用于高倍率活细胞共聚焦荧光显微镜观察的双轴拉伸装置

摘要

本文介绍了一种多功能的等双轴拉伸装置，该装置采用气动驱动，可兼容高分辨率显微镜成像。

摘要

在生理和病理条件下，细胞持续暴露于各种拉伸和压缩应力等机械力中。目前有大量活跃的研究致力于探索细胞和组织如何响应并适应这些应力，以及这些响应如何与力化学信号传导相整合。这催生了对与标准细胞培养方案和显微镜方法兼容的复杂工具的需求，以在体外研究中重现生理应力。本研究介绍了一种与高分辨率光学和荧光显微镜兼容的拉伸装置的设计、功能及表征。目前该领域已开发并使用了多种基于气动或电机的拉伸装置。本文详细描述了其中一种系统，包括设计指南、多种应用实例以及构建类似装置所需的全部工具。该系统基于一块可变形的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜，在施加真空后实现等双轴拉伸，从而产生均匀、可重复且可控的样品应变。该装置可提供多种拉伸应力，从局部瞬时拉伸到具有可控振幅和频率的重复拉伸-释放循环。通过在基底上包被黏附蛋白，可在拉伸装置中接种带有荧光报告分子的细胞，并利用高倍荧光显微镜对拉伸过程中的细胞进行活体成像。通过让样品适应拉伸后释放应力，或在预拉伸基底上接种样品后再释放拉伸，也可施加压缩应力。对PDMS基底进行额外的拓扑图案化处理，可实现同一样品在不同显微镜模式（如荧光显微镜和电子显微镜）下的成像。此外，还可将聚丙烯酰胺凝胶附着于PDMS膜上，从而实现对种植在不同刚度基底上的细胞进行拉伸。总体而言，通过在活体样品上施加可控的拉伸应力，结合高质量的荧光显微镜技术，该拉伸装置能够解答力生物学中的多种重要问题。

引言

薄而可变形的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜被广泛应用于多种定制拉伸装置中^1,2,3，因为PDMS是一种已确立的生物相容性惰性材料，适用于显微镜成像。此处，与其他许多方法一样^4,5,6,7,8,9，利用施加真空的简单原理使膜发生形变，从而构建一个稳定且可控的等双轴拉伸装置。通过将膜固定在圆形环内，并将该环密封于 "拉伸体位" (图1A-C），可实现均匀且各向同性的形变。生物样本置于环形结构中心的自支撑PDMS膜上，从而能够利用荧光显微镜进行成像。本文展示了两种定制装置，可分别兼容两种显微镜载物台型号（图1D-F）在生物应用方面具有高度的通用性。尽管整体设计简单且可移植到其他平台，但装置的尺寸必须根据成像需求仔细选择。一旦完成设计，必须对装置的应变分布进行表征和验证。

除了装置本身外，本文还提供了一种简单的方法，并附有Matlab代码，用于表征应变的大小、均匀性和各向同性。该拉伸装置随后可用于对合成系统¹⁰、单个细胞^11,12或单层细胞¹³施加等双轴拉伸应力，同时利用荧光显微镜以高时空分辨率记录样品的生物学响应。膜表面可包被不同的细胞外基质黏附蛋白^14,15。可根据具体生物学研究的需求添加额外功能。例如，可将聚丙烯酰胺凝胶键合到PDMS膜上，以便在拉伸过程中调节基底刚度^13,16；也可在PDMS膜上制备带有编号参考网格的结构，便于后续对样品中同一感兴趣区域进行成像¹²。固定后的拉伸样品还可进行免疫染色 ，然后重新拉伸以进行荧光成像¹⁷。所施加的拉伸模式可精确控制，范围从单次瞬时拉伸脉冲到不同幅度、频率或波形的周期性应变^14,16。

方案

1. 设计载物台和拉伸柱（图1）

1. 设计一个尺寸与载物台大小/夹具和物镜配置相匹配的拉伸支架。两种特定的拉伸支架如图1A、D所示。
   注意：本方案中提供的FreeCAD文件（补充文件夹1）适用于以下尼康显微镜及载物台：配备NI-SH-E载物台的Eclipse Ni-E正置显微镜，以及配备TI-S-ER载物台的Eclipse Ti-E/B倒置显微镜，见图1D。该支架可采用三维（3D）打印制作，但多次使用后可能发生形变；而基于铝材的支架则无此缺点。务必对铝制支架进行阳极氧化处理以防止氧化。正置配置可实现更大的运动幅度。此外，正置配置可直接对样品成像而无需经过界面，在可变形PDMS膜基底的情况下具有光学优势。相比之下，在倒置配置中，照明光束需穿过PDMS膜（图1F）；由于施加拉伸时PDMS膜会发生位移，因此应谨慎选择物镜的浸没介质（推荐使用水浸、空气或甘油；不推荐油浸，因其与PDMS基底不兼容）。商用夹具可通过额外的螺孔进行改装；注意避免使用塑料或聚四氟乙烯（Teflon）材质的螺丝，以防拧紧时产生粉尘。设计一种可将拉伸支架安装在载物台顶部的夹具会更加方便，如图1E所示。本方案提供的FreeCAD文件适用于Eclipse Ni-E正置显微镜的载物台。
2. 设计与拉伸支架尺寸相匹配的拉伸环（图1C），其尺寸需与拉伸支架（图1A、B）兼容。本方案提供的FreeCAD文件与相应支架兼容（为便于在操作样品时覆盖拉伸环，其直径可设计为与培养皿尺寸相匹配）。
   注意：拉伸环也可采用铝材（阳极氧化处理）或3D打印制造。应配备合适直径的密封垫圈，以实现拉伸支架与拉伸环之间的真空密封。
3. 可选步骤：制作真空控制器。本方案所用真空控制盒的电路图见补充信息（参见补充文件夹2）。该控制器可手动调节施加于拉伸装置的真空度。
   注意：商用真空控制器也可提供类似功能，通常还配有控制软件，可施加多种类型的信号（如正弦波、三角波等）（Fluigent, Cobalt）。

