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方法文章

单个内吞溶酶体囊泡分析的膜片钳技术

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DOI：

10.3791/67519

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2025年4月4日

 , 
1Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital

本文内容

摘要

本方案详细介绍了一种利用手动内体-溶酶体膜片钳系统直接测量细胞内囊泡中离子通道活性的方法。我们阐述了该方法的具体步骤，包括扩大内体-溶酶体并手动分离这些囊泡。此方法可确保研究人员能够准确地重复并应用该实验流程。

摘要

内体-溶酶体离子通道对于内体-溶酶体的离子和pH稳态、膜电位调控以及囊泡运输至关重要。然而，通过电生理学方法记录这些位于小型细胞内囊泡中的离子通道一直存在技术挑战。内体-溶酶体膜片钳技术的发展在克服这一障碍方面发挥了关键作用，使得能够直接测量内体-溶酶体膜上离子通道的活性。

与现有的平面膜片钳技术相比，内体-溶酶体膜片钳技术能够同时记录多个细胞，并且易于与其他测量方法结合。手动操作具有可直观识别靶向囊泡的优势，同时解决了内体-溶酶体膜一侧必须存在Ca2+的局限性，从而提高了实验设计的灵活性。利用内体-溶酶体膜片钳技术，可直接测量和分析内体-溶酶体内部离子通道的活性。

鉴于异常的内体-溶酶体离子通道功能与神经退行性疾病和代谢紊乱等疾病密切相关，研究和调控这些通道可能揭示新的药物靶点。通过恢复细胞内离子平衡，我们或许能够缓解或治愈相关疾病。因此，该技术对于发现新的药物靶点以及开发相关药物至关重要。

引言

离子通道在多种生理过程中发挥着关键作用。尽管细胞表面的离子通道已受到广泛关注，但细胞内通道的重要性，尤其是内体-溶酶体系统内的通道，正逐渐得到认可。内体-溶酶体系统由多种多功能的膜结合细胞器组成，专门负责基本的细胞功能，包括回收内体（RE）、早期内体（EE）、晚期内体（LE）、溶酶体（LY），以及兼具内体-溶酶体与其他区室特征的杂合细胞器，如吞噬体和自噬体。

早期内体（EE），也称为分选内体（SE），是来自质膜（PM）内吞物质的早期归宿之一。EE 是关键的细胞器区室，负责将货物分选至不同的内吞途径，例如向晚期内体/溶酶体（LE/LY）成熟的降解途径、快速再循环途径返回质膜（PM），以及涉及再循环区室或外周再循环内体（RE）的慢速再循环途径。由内体衍生的多泡体（MVB）是由限界膜包裹的球形区室，其内部可含有大量腔内小泡（ILVs）1。为了维持这些细胞器的正常功能，需要膜离子通道来调节囊泡内的 pH、渗透压以及信号转导。然而，检测这些通道活性并不容易。

对于位于质膜上的离子通道，20世纪70年代发展起来的膜片钳技术长期以来一直是金标准方法2。然而，通过电生理学手段检测小细胞内囊泡中的通道仍是一个挑战。将用于质膜离子通道检测的金标准技术应用于细胞内细胞器时面临三个主要难题。首先，内溶酶体通常非常小（直径小于1 µm），在显微镜下难以观察和分离，且其尺寸小于典型玻璃微电极的开口直径，导致实验无法进行。其次，从靶细胞中直接分离内溶酶体并同时保持细胞器完整性需要特殊的技术。第三，由于细胞内细胞器缺乏细胞骨架，难以在膜片电极内与内溶酶体膜形成高阻封接，并进一步破裂以实现全内溶酶体构型，因为这会破坏细胞器的结构完整性3。

已开发出多种方法以解决上述问题，包括脂质双层记录技术、修饰溶酶体靶向序列以及基于固相支撑膜的电生理学（SSM 或 SSME）技术。脂质双层记录法通过将纯化的离子通道重建于合成磷脂膜中，可在受控条件下对膜蛋白功能进行详细的电生理学研究4,5。修饰离子通道上的溶酶体靶向序列，则是将内溶酶体离子通道重定向至细胞膜，以便利用传统的膜片钳技术进行检测6。基于固相支撑膜的电生理学（SSM 或 SSME）技术，也称为内溶酶体平面膜片钳法，采用带有微小孔径（<1 µm 直径）的固体基底平面玻璃芯片，该芯片为微结构化的平面硼硅酸盐玻璃芯片。这种带微孔的玻璃芯片结合压力-吸力控制系统（Nanion），可实现对微小甚至天然内溶酶体的分析。然而，在前两种方法中，离子通道并不处于其天然的生理环境。将溶酶体通道表达于细胞膜上或重建至脂质双层中进行记录的尝试，大多产生了不确定且相互矛盾的结果。

