本文介绍了一种多功能等双轴拉伸装置，该装置由气动驱动，且兼容高分辨率显微镜成像。
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本文内容
摘要
摘要
在生理和病理条件下，细胞持续暴露于各种拉伸和压缩等机械力作用中。目前有大量活跃的研究致力于探索细胞和组织如何响应并适应这些应力，以及这些响应如何与力化学信号传导相整合。这促使人们需要开发出与标准细胞培养方案和显微镜技术兼容的精密工具，以在体外研究中模拟生理性的机械应力。本研究介绍了与高分辨率光学显微镜和荧光显微镜兼容的一种拉伸装置的设计、功能及表征。目前已有多种基于气动或电机的拉伸装置被开发并应用于该领域。本文详细描述了其中一种系统，包括设计指南、多种应用方式以及构建类似装置所需的全部工具。该系统基于一块可变形的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜，通过施加真空使其在双轴方向上均匀拉伸，从而产生均一、可重复且可控的样品应变。该装置可提供多种拉伸应力模式，从瞬时局部拉伸到具有可控振幅和频率的周期性拉伸-释放循环。通过在基底上包被黏附蛋白，可在拉伸装置中接种携带荧光报告分子的细胞，并利用高倍荧光显微镜对拉伸过程中的活细胞进行实时成像。压缩应力也可通过让样品适应拉伸后突然释放，或在预拉伸的基底上接种样品后再释放拉伸来实现。此外，对PDMS基底进行额外的拓扑图案化处理，可实现同一样品在不同显微成像模式（如荧光显微镜和电子显微镜）下的观察。聚丙烯酰胺凝胶也可固定于PDMS膜上，从而实现对种植在不同刚度基底上的细胞进行拉伸。总体而言，通过在活体样品上施加可控的拉伸应力，结合高质量的荧光显微成像，该拉伸装置能够广泛应用于力生物学领域的多种科学问题研究。
引言
薄的可变形聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜被广泛用于多种定制拉伸装置1,2,3，因为PDMS是一种成熟的生物相容性惰性材料，且适用于显微成像。此处与许多其他研究者4,5,6,7,8,9一样，采用施加真空的简单原理使膜发生变形，从而构建一个稳定且可控的等双轴拉伸装置。通过将膜固定在圆形环内，并将该环密封于"拉伸柱"之上（图1A-C），可实现均匀且各向同性的形变。生物样本位于自支撑PDMS膜的环中心位置，便于使用荧光显微镜进行成像。本文展示了两种定制装置，分别兼容两种显微镜载物台型号（图1D-F）....
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方案
1. 设计载物台和拉伸柱（图1）
- 设计一个在尺寸上与载物台大小/夹具和物镜配置相兼容的拉伸支架。两种特定的拉伸支架如图1A、D所示。
注意：本方案中提供的FreeCAD文件（补充文件夹1）适用于以下尼康显微镜及载物台：配备NI-SH-E载物台的Eclipse Ni-E正置显微镜，以及配备TI-S-ER载物台的Eclipse Ti-E/B倒置显微镜，如图1D所示。该支架可采用三维（3D）打印制作，但多次使用后可能发生形变；而基于铝材的支架则不会出现此类问题。请确保对铝制支架进行阳极氧化处理以防止氧化。正置配置可实现更大的运动幅度。此外，正置配置允许对样品进行无界面直接成像，在可变形PDMS膜基底的情况下具有光学优势。相比之下，在倒置配置中，照明光束需穿过PDMS膜（图1F）；由于施加拉伸时PDMS膜会发生移动，因此应谨慎选择物镜的浸没介质（推荐使用水浸、空气或甘油浸没类型；因与PDMS基底不兼容，不推荐使用油浸）。商用夹具可通过额外的螺孔进行改装；请注意避免使用塑料或聚四氟乙烯（Teflon）材质的螺丝，以防拧紧过程中产生粉尘....