2. 可拉伸膜的制备

1. 设计圆形平板（推荐材料：聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA）。确保这些平板的直径大于环状结构，并且尺寸与旋涂仪兼容（图2A）。建议尺寸参见表1，另见补充文件夹3。
   注意：对于1号样品，使用直径为12 cm的平板；对于2号样品，使用直径为18–21 cm的平板。每次使用前后均应使用无纺布擦拭布和96%乙醇仔细清洁平板。需注意避免PDMS在平板表面、边缘或底部积聚。
2. 按1:10比例配制PDMS，并充分混合以获得高度均匀的乳液（使用推荐的搅拌棒）。
   注意：对于直径12 cm的平板，每片准备4.5 g PDMS；对于18 cm的平板，每片准备8 g。若需制备多个平板，应额外多准备一些PDMS，例如制备10片时可多准备10 mL。例如，制备10片12 cm的平板时，需准备50 g组分A和5 g组分B。建议使用较大的容器以便于移液操作。容器内不得含有灰尘或其他杂质，以免影响PDMS的旋涂和固化效果。操作时应佩戴材质兼容的手套（避免使用乳胶手套，推荐使用乙烯基手套），以确保PDMS正常固化。
3. 使用真空腔至少脱气1小时。
   注意：也可将PDMS置于50 mL离心管中，在0.2 × g条件下离心5分钟进行脱气，但需注意使用点样注射器从离心管中吸取PDMS混合物较为困难（步骤2.4所需）。避免在直射光下长时间脱气（不超过2小时），以防PDMS提前固化。
4. 在PMMA平板表面进行PDMS旋涂
   1. 将4.2 mL或7.5 mL脱气后的PDMS滴加至PMMA平板表面。
   2. 按照以下推荐参数进行旋涂：
      1. 以100 rpm/s的加速度，先在500 rpm下旋涂5秒。
      2. 再以300 rpm/s的加速度，在500 rpm下旋涂1分钟。
         注意：可在PMMA平板底面标记中心位置，以确保旋涂过程中平板居中并实现均匀旋涂。步骤2.4.2.1并非必需，尤其当无法调节加速度参数时；该步骤有助于在正式旋涂前使PDMS初步铺展。本方案所得PDMS膜厚度约为140 µm（通过干涉测量法测定；参见补充图1和表2）。若所用旋涂仪型号或参数不同，可能导致膜特性差异，因此实验前必须进行校准。
5. 将每块平板置于培养皿中存放，防止灰尘沉积，并在65 °C烘箱中过夜聚合固化。
   注意：应使用耐高温的培养皿。固化条件会影响PDMS在特定真空度下的形变能力。

3. 环状结构中的膜夹心法

1. 固定材料的设计。
   1. 设计内径/外径合适的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）环，用于承载旋涂法制备的聚二甲基硅氧烷（PDMS）圆形薄膜（图2A）。参见表1和补充文件夹3中建议的尺寸。
   2. 设计一个安装支架（图2B），PMMA环将安装在其上方，支架的高度也将决定将薄膜安装到环中时的预拉伸程度。
      注：安装支架可采用现有实验器具的简易方案（例如培养皿）。更优的方案是使用3D打印技术制作支架（本方案提供了该部件的FreeCAD文件，见补充文件夹3），因为其高度可由用户自定义并轻松调整（本方案中小尺寸环使用了10 mm高度）。支架中心部分的高度应小于半环高度，以确保在安装过程中PDMS基底不会接触支架（参见步骤3.4.2中的进一步应用）。使用聚乳酸（PLA）丝材的3D打印机（见材料表）适用于此目的。也可设计并3D打印一个切割环，作为手术刀的导向装置（图2A）。
   3. 设计并制备尺寸匹配的黄铜配重块，用于在安装薄膜时对环施加压力（图2C），从而实现可重复的预张力。
      注：此处提供的FreeCAD文件（见补充文件夹3）与本方案中所述环的尺寸相匹配。
2. 将PDMS薄膜从PMMA板上取下。
   1. 将PMMA环放置在一张白色实验台纸上。
      注：必须确保实验台面和纸张保持平整，以避免在安装过程中纸张接触PDMS薄膜。
   2. 用刀片沿板边缘小心地划一圈（一次或两次），然后用尖头镊子沿同一边缘轻轻划过，确保PDMS在整个圆周上被整齐切割（图2A）。
   3. 用镊子小心地从一侧边缘提起薄膜，然后用拇指轻轻剥离PDMS片的边缘，使薄膜边缘均匀抬起。将薄膜边缘从板上剥离约半个圆周长度（图2A）。
      注：在PDMS薄膜下方滴加几滴96%乙醇有助于无损地抬起薄膜。
3. 干燥PDMS薄膜。
   1. 用手指将96%乙醇均匀涂抹在先前准备好的PMMA环整个上表面（步骤3.2.1），并擦拭均匀。
   2. 小心地从之前已抬起的一侧边缘（见步骤3.2.3说明）取下PDMS薄膜，并将其对称地放置在覆盖有乙醇的PMMA环上。去除PDMS上的任何褶皱，但切勿拉伸薄膜，仅将其展平即可。
      注：在此阶段施加预拉伸会影响在给定真空条件下PDMS的可变形性。
   3. 待乙醇完全干燥后，确认PDMS薄膜已牢固粘附于PMMA环上。
4. 组装拉伸环。
   1. 取另一个空的PMMA环，将其放置在安装环上方，并使用金属夹具将两者夹紧，使PDMS薄膜被夹在两个环之间（PDMS薄膜夹层结构， 图2B）。
   2. 将拉伸环的下半部分放置在步骤3.1.2中设计的安装支架上（图2B）。
   3. 将PDMS环夹层结构放置在拉伸环上，并用力向下压，直至完全到位。PDMS基底不应接触安装支架。将密封垫圈 固定在 正确位置（图2B）。
   4. 将圆形黄铜配重块放置在样品上方（图2C）。这将施加一个固定的预张力，与所有已安装环的张力一致，确保系统校准时具有良好的可重复性。
   5. 将金属拉伸环的上半部分放上，对齐螺孔，插入所有螺丝并拧紧（图2C）。
      注：此时PDMS薄膜已有穿孔，因此切勿尝试拆卸或回退操作流程。
   6. 用刀片沿环边缘轻轻切割PDMS（图2C）。
   7. 用适当物品（如培养皿）覆盖以保护薄膜免受灰尘污染（图2C）。
      注：若需用聚丙烯酰胺凝胶对PDMS进行功能化处理，请进入第5节；若进行初始校准测量，请进入第6节；若该PDMS环将用于细胞接种，请进入第7节。