尽管平面膜片钳技术已有效解决了人为干扰问题，并具有高通量测量的优势，但其所使用的溶液仍受到该方法的限制。本文介绍的内体-溶酶体膜片钳技术可同时记录多个细胞，并易于与其他测量方法联用。手动操作提供了可视化靶向囊泡的优势，同时克服了内体-溶酶体膜一侧溶液中不可避免的Ca2+限制，从而提高了实验设计的自由度3。近年来，内体-溶酶体膜片钳技术在药物研发研究中发挥了关键作用。例如，在神经退行性疾病领域，该技术已帮助识别出靶向阿尔茨海默病和帕金森病相关内体-溶酶体离子通道的新药7,8。研究人员还可利用该技术探索内体-溶酶体离子通道在肿瘤细胞中的作用9，进而调控肿瘤的生长与增殖。在代谢性疾病方面，内体-溶酶体膜片钳研究正在揭示可调节内体-溶酶体离子通道的化合物，为糖尿病和肥胖症提供新的治疗策略。内体-溶酶体膜片钳技术有助于理解内体-溶酶体功能障碍并发现潜在的治疗方法6，显著加深了我们对内体-溶酶体离子通道功能的认识，推动了新药物靶点的发现。

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方案

1. 仪器设置

  1. 硬件
    注意：参见 图1 用于标准电生理实验装置的设置。
    1. 使用实验台和法拉第笼屏蔽装置，以避免外部干扰。
    2. 使用带有显微操作仪的倒置显微镜以稳定定位微电极。
    3. 设置放大器以采集并放大所获取的信号。
    4. 使用数字化仪将模拟信号转换为数字信号。
    5. 使用数据采集与分析软件来建立实验方案，并从采集的数据中提取有意义且可分析的结果。
  2. 电极
    1. 使用两个电极：浴电极和移液管电极。
      注意：铂和氯化银具有最佳的极化特性。氯化银电极由经过氯化处理的银丝或银粒制成，因此在银丝或银粒的外表面形成一层AgCl。图2).
  3. 移液管准备
    1. 拉伸
      1. 将毛细管安装到拉制仪中。
        注意：以下用于拉制移液管的参数是仪器特异性的。本文所使用的仪器已在文中提及 材料表.
      2. 在不会烧断加热丝的实验条件下（室温 22 ˚C，通透式加热丝，含加热丝的硼硅酸盐玻璃），在拉制仪上运行 RAMP 测试以确定 热值 （热能）熔化玻璃毛细管所需的热量。
      3. 使用六个独立的拉制循环设计一个新的拉制程序 热，速度 （VEL），以及 时间 （时间）参数（表1).
        注意： HEAT 指加热加热器灯丝的参数，使玻璃灯丝熔化。 速度 表示拉伸仪在两个方向上拉伸细丝的速度。 时间 表示每个循环之间的时间间隔的持续时间。
      4. 按下绿色按钮 拉 键盘上的按钮。
      5. 松开夹紧旋钮，将移液管从拉制仪上取下。
      6. 在显微拉针仪的目镜下检查移液管尖端，以确定尖端直径、锐度和几何形状。确保尖端直径为0.5–0.9 µm。
        注意：随着灯丝使用频率的增加，熔化玻璃毛细管所需的热量值会发生变化。
      7. 如果尖端尺寸不符合预期，可调整 HEAT 和 VEL 参数。较高的温度和较快的速度将产生更细、更长的尖端， 反之亦然. 调整 HEAT 逐步 5度 和 速度 逐步 3.
    2. 抛光
      1. 将拉制好的膜片电极放入显微操作仪的电极 holder 中。
      2. 使用35倍物镜（配合15倍目镜，总放大倍数为 525x 放大倍数）。
      3. 使用显微操作仪将记录电极移至纤维附近。
      4. 设置 温度 调节至 80.
      5. 使用脚踏开关打开加热器并进行短暂加热 热脉冲 (1 - 2 秒），通过显微操作仪目镜监测抛光过程。
      6. 重复该过程，直至所有移液器均被抛光。
      7. 将已完成的移液管放入密封盒中，以防止灰尘进入。
        注意：目标是快速熔化尖端，使玻璃重新成型为最终的尖端几何形状，但不要过于尖锐。这可以防止移液管刺破其接触的囊泡膜，从而有效促进封接的形成。最终抛光后，移液管尖端的内径应非常狭窄、笔直且呈线性。
        最佳的记录电极通常具有一个 电阻 的 5 - 8 MΩ 经火焰抛光后。 尖端开口直径 应为 2 µm一个打磨完美的膜片电极对于成功形成吉欧封接至关重要，因为这是决定该实验成功的关键技术之一。

