPLC 级， ≥ 99.9% |
| 锥形瓶：100 mL， | 4980016 | 硼硅酸盐刻度锥形瓶，耐热硼硅酸盐玻璃 | |
| 带聚四氟乙烯（PTFE）密封垫的压盖帽 | Supelco | 27455-U | 使用聚四氟乙烯/硅胶隔垫压盖密封 |
| D8-视黄醇乙酸酯 | Cambridge Isotope Laboratories Inc. | DLM-2244-PK | 维生素A醋酸酯 3-4% 顺式 (10, 14, 19, 19, 19, 20, 20, 20-D8, 90%) |
| 1-10 mL 分液器 | Gilson | F110103 | DISPENSMAN 瓶口分配器 |
| 干式加热块 | 资助 | Grant QBH2 高性能数字干浴加热器 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 459844 | 乙醇，纯品 ≥ 99.5%，ACS 试剂，200 纯度 |
| 气相色谱-质谱联用 | 安捷伦 | 配备5975C惰性XL EI/CI MSD/DS Turbo CI系统的Agilent 7890 A系列气相色谱仪与5975C质谱系统，包含7693A自动进样器、转移转塔和7693样品托盘 | |
| 带玻璃塞的容量瓶： 2000 mL | 956854 | 品牌 BLAUBRAND 容量瓶，玻璃塞，透明玻璃 | |
| 带玻璃磨口塞的容量瓶：100 mL | 956849 | 品牌 BLAUBRAND 容量瓶，玻璃塞，透明玻璃 | |
| 带玻璃塞的容量瓶：1000 mL | 956853 | 品牌 BLAUBRAND 容量瓶，玻璃塞，透明玻璃 | |
| 带玻璃磨口塞的容量瓶：25 mL | 956841 | 品牌 BLAUBRAND 容量瓶，玻璃塞，透明玻璃 | |
| 带玻璃塞的容量瓶：50 mL | 956847 | 品牌 BLAUBRAND 容量瓶、玻璃塞、透明玻璃 | |
| 带玻璃塞的容量瓶：500 mL | 956852 | 品牌 BLAUBRAND 容量瓶，玻璃塞，透明玻璃 | |
| 氦气（最高纯度） | Air Liquide | UN 1046 氦气压缩气体，2.2类 | |
| 高效液相色谱法 | Varian | Varian 940LC 高效液相色谱仪，配有馏分收集器 | |
| 压盖小瓶用内插管，5 mm，175个 μL, | AR0-4521-12 | Verex 插入器，5 mm 直径，175 µl，透明，锥形底部，带底部弹簧 | |
| 量筒：100 mL | 213902402 | DURAN 量筒，带六角底座，A 级 | |
| 量筒：250 mL | 213903604 | DURAN 量筒，带六角底座，A 级 | |
| 甲烷（最高纯度） | Air Liquide | UN1971 压缩甲烷，2.1类 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860 | 甲醇，适用于高效液相色谱 ≥ 99.9% |
| N, O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺（BSTFA）含10%三甲基氯硅烷（TMCS） | Thermo Scientific | 043939.22 | |
| 氮气 | 由 Parker Balston NitroVap 发生器制备 | ||
| 巴斯德吸管，玻璃 | 13-678-20A | Fisherbrand 一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管 | |
| 石英玻璃比色皿 | EW-83301-12 | Cole-Parmer 标准单石英比色皿 | |
| 视黄醇 | Sigma-Aldrich | 17772 | ≥95.0%（HPLC），约2700 U/mg |
| 视黄醇乙酸酯 | Sigma-Aldrich | R0635 | 分析纯级 |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S9888 | 氯化钠，ACS 级试剂， ≥ 99.0% |
| 分光光度计 | 岛津 | Uvmini-1240 紫外-可见分光光度计 | |
| 四氢呋喃 | Sigma-Aldrich | 439215 | 四氢呋喃，HPLC级， ≥ 99.9%，无抑制剂 |
| 超声波清洗机 | Bransonic | CPX-952-339R | Branson CPX Bransonic 超声波清洗机 |
| 移液管：100-1000 微升 µL | 3123000063 | Eppendorf 单通道微量移液器，配 T.I.P.S. Box 2.1 | |
| 移液管：20-200 微升 µL | 3123000055 | Eppendorf 单通道微量移液器，配 T.I.P.S. Box 2.0 | |
| 涡旋混合器 | Ika | Vortx Genius 3 |
参考文献
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