用于单个内溶酶体囊泡分析的膜片钳技术

Summary

该协议详细介绍了一种使用手动溶酶体膜片钳系统直接测量细胞内囊泡上离子通道活性的方法。我们说明了涉及扩大内溶酶体和手动分离这些囊泡的方法。这种方法确保研究人员可以准确地复制和应用该程序。

Abstract

内溶酶体离子通道对于内溶酶体离子和 pH 稳态、膜电位调节和囊泡运输至关重要。然而，通过电生理学方式访问细胞内小囊泡内的这些通道一直是一个挑战。溶酶体内溶酶体膜片钳技术的发展有助于克服这一障碍，允许直接测量内溶酶体膜中的离子通道活性。

与现有的平面膜片钳技术相比，内溶酶体膜片钳可以同时记录多个细胞，并可轻松与其他测量方法结合使用。手动作具有可视化目标囊泡的优势。它还解决了溶酶体膜一侧 Ca²⁺ 不可或缺的存在限制，增加了实验设计的灵活性。利用内溶酶体膜片钳技术可以直接测量和分析内溶酶体内的离子通道活性。

鉴于异常的内溶酶体离子通道功能与神经退行性疾病和代谢紊乱等疾病之间的密切联系，研究和调节这些通道可能会揭示新的药物靶点。通过恢复细胞内离子平衡，我们可以缓解或治愈相关疾病。因此，这项技术对于发现新的药物靶点和开发相关药物至关重要。

Introduction

离子通道在许多生理过程中起着至关重要的作用。虽然表面离子通道受到了极大的关注，但细胞内通道的重要性，尤其是内溶酶体内的通道，正逐渐得到认可。内溶酶体系统由专门用于基本细胞功能的多功能膜结合细胞器组成，包括回收内体 （RE）、早期内体 （EE）、晚期内体 （LE）、溶酶体 （LY） 以及具有内溶酶体和其他区室特征的杂交细胞器，例如吞噬体和自噬体。

EE，也称为分选内体 （SE），是从质膜 （PM） 内化的材料的早期目的地之一。EE 是负责将货物分类为各种内吞途径的关键隔室，例如到 LE/LY 进行降解的成熟途径、返回 PM 的快速回收途径以及涉及回收隔室或外周 RE 的缓慢回收途径。源自内体的多泡体 （MVB） 是被限制膜包围的球形隔室，该限制膜可以充满腔内囊泡 （ILV）¹。为了维持这些细胞器的正常功能，它们需要膜离子通道来调节囊泡 pH 值、渗透压和信号转导。然而，测量这些渠道的活动并不简单。

对于位于质膜上的离子通道，1970 年代开发的膜片钳技术长期以来一直是金标准方法²。然而，在小细胞内囊泡内通过电生理途径进入通道仍然是一个挑战。将测量质膜上离子通道的金标准应用于细胞内细胞器上的离子通道面临三个主要挑战。首先，内溶酶体的大小通常非常小（直径小于 1 μ....

Protocol

1. 仪器设置

1. 硬件
   注意:有关标准电生理学装置设置，请参见 图 1 。
   1. 使用工作台和法拉第笼保护装置免受外部干扰。
   2. 使用带有显微作器的倒置显微镜稳定定位微电极。
   3. 设置一个放大器来收集和放大采集的信号。
   4. 使用数字化器将模拟信号转换为数字信号。
   5. 使用数据采集和分析软件设置实验方案，并从收集的数据中提取有意义的可分析结果。
2. 电极
   1. 使用两个电极:一个浴电极和一个移液器电极。
      注:铂和氯化银具有最佳的极化特性。氯化银电极由经过氯化物处理的银丝或颗粒组成，因此在金属丝或颗粒的外表面具有 AgCl 层（图 2）。
3. 移液器制备
   1. 拉
      1. 将毛细管安装到拉拔器中。
         注:以下用于移液器制造的参数是特定于仪器的。我们在本文中使用的仪器在 Table of Materials 中提到。
      2. 在不烧坏加热器灯丝的实验条件（室温 22 °C、通孔加热器灯丝、带灯丝的硼硅酸盐玻璃）下，对拉拔....

Results

下面描述了在溶酶体膜片钳实验中观察到的当前形状。如果当前形状与预期不符，则可能是由于接触不良或泄漏。如果参比电极未与浴液完全接触或移液器电极即将断裂，则可能会出现接触不良。如果腔室和盖玻片之间存在间隙，允许液体流到物镜或载物台上，则可能会发生泄漏;移液器溶液过多或过少也可能导致此类异常。

针头插入溶液/针头接触细胞表面/ZAP
在溶酶体连接模式（gigaseal 形成）建立期间，电流响应迅速降低。密封电阻可以通过将指令电压除以少量剩余电流来确定（图 7）。

斜坡/泄漏
重复施加 -100 mV 至 +100 mV 的连续输入电压可以记录随着时间的推移通过内溶酶体膜的电流（图 8）。使用标准溶液时，细胞器内部和外部的离子组成不同。如果通道表现出选择性，则由于流入和流出的离子的磁导率不同，电流-电压曲线的交点不会为零.......

Discussion

电生理实验装置有四个主要的实验室要求:i） 环境:保持样品健康的方法;ii） 光学:可视化样品的方法;iii） 力学:稳定定位微电极的方法;iv） 电子学:放大和记录信号的方法。

为了成功进行溶酶体膜片钳实验，几个关键步骤至关重要。首先，细胞的状况 - 细胞必须紧紧粘附在盖玻片上，以便当使用分离移液器破坏细胞时，整个细胞不会移动。确保细胞健康且分布良好很重要。如果细胞不能固定到位，则在盖玻片上切换到适当的涂层可能会有所帮助。此外，还需要监测细胞密度。当细胞密度过高（大于 90%）时，药物诱导的细胞器增大的有效性会降低，使实验难以进行。其次，膜片移液管的质量——膜片移液管吸头必须具有合适的尺寸（5-8 MΩ），两侧玻璃应光滑平行。

第三，在巨印形成过程中，如果释放正压后没有立即形成，施加适量的负压会有所帮助。但是，一旦 gigaseal 形成，必须立即释放负压，以避免整个囊泡被吸入移液器的风险。此外，在进行全溶酶体膜片钳时，需要破裂一小部分膜。由于内溶酶体中缺乏.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
硼硅酸盐玻璃	萨特仪	BF150-75-10	外径：1.5 mm，内径 0.75 mm 10 cm 长，带灯丝
Digidata 1140A	Axon Instruments
倒置显微镜 IX73	奥林巴斯
P-97 型微量移液器拉拔器	萨特仪器
MPC-200	萨特仪器
MultiClamp 700B	Axon Instruments
机
快速释放腔室	Warner 仪器	641943	QR-40LP，用于 25 mm 盖玻片