2. 样品制备

  1. 细胞培养（以 HEK293 为例）
    1. 将细胞置于标准的加湿培养箱中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。
    2. 在低糖 DMEM 培养基中培养 HEK293 细胞，培养基中添加 10% 热灭活胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素。
    3. 将经多聚-L-赖氨酸包被的 12 mm 盖玻片放入 24 孔板中。
  2. 细胞器 enlargement（增大）
    1. 向 24 孔板中的 HEK293 细胞（来自步骤 2.1）加入 1 µM vacuolin-1，并在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜，直至形成增大的囊泡。
      注：增大的内溶酶体的大小可达 1–10 µm，具体尺寸取决于所用工具、化合物、孵育时间及细胞类型（图 3 和 表 2）。
  3. 溶液配制
    注：标准溶液的配制旨在模拟细胞和细胞器内的离子浓度。例如，用于溶酶体离子通道检测的标准溶液如下：
    1. 配制浴液（单位：mM）：140 K-甲磺酸盐（MSA）、5 KOH、4 NaCl、0.39 CaCl2、1 EGTA、10 HEPES。用 KOH 调节 pH 至 7.2，用葡萄糖调节渗透压至 300 mosm/L。
    2. 配制移液管溶液（单位：mM）：140 Na-MSA、5 K-MSA、2 Ca-MSA、1 CaCl2、10 HEPES、10 MES。用 MSA 调节 pH 至 4.6，用葡萄糖调节渗透压至 310 mosm/L。
      注：将溶液经 0.2 µm 滤膜过滤，分装为每管 45 mL 至 50 mL 锥形管中，4 °C 保存，可使用 2–4 周。

3. 细胞器分离

  1. 从24孔板中取出带有处理后细胞的盖玻片（见第2节），转移至显微镜灌流室，并加入1 mL灌流液。
    注意：在涉及内体-溶酶体分离、封接和记录的全内体-溶酶体膜片钳实验中，细胞在灌流液中存放时间不得超过>1小时。超过1小时后，扩大的内体-溶酶体会发生收缩，黏附于移液管上，难以分离。
  2. 使用自制的塑料填充针将分离移液管中充满移液管液，并将其安装至膜片钳装置的前端。
  3. 将显微操作器的对角移动角度设置为接近30°（出厂默认值）。
  4. 在显微镜下（40倍物镜和10倍目镜）观察细胞，选择靠近细胞膜边缘、体积足够大的内体或溶酶体用于分离。将分离移液管移至选定细胞附近。
  5. 使用显微操作器降低分离移液管，直至其接触细胞质膜边缘（图4）。迅速水平移动移液管，以撕下一小片质膜。
  6. 使用同一移液管从细胞对侧施压，将内体/溶酶体挤出至距离细胞约2 µm处。
    注意：若细胞器表面残留有细胞膜，可能会影响吉欧封接（gigaseal）的形成。
  7. 在显微镜下观察已分离的内体-溶酶体。

4. 巨阻封接的形成

  1. 用适当灌注液填充新抛光的膜片电极，并将电极安装至放大器前端。
  2. 对电极施加 20 - 50 mbar 的正压（或使用1 mL注射器推动0.03-0.05 mL液体进行压力控制），并维持该压力（锁定阀门）。
    注意：1 mbar（毫巴） = 0.001 bar = 0.1 kPa（千帕） = 1 hPa（百帕） = 1,000 dyn/cm²。
  3. 将电极尖端移入浴液中，置于视野中央，确认压力足够高，可观察到液体从电极流出进入浴液。
  4. 施加重复的电流脉冲 (+5 mV; 5 ms)，以测定电极电阻、封接电阻和串联电阻。监测电极尖端大小、封接形成情况以及全内体-溶酶体构型的建立。
  5. 迅速将电极移至目标囊泡顶部附近。使电极靠近囊泡，直至囊泡因电极液体流动而发生移动或滚动（图5）。
  6. 调节电极的偏移电压至0 mV。立即释放正压。理想情况下，囊泡将被吸入电极并与膜连接，在1秒内形成吉欧封接（1-20 GΩ）。观察由5 mV的电压脉冲引发的电流幅度是否下降至<10 pA，此现象表明吉欧封接成功形成。
    注意：稳定的正压对吉欧封接的形成至关重要。有时管路泄漏会阻碍封接形成，建议使用压力计检查是否存在泄漏。若发现泄漏，应重新连接管路或在接缝处涂抹少量凡士林以改善密封性。