4. PDMS 膜制备的改进：制备参考网格图案

1. 在进行PDMS旋涂之前，准备一块PMMA板，该板已通过光刻技术使用SU8基网格进行"图案化"（图2D）。为此，设计所需的图案以制作光掩模薄膜（醋酸盐掩模）。
   注意：本方案提供的PDF文件（见补充文件夹4）可生成具有交替数字的网格；参见图2D。可根据图案尺寸使用Inkscape等简单软件（或Clewin、FreeCAD等替代软件）创建该设计。设计可由外部公司打印在摄影胶片上（见材料表）。
2. 在PMMA板上进行光刻工艺（有关PMMA光学性质，请参见补充文件夹3）。
   1. 对PMMA板进行20分钟的氧气等离子体处理，功率为7 W，氧气流速恒定为0.8 bar。
      注意：确保已去除板上的塑料保护层，且PMMA板完全透明。
   2. 在95 °C下烘烤5分钟。
   3. 使用氮气枪冷却PMMA板，然后将4 mL SU-8 2100树脂滴加到12 cm的PMMA板上（若使用不同尺寸的板，请相应调整体积）。
   4. 按照以下参数进行旋涂（或调整旋涂参数以形成约10 µm厚的涂层）：以100 rpm/s的加速度在500 rpm下旋转5秒，随后以300 rpm/s的加速度在4000 rpm下旋转30秒。
   5. 在95 °C下烘烤2.5分钟。
   6. 将PMMA板置于掩模对准器中，并放置醋酸盐掩模，使用以下参数：不使用i线，宽带曝光（波长范围260–460 nm），光强25 mW/cm²，曝光时间7.5秒。
   7. 在95 °C下烘烤3.5分钟。
   8. 使用丙二醇单甲醚醋酸酯显影1分钟。
   9. 用异丙醇充分清洗。
   10. 使用明场显微镜的低倍物镜（2–10×）对图案质量进行目视验证。
       注意：对图案化PMMA板进行硅烷化处理可延长其重复使用的寿命。为此，先用氧气等离子体处理30秒活化图案化PMMA板，然后在化学通风橱中真空条件下用三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷处理1小时。
3. 按照步骤2.2至2.5的方法，使用图案化PMMA板旋涂PDMS可拉伸膜。
   注意：如前所述，图案化PDMS可在明场显微镜以及扫描电子显微镜下观察（图2D）。将PDMS膜安装到拉伸环时，需注意图案朝向，以确保获得所需方向的图案。

5. 在PDMS膜顶部附着聚丙烯酰胺（PAA）凝胶

注意：此步骤可在连接到 PMMA 板的 PDMS 膜上进行（见第 2 节），也可在先前安装好的拉伸环上进行（见第 3 节）。操作需在化学通风橱内进行；涉及加热的步骤，建议在化学通风橱内使用小型可放入的烘箱，参见材料表；否则，应将样品置于密闭容器中再放入烘箱。