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结果
校准与径向性
对所获得应变的准确表征是确保实验可重复性和可控性的保障。虽然可以在每个样品中添加荧光微球以精确记录应变，但预先进行校准步骤有助于实验的合理规划，使实验者在实际拉伸前即可明确希望施加于样品的应变大小。应变不仅取决于所施加的真空度，还会因拉伸环的尺寸、PDMS 配比（不同于 1:10 的混合比例）、膜厚度以及在固定于环中前 PDMS 膜的预拉伸程度而变化。因此，每个实验装置都必须单独校准。通过使用均匀分布的荧光微球图像，并记录在不同真空度下微球信号的变化（见补充图 3A），不仅可以建立应变与施加真空度之间的校准曲线，还能验证应变的各向同性及其在基底上的均匀性。按照本方案第 6 节所述方法采集这些图像，并利用 Matlab 代码处理图像以计算应变，可评估所获得应变的质量和可重复性。图 3B（顶部）展示了在静止状态或应变状态下荧光微球的代表性图像组合，以及代码针对三种不同真空度水平计算出的位移场。该图像组合是通过运行 Matlab 代码后，在“Croppeddata”文件夹中打开生成的图像，并将其.......
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讨论
已有大量拉伸装置被用于对生物样本施加机械拉伸，以模拟体内的生理条件24,25。文献中存在多种实验装置，通常通过将拉伸装置与原子力显微镜26或荧光显微镜27,11联用来观察样本的响应。
本文介绍的拉伸装置在设计和操作上能够实现对活细胞进行高倍荧光成像，可用于标记任意荧光探针的样品。该装置结构简单，易于获取和使用，且采用气动系统的设计相比机械式装置更为简便且成本较低。在本研究展示的配置下，可轻松实现各向同性的应变。该设计与操作方式共同造就了一种控制良好、高质量的拉伸装置。该装置用途十分广泛，既可直接在可变形的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜表面培养单个细胞11,12或细胞单层
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披露
我们声明不存在任何利益冲突。
致谢
本工作获得了以下资金资助 "la Caixa" 基金会（资助号 406 LCF/PR/HR20/52400004，授予 X.T.、J.V.R. 和 P.R.-C.；博士后奖学金 LCF/BQ/DR19/11740009，授予 I.G.-M.；博士后奖学金 LCF/BQ/DR19/11740009，授予 M.M.J.）、西班牙科学与创新部（项目号 PID2022-142672NB-I00，授予 P.R.-C.；项目号 PID2021-128635NB-I00，授予 X.T.；项目号 PID2022-141040NA-I00，授予 I.A.）、加泰罗尼亚自治区政府（2021 SGR 01425，授予 X.T. 和 P.R.-C.），以及奖项 "ICREA 410 学术机构" P.R.-C. 获得了研究卓越基金（P.R.-C.），加泰罗尼亚电视台基金会 Fundació la Marató de TV3（项目编号 201936-30-31 至 411，授予 P.R.-C.），欧盟欧洲研究理事会（ERC, MECHANOSYNTH，项目编号 101097753，授予 P.R.-C.；ERC, Adv-412 883739 Epifold，授予 X.T.）的资助。然而，文中表达的观点和意见仅为作者（们）的观点，不一定反映欧盟或欧洲研究理事会执行机构的意见。欧盟或资助机构对此不承担任何责任。A.E.M.B. 受惠于惠康基金会 Sir Henry Wellcome 奖学金（210887/Z/18/Z）。作者还感谢....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸盐掩膜 | JD Photodata | ||
| 丙烯酰胺 | 伯乐（Bio-Rad） | 161-0140 | 40% 丙烯酰胺溶液 |
| 轴向拉伸系统 | Sigma Aldrich | A3678 | 电泳用过硫酸铵 ≥98% |
| Aptes | Sigma Aldrich | 281778 | (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 |
| 自主式微流控泵 | Elveflow Cobalt | 钴双 | 钴双 |
| 双丙烯酰胺 | 伯乐（Bio-Rad） | 161-0142 | 2% 双丙烯酰胺溶液 |
| 刀片 | Fisher Scientific | 11733919 | 教学组 Hoja didáX100 LAME BISTOURI 无菌°23 LAMD23 |
| 夹子 | Sprintis | AKXX000001 | 金属制牛头夹，32 mm，夹持容量 10 mm，镍镀层 |
| 电晕处理机 | 电气产品 | BD-20AC，货号：12051A | BD-20AC 实验室电晕处理仪 |
| 培养皿 | VWR | 611-1368 | VWR，一次性烧杯，250 mL |
| DAPI | 罗氏 | 10236276001 | DAPI 染色 |
| 乙醇 96% | Panreac Química，SLU | 131085-1212 | 96% (v/v) 乙醇用于分析á裂解，ACS-2,5 L |