5. 电流测量

  1. 膜破裂
    注意：根据实验需求，电极与膜的接触方式可分为四种模式：细胞贴附模式、全细胞模式、内面向外模式和外面向外模式（图6）。
    1. 对于全囊泡记录，使用持续时间为200 µs或500 µs的高压短脉冲（ZAP脉冲），在移液管与细胞器接触点处击破膜。将电压设置为从-500 mV到-1,200 mV，每次递减100 mV，直至膜被击穿。
    2. 对于内面向外模式（单通道记录），在形成吉欧封接后，将移液管从细胞器上拉离，撕下一小片膜，暴露出原本朝向囊泡腔的一侧。
    3. 对于外面向外模式，在形成吉欧封接并转换为全囊泡模式后，将移液管从细胞器上拉离，撕下一小片膜，同时保持一个小的囊泡结构。
  2. 电流记录
    1. 在内溶酶体电压钳制膜片钳实验中，随着输入电压的变化，记录跨内溶酶体膜的电流。
      1. 通过电压阶跃或电压斜坡控制这些电压；在内溶酶体电压钳实验中使用较宽范围的输入电压（例如-100 mV至+100 mV）。

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结果

以下描述了在胞内溶酶体膜片钳实验中观察到的典型电流波形。如果电流波形与预期不符，可能是由于接触不良或液体泄漏所致。接触不良可能由参比电极未完全浸入浴液，或移液管电极即将破裂引起。泄漏可能发生在腔室与盖玻片之间存在缝隙，导致液体流入物镜或载物台表面；移液管内溶液过多或过少也可能导致此类异常情况。

将移液针插入溶液/移液针接触细胞表面/ZAP
在建立溶酶体附着模式（形成吉欧封接）过程中，电流响应迅速减小。可通过将指令电压除以剩余微弱电流来确定封接电阻（图7）。

斜坡/漏电流
通过反复施加从 -100 mV 到 +100 mV 的连续输入电压，可记录随时间变化的内溶酶体膜上的电流（图8）。使用标准溶液时，细胞器内外的离子组成不同。如果通道具有选择性，由于离子进出的通透性不同，电流-电压曲线的交点将不在零点。该交点称...

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讨论

电生理实验装置主要有四个实验室要求：i）环境：维持样品健康的方法；ii）光学：观察样品的方法；iii）机械：稳定定位微电极的方法；iv）电子学：放大和记录信号的方法。

要成功进行内体-溶酶体膜片钳实验，有几个关键步骤至关重要。首先，细胞的状态必须良好——细胞需牢固地贴附在盖玻片上，以便当使用分离移液管破裂细胞时，整个细胞不会发生移动。确保细胞健康且充分铺展非常重要。如果细胞无法稳定固定，可尝试更换合适的盖玻片包被材料以改善贴附。此外，还需监控细胞密度。当细胞密度过高（超过90%）时，药物诱导细胞器增大的效果会减弱，从而增加实验操作难度。其次，膜片钳移液管的质量必须达标——移液管尖端电阻应适中（5–8 MΩ），且两侧玻璃表面应光滑、平行。

第三，在形成吉欧欧姆密封（gigaseal）的过程中，如果释放正压后密封未立即形成，可施加适度的负压以促进密封。然而，一旦吉欧欧姆密封形成，必须立即释放负压，以避免整个囊泡被吸入移液管内的风险。此外，在进行全内体-溶酶体膜片钳实验时，需要破裂一小部分膜结构。由于内体-溶酶体缺乏细胞骨架支撑，其...

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披露

作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

中国台湾国家科学与技术委员会（MOST 110-2320-B-002-022）、中国台湾大学（NTU-112L7818）以及中国台湾国家卫生研究院（NHRI-EX112-11119SC）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
硼硅酸盐玻璃SUTTER INSTRUMENTBF150-75-10外径：1.5 mm，内径：0.75 mm，长度：10 cm，带纤丝
Digidata 1140AAxon Instruments
倒置显微镜 IX73OLYMPUS
MODEL P-97 微电极拉制仪SUTTER INSTRUMENT
MPC-200SUTTER INSTRUMENT
MultiClamp 700BAxon Instruments
抛光仪
快速更换记录槽Warner Instruments641943QR-40LP，适用于 25 mm 盖玻片

参考文献

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