1. PDMS 膜预包被（图 2E）
   1. 在微量离心管中将 96% 乙醇与 10% (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）混合，配制包被溶液（例如，20 µL APTES 加入 180 µL 乙醇中）。
   2. 使用电晕等离子放电器对 PDMS 膜活化 1 分钟（或使用氧气等离子清洗仪活化 30 秒）。
   3. 将 200 µL APTES/乙醇溶液置于膜的中央。
   4. 将膜置于 65 °C 烤箱中孵育 1 小时。
   5. 用 PBS 洗涤两次。第二次洗涤时，在摇床上震荡 10 分钟。
   6. 在 PBS 中配制 3% 戊二醛（GA）溶液。将每片膜 200 µL GA 溶液加至经 APTES 处理的膜区域。
   7. 静置 25 分钟（不得超过 30 分钟）。
   8. 用 PBS 洗涤两次，第二次洗涤时震荡。
   9. 吸除液体，并将环状结构倾斜放置，直至 PBS 完全干燥。
2. 盖玻片硅烷化
   1. 准备 6 mL Repel Silane，倒入培养皿中。
   2. 小心地将 18 mm 见方的玻璃盖玻片逐个放入液体中。
   3. 将盖玻片孵育 5 分钟。
   4. 准备两个烧杯，一个装有 96% 乙醇，另一个装有超纯水。
   5. 用镊子将盖玻片从 Repel Silane 中取出，先在 96% 乙醇中洗涤，再在超纯水中洗涤（盖玻片经水洗后应呈"干燥"状态）。
   6. 将盖玻片置于培养皿边缘，额外干燥 30 分钟。
3. 聚丙烯酰胺（PAA）凝胶与 PDMS 膜的连接
   1. 将一半经 Repel Silane 处理的盖玻片整齐排列于培养皿底部。
   2. 配制所需刚度的 PAA 凝胶混合液^16,18。
   3. 在每片盖玻片上滴加 10 µL 凝胶混合液。
   4. 将另一片经 Repel Silane 处理的盖玻片覆盖其上以铺展凝胶。两片盖玻片无需对齐，应呈星形排列以便后续分离。轻轻按压，使凝胶展平但不超出盖玻片范围。
   5. 静置 45 分钟至 1 小时。
   6. 用镊子轻轻分离盖玻片，确保凝胶保留在其中一片盖玻片上。
   7. 取带有凝胶的盖玻片，使凝胶面与先前经 GA 处理的 PDMS 区域接触（图 2E）。
   8. 用手指从上下两侧轻轻按压 5 秒。
   9. 在 37 °C 下孵育过夜。
   10. 次日，向环内加入 PBS 孵育 30 分钟。
   11. 用镊子轻轻剥离上层盖玻片。
   12. 从 PDMS 膜的另一侧用永久性记号笔描出 PAA 凝胶的轮廓，以利于后续步骤中定位样品。
   13. 吸除 PBS。
   14. 进行功能化处理，以促进目标细胞外基质蛋白与凝胶的结合¹⁵。