| 纤连蛋白 | Sigma | F0895 | 人血浆来源的纤维连接蛋白，液体 0.1% |
| FluoSpheres 羧基修饰微球，0.1 µm | 生命技术 | F8801，F8803 | 用于分辨率评估的黄绿色和红色荧光微球 |
| FluoSpheres 羧基修饰微球，0.2 µm | Fisher Scientific | F8809, F8810 | 用于应变校准的黄绿色和红色荧光微珠 |
| 戊二醛 | Sigma Aldrich | G6403 | 50% H₂O中的戊二醛溶液2O |
| 干涉仪 | Veeco | Wyko NT1100 | 测量PDMS膜厚度的干涉仪 |
| 异丙醇 | Panreac Quí云母，SLU | 131090-1212 | 2-丙醇（Reag. Ph. Eur.）用于分析á裂解，美国化学会，国际标准化组织 |
| Laiton weighs | 定制制作 | ||
| 无尘擦拭布 | 伯克郡 | DURX670, DR670090920 | 无纺布擦拭巾 |
| 润滑剂（凡士林） | Sigma | 16415 | 凡士林 |
| 掩模对准器 | Süss MicroTec | MJB4 | 用于PMMA板光刻的掩模对准器 |
| Mowiol | Calbiochem - Merck | 475904 | MOWIOL 4-88 试剂 |
| 尼康显微镜转盘共聚焦 | 尼康 | Eclipse Ti-E/B | 配备 Nikon Ti-S-ER 载物台 |
| 尼康 upright 显微镜 | 尼康 | Eclipse Ni-E | 配备 Nikon NI-SH-E 载物台 |
| 目标物镜 60x | 尼康 | CFI Apo NIR 60X W | NIR 平场复消色差 60X/1.0 水浸 DIC N2 工作距离 2.8 |
| PBS 溶液 | Gibco | 14200067 | DPBS，10 倍浓缩液 |
| PDMS | 道康宁 | 2401673921 | Sylgard-184 硅酮弹性体试剂盒 DN 109 |
| 大号培养皿环形盖 | 普罗基诺尔特 | 93060 | TPP 细胞培养皿 SKU: 07177925 直径 100 |
| 小号培养皿环形盖 | 普罗基诺尔特 | 93060 | TPP 细胞培养皿 SKU：07177924 |
| 等离子清洗机 | Harrick | PDC-002 | 氧气等离子体发生器 |
| PMMA 板和环 | 参见补充文件中的 Excel 规格表 | ||
| 延长 | Invitrogen | P36930 /P36934 | ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂 |
| Repel-Silane | GE Healthcare | 17-1332-01 | PlusOne Repel-Silane ES |
| 环形橡胶圈 | Tecnifil | 定制制作 | |
| 旋涂仪 | Laurel | WS-650Sz | 甩涂机 |
| SPY650-DNA | Spirochrome | SC 501 | SPY650-DNA |
| 搅拌勺 | VWR | 231-0416 | 环保型一次性短柄刮勺，双头勺铲，聚丙烯材质含EcoPure添加剂 |
| SU8 树脂 2100 | 微化学 | Y111075 | SU8-2100 |
| SU8-显影液 | Sigma-Aldrich | 484431 | 丙二醇单甲醚乙酸酯 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281-50ML | N,N,N',N'-四甲基乙二胺，电泳试剂用生物试剂 |
| 三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷 | Sigma Aldrich | 448931 | 三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷 |
| 镊子 | IESMAT | T5039 | Dumont HP 镊子 7 号，不锈钢，尖端尺寸 0.17 x 0.10 mm（Agar Scientific Ltd） |
| 真空控制器 | GARCAP/Parker | 990-005203-005 | 真空控制器 |
| 真空控制器 fluigent | Fluigent | LU-FEZ-N800 | LineUp Flow EZ (n800mbar) |
| 白色实验台纸 | Raima | 931.1001 | 纸张 Raima 42 x 52 |
参考文献
- Huang, L., Mathieu, P. S., Helmke, B. P. A stretching device for high-resolution live-cell imaging. Ann Biomed Eng. 38 (5), 1728-1740 (2010).
- Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. A shearing-stretching device that ca....
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