6. 拉伸装置操作、应变校准及分辨率评估

1. 制备带有荧光微珠的PDMS拉伸环以进行应变校准。
   1. 配制0.1 µm或0.2 µm荧光微球的1:50000稀释液（参见 材料表在磷酸盐缓冲液（PBS）中通过连续稀释法进行稀释（先将2 μL磁珠原液加入1 mL PBS中，配制成1:500的中间溶液，再从中取10 μL加入1 mL PBS中进行最终稀释）。
      注意：膜上较高的微珠密度有利于校准步骤；请勿超声处理溶液，因为微珠团块有助于校准过程中的操作。
   2. 在PDMS中央放置10-30 µL液滴。
      注意：可方便地设计带中心样品沉积的十字形支撑架
   3. 在不超过 40 °C 的条件下干燥，以避免后固化导致的干扰问题。
2. 制备带有荧光微珠的PDMS拉伸环以进行分辨率评估。
   1. 遵循 Cole 等人所述的实验方案¹⁹ 使用直径小于衍射极限的微珠（通常为0.1 µm）制备微珠溶液。
      ​（参见 材料表）。在每个中间步骤中，仔细对珠子溶液进行超声处理。
   2. 在环的中心位置对PDMS基底进行电晕处理以实现活化。
   3. 立即将20 µL磁珠溶液均匀涂布于经处理的PDMS中心区域，并静置干燥。
      注意：在此情况下，将珠溶液高度稀释后孵育于亲水性PDMS表面，以确保充分铺展，并获得吸附在基底上且彼此分离的0.1 µm单个微珠。
3. 将拉伸装置安装到显微镜载物台支架上（图1F).
   1. 将拉伸柱安装到显微镜上。
   2. 在柱体（中间部分）的圆形区域顶部充分涂抹润滑剂（凡士林） 图1D，F).
      注意：使用润滑剂对于PDMS基底是必需的，以克服摩擦并使其在柱上顺利滑动，且每次更换样品之间必须更新润滑剂。在本实验方案所展示的装置中，凡士林被用作一种非常方便的润滑剂。
   3. 将步骤6.1中制备的拉伸环安装到拉伸柱上，并拧紧顶盖以密封装置。
   4. 将真空控制器连接至真空源和拉伸柱图3A).
      1. 将真空控制箱的后端连接至真空源（图3A).
      2. 将盒子的前端连接到拉伸柱上（图1B，D，F).
         注意：真空源可以是建筑物基础设施中配备的真空管线。需要适度的真空度以实现足够的拉伸，但具体所需真空度取决于拉伸环的直径（在相同真空水平下，直径越小，产生的应变也越小）。此外，也可使用市售的真空泵（如 Fluigent 或 Elveflow 提供的独立式真空泵）；若使用此类设备，应遵循制造商关于连接真空源的说明。切勿使用无真空控制装置的真空源（例如本方案中介绍的自制真空控制箱或市售的真空控制系统）。
4. 应变校准
   1. 选择一个感兴趣的区域，该区域应包含遍布整个视野的高密度微珠以及用户可识别的微珠聚集体（参见 图3B).
   2. 获取图像 "静息状态下" 所选视野的位置（保存该位置）。
   3. 在低真空度下施加拉伸（本实验设置为 -20 mbar）。样品将在所有方向（X-Y-Z）发生移动。
   4. 首先在 z 平面重新对焦。
   5. 移动载物台的 x-y 方向，找到在静息状态下成像的相同兴趣区域，对拉伸状态下微球的图像进行精细调焦，并采集图像。
      注意：如果样品位置严重偏离中心，根据应变大小，感兴趣区域将发生显著移动。离中心越远，位移越大，但应变大小与样品在基底上的位置无关。以2048×2048分辨率、无像素合并模式采集图像。
   6. 释放张力。以更高的真空度（-30 mbar、-40 mbar 等）重复步骤 6.4.3–6.4.5。
      注意：出于校准目的，在重新拉伸前应始终返回至静息状态（参见 补充图 3A），因为PDMS在变形时具有滞后行为。
   7. 安装第二个拉伸环，并重复步骤 6.4.1–6.4.6。至少对 3 个不同的拉伸环执行此校准。
   8. 将获取的图像按样品分类存储在相应的文件夹中。
   9. 在每个文件夹中，命名静止状态下采集的参考珠图像 reference_str1，图像在逐渐增加的真空条件下被拉伸 拉伸_str1, 拉伸_str2, 拉伸_str3等。
      注意：此步骤是系统校准的核心环节。根据用户需求，应使用类似的微珠样品并采用其他真空施加方案进行额外的校准。应用与生物样本所受应变相似的应变方案（参见代表性结果部分）。
5. 使用 Matlab 代码量化应变²⁰.
   1. 请通过以下链接下载整个 Matlab 文件夹 https://github.com/xt-prc-lab/Le_Roux_et_al_2024_JOVE
      注意：要运行的主要代码名为 凝胶应变 并调用其他必须按原样保留的 MATLAB 代码文件，这些文件需与主代码保存在同一文件夹中。
   2. 打开 Matlab 并打开代码 凝胶应变.
   3. 设置参数（参见 表3，代码参数 推荐设置）。
   4. 按照代码中的指示定义父文件夹和实验文件夹的路径。
      注意：如果文件夹不存在，代码将显示警告弹窗；请选择 添加到路径 浏览至存储图像的实验文件夹。
   5. 运行 凝胶应变 代码
   6. 开放 拉伸_str1 如代码所要求。
   7. 打开 参考文献1 如代码所要求。
      注意：建议按照本方案所述，一次性批量处理不同真空度下的所有拉伸图像；所有文件必须存储在同一实验文件夹中，但程序仅要求打开第一幅拉伸图像。图像文件名应以 strX 结尾，其中 X 为递增的数字 1、2、3 等，如第 6.4.9 步所述。 本章内容。
   8. 验证 结果 文件夹中包含以下4个子文件夹： 裁剪数据 包含裁剪并比对好的数据； 位移 包含珠子位移文件； 图像 包含径向位移和应变的曲线图； 菌株 包含针对每个真空度获得的菌株矩阵电子表格。
      1. 计算每个真空水平下应变矩阵的中位数。
      2. 每个样本重复一次（至少3个样本）。
      3. 绘制3个样品的中位应变矩阵与真空度的关系曲线，以获得校准曲线（图3C).
         注意：如果代码未能正确处理珠子图像，可以修改几个参数。为此，请打开文件 设置拉伸参数 在 Matlab 中修改 设置.分辨率 和 设置.重叠 根据代码注释中的建议（另见 表3）。根据实验需求，可对生物样本施加不同类型的应变（如循环应变、较大应变等）：建议对这些条件进行校准（参见示例 补充图2 和 补充图3).
6. 分辨率评估（遵循 Cole 等人的方案）¹⁹)
   1. 安装步骤 6.2 中准备好的拉伸环。
   2. 成像一个包含单个微珠点的视野（获取一组Z轴步进距离与所用物镜相匹配的图像序列）。
   3. 使用 Cole 等人所述的 MetroloJ（Fiji 插件）来表征拉伸装置的 X-Y-Z 分辨率（图3D 和 补充图4).

7. 细胞接种与拉伸

1. 用细胞黏附蛋白包被 PDMS
   1. 将 PDMS 圆环置于紫外光下照射 15 分钟进行灭菌（图 4A）。后续所有步骤均需在生物安全柜中进行，以确保无菌。
   2. 在生物安全柜中用无菌 PBS 冲洗培养板。
   3. 通过在圆环中心滴加 100–200 µL 细胞黏附蛋白溶液进行孵育^11,14,15 （图 4A）。
      注意：通常使用 10 µg/mL 的纤连蛋白溶液较为合适¹¹。也可使用其他感兴趣的黏附蛋白对 PDMS 进行包被（例如层粘连蛋白、角蛋白¹⁵；可能需要特定的处理方法或实验方案）。推荐将纤连蛋白包被在 4 °C 下孵育过夜；替代方法为在 37 °C 下孵育 1 小时。
   4. 用永久性记号笔从 PDMS 膜底部标记液滴的轮廓。这有助于在后续步骤中定位样品。
2. 在 PDMS 圆环上接种细胞（图 4A）。
   1. 如有需要，可在拉伸实验前对目标细胞转染荧光蛋白（对于瞬时转染，建议在实验前 1–3 天进行，具体时间取决于转染方法和细胞特性），或采用特定实验方案以可视化目标荧光标记物。
      注意：在初步实验中，建议使用如 GFP-mem^11,12 等质膜标记物，以观察细胞膜的响应及潜在破裂情况。该标记物易于转染，建议对转染后的细胞施加逐步增加的应变，以确定导致质膜破裂的应变阈值。质粒图谱见补充文件夹 5。该阈值取决于细胞类型，在单细胞实验中通常低于细胞单层实验。与某些在低拉伸水平下即导致质膜破裂的膜插入染料不同，该膜标记物适用于细胞拉伸实验。
   2. 实验当天，预热细胞培养基，并准备不含 CO₂ 的培养基。
      注意：若显微镜具备与拉伸系统兼容的 CO₂ 控制功能，则可使用常规细胞培养基（对于无法在不含 CO₂ 培养基中存活的敏感样品，此设置为必要条件）。建议使用添加抗淬灭剂的不含 CO₂ 培养基（例如，对于 GFP 蛋白，可添加 10 mg/mL 的芦丁补充剂²¹）。
   3. 用胰酶消化细胞并计数。
   4. 用少量标准细胞培养基（20–50 µL）接种适量细胞，以促进细胞贴附，并置于 CO₂ 和湿度可控的培养箱中培养。
      注意：对于扁平且较大的成纤维细胞及单细胞实验，接种 5000 个细胞；具体数量取决于细胞类型和实验设计。
   5. 孵育 20–30 分钟后（检查细胞初步贴附情况），轻柔地在细胞上方加入 500 µL 培养基。放回培养箱中继续培养，使细胞进一步铺展。
      注意：接种时间取决于细胞类型和实验需求；也可通过过夜孵育形成单层细胞。培养基体积需相应调整。二次细胞染色：细胞贴附后，可用 SpyDNA 等染料（见材料表）对细胞核进行染色（补充图 5），或使用其他染色方法标记感兴趣的结构。需始终注意，活细胞染色或通过转染实现的蛋白过表达可能影响细胞对拉伸的响应，尤其是在细胞皮层、质膜或机械敏感蛋白/结构上。
   6. 更换为不含 CO₂ 的培养基，并立即用于拉伸装置。
      注意：此时样品已准备好进行拉伸实验。
3. 细胞拉伸实验：以单次拉伸-释放循环为例，成像质膜（PM）以捕捉成纤维细胞质膜的动态重塑过程。
   1. 将拉伸圆环安装至显微镜载物台上，操作同第 6 节第 6.2 步。
   2. 找到目标细胞，记录其位置，并拍摄拉伸前细胞的图像（图 4B）。
   3. 施加所需的真空压力，根据校准曲线使其对应目标基底应变。
   4. 为找到拉伸后的细胞，首先在 Z 轴重新对焦，然后在 X-Y 方向上移动，将细胞重新定位至视野中心。
   5. 在所需时间段内记录图像（图 4B）。
      注意：通常需要进行初步实验，以确定细胞对张应力的响应（平均而言）。通过施加不同基底应变来拉伸细胞，以确定其可承受的最大拉伸载荷。若应变过大，可通过质膜荧光标记物观察到质膜破裂现象。
   6. 在细胞释放阶段，返回细胞静息位置，并将显微镜的采集模式设为开启，以确保样品重新对焦后能立即开始图像采集。
   7. 释放拉伸，并快速手动调节 Z 轴对焦。
   8. 在释放后按所需时间记录细胞图像（图 4B）。由于 PDMS 膜具有柔性，样品随时间推移容易失焦，因此在整个图像采集过程中需手动调整对焦。
      注意：为在释放后成功重新对焦，需足够频繁地查看图像；每 3 秒采集一帧、持续 3–5 分钟的视频较为合理。PDMS 基底与显微镜的完美对焦系统不兼容，因此在快速采集时通常需要用户手动调节。可设置软件自动对焦，但需注意可能的误差及大幅载物台移动，以免物镜撞击拉伸柱部件造成损坏。用户可根据实验需求决定是否对样品进行多次拉伸。
4. 后期处理：使用 Fiji 对图像进行配准
   1. 打开静息状态和应变状态下的图像。
   2. 使用 Fiji 插件模板匹配，选择细胞的一个区域进行对齐（图 4C）。
      注意：Fiji 会呈现对齐后应变图像的相对位移，并对图像进行裁剪和对齐。可从以下链接下载 template_matching 插件： https://sites.google.com/site/qingzongtseng/template-matching-ij-plugin

8. 在预拉伸基底上接种细胞

1. 将涂有黏附蛋白的拉伸环安装到拉伸装置中。
2. 将PDMS基底拉伸至所需的应变水平。
3. 按照第7节的方法接种细胞。
   注意：本实验中接种操作未在无菌条件下进行，因此该方案可能不适用于所有细胞类型。
4. 细胞贴壁后，更换为不含CO₂的培养基。
   注意：建议选择贴壁速度快的细胞，以尽量缩短贴壁时间。
5. 经过所需的孵育时间后，释放拉伸力并成像目标细胞。
   注意：在此步骤中，拉伸释放后重新找到同一细胞较为困难，因为细胞在静止状态下的位置未知，且PDMS基底的移动不易准确预测。

9. 固定拉伸或松弛的细胞

1. 固定处于拉伸状态的细胞（在通风橱内操作）
   注意：多聚甲醛（PFA）是常用的固定剂；应使用预热至 37 °C 的 PFA 以确保快速固定。或者，乙二醛溶液²²也可实现快速样品固定，并具有良好的样品保存效果。
   1. 准备固定剂。
   2. 按照步骤 7.2 将细胞接种于环状基底上。
   3. 将拉伸装置及控制器置于通风橱内，并连接至真空源。
   4. 将接种有细胞的环状基底放入拉伸装置中。
   5. 为固定拉伸状态，将样品拉伸至目标应变。移除细胞培养基后，加入 4% PFA 溶液，在 37 °C 下固定 10 分钟。随后用 PBS 洗涤，并始终保持拉伸状态。缓慢释放真空，再用更多 PBS 洗涤。
      注意：务必同时准备一个未拉伸的对照组（可将一小块 PDMS 切下，在其下方滴加少量 96% 乙醇溶液，置于玻璃盖玻片上干燥即可）。为成像固定后的样品，建议将样品重新拉伸至固定时相同的程度。由于 PFA 具有毒性，此步骤中必须采取适当防护措施。建议使用可置于通风橱内的小型加热箱（见材料表）。
   6. 对样品进行成像，最好再次施加与固定时相同水平的真空，以确保样品"重新展平"（图 4D）。
2. 在拉伸-释放后固定细胞（在通风橱内操作）。
   1. 将细胞拉伸至目标应变并维持指定时间。在即将释放拉伸前，移除大部分培养基，但不要使样品完全干燥，随后释放应变。或者，可施加特定持续时间的周期性拉伸。
   2. 迅速移除培养基，并立即用固定液固定 10 分钟。用 PBS 洗涤后进行成像。
      注意：也可将样品接种于预拉伸的基底上，在用户设定的接种时间后，按照步骤 9.2.2 进行拉伸释放后的固定。
3. 固定样品的免疫荧光染色：按照标准流程对拉伸或释放后的样品进行免疫荧光操作；推荐使用鱼源明胶而非 BSA 进行封闭¹⁷。
4. 对样品进行成像（图 4E）。
5. 样品保存
   1. 准备用于样品保存的封片剂（Mowiol 或 Prolong）。
   2. 移除 PBS，并加入一滴约 75 µL 的封片剂。
   3. 用镊子夹取盖玻片，轻柔地覆盖在样品上（避免产生气泡，以免影响观察）。
   4. 在室温（RT）下干燥至少 48 小时。
   5. 沿 PDMS 固定样品边缘剪下，并转移至另一玻璃盖玻片上，以便后续成像。
      注意：此步骤无法兼容在拉伸膜上进行的后续成像，因为将 PDMS 膜用封片剂封固于盖玻片时，仅能保存其松弛状态。

10. 使用网格固定以在不同模式下对同一样品区域进行成像——以扫描电镜成像为例

注意：本方案可用于在两种不同的显微镜下对同一个单细胞进行成像，即此处展示的荧光显微镜和扫描电子显微镜。相关成像需要高级图像处理技术，不在本方案的范围之内。其他有用的应用包括例如在活体模式下观察样品、在通风橱内进行进一步固定，以及免疫染色后对同一细胞进行观察（补充图5所用的方案）。

1. 使用第4节中带有图案的PMMA板制备拉伸环。
2. 按照步骤7.2接种细胞。
   注意：务必小心施加包被溶液，以确保PDMS表面完全覆盖，包括微小的网格孔洞。
3. 按照第8节所述方法进行固定，但需使用与样品及电子显微镜成像兼容的适当固定剂和方案。
   注意：若使用PFA与戊二醛的混合液（例如2%-2.5%），需注意戊二醛试剂可能引起的自发荧光，必要时应进行淬灭处理²³。
4. 以荧光模式对样品成像，并记录细胞位置（例如打印网格图，并用十字标记位置）。
5. 完成所有图像采集后，首先去除润滑剂，然后在样品周围切割PDMS，以制备用于电镜的样品。
6. 将PDMS膜连同样品按标准流程进行扫描电子显微镜处理（包括样品脱水和金属溅射）¹²。
7. 在扫描电镜中成像时，定位网格位置，并寻找先前在荧光模式下成像的细胞（图4F、G）。

结果

校准与径向性
对所获得应变的准确表征是确保实验可重复性和可控性的保障。虽然可以在每个样品中添加荧光微球以精确记录应变，但预先进行校准步骤有助于实验的合理规划，使实验者在实际拉伸前即可明确希望施加于样品的应变大小。应变不仅取决于所施加的真空度，还会因拉伸环的尺寸、PDMS 配比（不同于 1:10 的混合比例）、膜厚度以及在环中夹紧前 PDMS 膜的预拉伸程度而变化。因此，每种实验装置都必须单独校准。通过使用荧光微球的均匀图像，并记录在不同真空度下微球信号的变化（见补充图 3A），不仅可以建立应变与施加真空度之间的校准曲线，还能验证应变的各向同性及其在基底上的均匀性。按照方案第 6 节所述记录这些图像，并利用 Matlab 代码处理图像以计算应变，可评估所获得应变的质量及其可重复性。图 3B（顶部）展示了在静止状态或应变状态下荧光微球的代表性图像组合，以及代码针对三种不同真空度水平计算出的位移场。该组合图是通过打开运行 Matlab 代码后在“Croppeddata”文件夹中生成的图像，并将其合并到两个不同...

讨论

已有大量拉伸装置被用于对生物样本施加机械拉伸，以模拟体内的生理条件^24,25。文献中报道了多种实验装置，通常将拉伸装置与原子力显微镜²⁶或荧光显微镜^27,11联用，以观察样本的响应。

本文介绍的拉伸装置在设计和操作上能够实现对活细胞进行高倍荧光成像，可用于携带任何荧光标记物的细胞成像。该装置结构简单，易于获取和使用，且采用气动系统的设计相比机械式装置更为简便且成本较低。在本研究展示的配置下，可轻松实现各向同性的应变。该设计与操作方式共同造就了一种控制良好、高质量的拉伸装置。该装置用途十分广泛，既可直接在可变形的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜上，也可在附着于膜上的聚丙烯酰胺（PAA）凝胶上培养单个细胞^11,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
醋酸酯面膜	京东光数据
丙烯酰胺	比奥拉德	161-0140	40% 丙烯酰胺溶液
APS的	西格玛·奥尔德里奇	A3678	用于电泳的过硫酸铵，≥98%
阿普特斯	西格玛·奥尔德里奇	281778	（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷
自主微流控泵	Elveflow 钴	钴双	钴双
双丙烯酰胺 Bisacrylamide	比奥拉德	161-0142	2% 双溶液
叶片	费雪科学	11733919	教学小组 Hoja 做了áctica X100 跛脚 BISTOURI 无菌 N&°C;23 LAMD23
剪辑	斯普林蒂斯	AKXX000001	Bull Dog 夹子，32 毫米，金属制成，容量 10 毫米，镀镍
电晕处理器	电工产品	BD-20AC， 货号：12051A	BD-20AC实验室电晕处理机
杯	大众	611-1368	VWR， 烧杯，一次性，250 mL
DAPI的	罗 氏	10236276001	DAPI染色
乙醇 96%	Panreac Quí云母，SLU	131085-1212	乙醇 96% v/v para análisis，ACS- 2.5 升
纤连蛋白	西格马	F0895	纤连蛋白，来自人血浆，液体 0.1%
FluoSpheres 羧酸盐改性微球，0.1 &m	生命科技	F8801、F8803	用于分辨率评估的黄绿色和红色荧光珠
FluoSpheres 羧酸盐改性微球，0.2 和微粒;m	费雪科学	F8809、F8810	用于应变校准的黄绿色和红色荧光珠
戊 二 醛	西格玛·奥尔德里奇	G6403型	H2O 中的戊二醛溶液 50%
干涉仪	维科	威科NT1100	干涉仪测量 PDMS 膜厚度
异丙醇	Panreac Quí云母，SLU	131090-1212	2-丙醇 （Reag. Ph. Eur.） para análisis、ACS、ISO
莱顿称重			定制
无绒纸巾	伯 克 希尔	DURX670、DR670090920	无纺布湿巾
润滑剂（凡士林）	西格马	16415	凡士林
蒙版对齐器	Süss MicroTec	MJB4	用于 PMMA 板上光刻的掩模对准器
莫维奥尔	Calbiochem - 默克	475904	MOWIOL 4-88 试剂
尼康显微镜转盘共聚焦	尼康	日食 Ti-E/B	配备尼康Ti-S-ER 阶段
尼康显微镜立式	尼康	日蚀镍电	配备尼康 NI-SH-E 载物台
物镜 60 倍	尼康	CFI Apo 近红外 60X W	近红外 Apo 60X/1.0w DIC N2 WD 2.8
PBS解决方案	吉布科	14200067	DPBS，10 倍
PDMS的	道康宁	2401673921	Sylgard - 184 硅胶弹性体套件 DN 109
培养皿环盖（大）	普罗基诺特	93060	Plato de cultivo celular TPP SKU： 07177925直径 100
培养皿环盖（小）	普罗基诺特	93060	Plato de cultivo celular TPP SKU： 07177924
等离子清洗机	哈里克	PDC-002型	氧等离子发生器
PMMA 板和环			请参阅补充文档中的 Excel 规格表
延长	Invitrogen	第 36930 号/第 36934 号	ProLong Gold 抗淬灭试剂
排斥-硅烷	GE医疗	17-1332-01	PlusOne 抗斥硅烷 ES
环/橡胶圈	泰克尼菲尔		定制
旋涂机	月桂	WS-650Sz	旋涂机
SPY650-DNA	螺色素	南卡罗来纳州 501	SPY650-DNA
转向勺	大众	231-0416	Eco 短一次性抹刀、双头勺子和勺子、PP 和 EcoPure 添加剂
SU8树脂2100	微化学	Y111075	苏8-2100
SU8-显影剂	西格玛-奥尔德里奇	484431	丙二醇单甲醚醋酸酯
特梅德	西格玛-奥尔德里奇	T9281-50毫升	N，N，N'，N'-四甲基乙二胺，生物试剂 suitab。电泳试剂
三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷	西格玛·奥尔德里奇	448931	三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷
镊子	IESMAT	T5039	Dumont HP 镊子 7 不锈钢。0.17 x 0.10 毫米尖端。（琼脂科学有限公司）
真空控制器	GARCAP/派克	990-005203-005	Controlador de vacio
真空控制器 fluigent	流畅的	陆-FEZ-N800	阵容流量 EZ （n800mbar）
白色台式纸	雷马	931.1001	纸 Raima 42 x 52