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在迷路切除术期间生理条件下前庭终器的获取

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DOI：

10.3791/67523

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2024年11月29日

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1Department of Otolaryngology - Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Functional Anatomy and Evolution, Johns Hopkins University School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种在迷路切除术期间于生理条件下获取人类前庭终器并利用免疫染色对其进行分析的技术。

摘要

活体人类内耳的研究具有挑战性，因其被致密的耳囊骨包裹，限制了对生物组织的获取。传统的颞骨组织病理学方法依赖于耗时且昂贵的脱钙流程，通常需要9至10个月，且由于RNA降解，可进行的组织分析类型受到限制。迫切需要开发新技术以获取新鲜的人类内耳组织，从而在细胞和分子水平上更深入地理解耳科疾病（如梅尼埃病）。本文介绍了一种在生理条件下从活体供体中采集人类前庭终器组织的技术。一名患有梅尼埃病且出现对鼓室内注射庆大霉素无效的“跌倒发作”的患者接受了迷路切除术。首先进行标准乳突切除术，识别水平半规管和上半规管（SCC）。将乳突腔充满平衡盐溶液，以便在更接近生理的条件下开放迷路结构，从而保持细胞完整性。使用配备镜头清洁套管灌注系统的0度内镜观察浸没状态下的乳突腔，并采用直径2 mm的金刚砂钻头依次开放水平半规管、上半规管及前庭。采集上半规管和外半规管的壶腹及其部分管腔组织，同时采集球囊斑。采集的组织立即置于冰上缓冲液中，随后在含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）中固定1小时。组织用1×PBS反复冲洗，并在4 °C下保存48小时。组织样本经以下一抗组合进行免疫染色：tenascin-C（壶腹神经末梢）、oncomodulin（条纹区毛细胞）、calretinin（壶腹神经末梢和II型毛细胞）、突触小泡蛋白2（传出纤维及终球）、β-tubulin 1（壶腹神经末梢和传入终球），之后孵育荧光标记的二抗。染色后组织经冲洗并封片，用于共聚焦显微镜观察。图像显示存在壶腹和耳石器毛细胞以及神经结构。本方案表明，从活体供体中获取完整且高质量的人类内耳组织是可行的，可能为耳科疾病的研究提供重要工具。

引言

由于人类活体内耳位于颞骨致密的耳囊骨内部，其研究具有较大挑战性。因此，获取人类内耳组织十分有限，研究人员主要依赖死后组织采集。过去100多年来，颞骨组织病理学（TBH）一直是了解人类耳科疾病的重要工具1,2,3。TBH所用组织需通过死后采集颞骨，经过漫长（9–10个月）的脱钙和组织处理流程，再行苏木精-伊红染色制备而成。尽管TBH仍将是揭示健康与病变人类内耳新信息的重要手段，但较长的死后间隔时间以及耗时且剧烈的组织处理方法限制了其在某些研究中的应用价值，因而需要辅助方法来研究人类内耳组织。高分辨率磁共振成像能够显示内耳器官，但其分辨率不足以观察细胞或分子水平的结构4,5。由于这些挑战，许多人类内耳疾病至今仍未能被充分理解。

另一种方法是在手术过程中获取内耳组织。在迷路切除术或经迷路入路前庭神经鞘瘤切除术中，内耳组织被有意舍弃。已有研究利用经迷路入路前庭神经鞘瘤切除术中获取的球囊组织，对前庭毛细胞形态进行表征6,7,8，并开展毛细胞再生研究9,10。最近，研究人员已开发出一种经耳道途径从器官捐献者获取内耳器官的技术，该技术可通过扩大的前庭窗以最小的组织创伤取出球囊及其他潜在的前庭终器11,12。利用该技术，已成功获得人球囊的单细胞转录组谱型13。然而，这些技术在获取过程中会使内耳器官暴露于非生理状态。具体而言，内耳器官可能经历缺乏外淋巴液的环境，并浸没于生理盐水钻头冲洗液中，而该冲洗液的离子组成与外淋巴液存在显著差异。此外，脱水后的膜迷路即使在手术显微镜最大放大倍数下也难以观察，这使得无创性手术分离极具挑战性。机械性损伤可能进一步破坏组织，根据我们的经验，手术获取的组织常因机械损伤和细胞退变而不适合用于免疫染色。目前亟需开发新的技术，以在更接近生理条件下无创获取人内耳组织，用于生物学研究，从而阐明尚不明确的人内耳疾病机制。本文中，我们描述了一种在迷路切除术期间于水下环境中获取人前庭终器的技术，并介绍了利用免疫染色对其进行分析的方法。

方案

本方案经约翰斯·霍普金斯大学医学院机构审查委员会（IRB）批准（IRB00203441），并遵循该机构关于使用人体组织和潜在感染性材料的政策。组织样本采集是在迷路切除术期间进行的，该手术是针对伴有猝倒发作的难治性梅尼埃病的标准临床治疗的一部分。

1. 迷路切除术与组织采集

  1. 在使用本方案前，需获得当地机构审查委员会（IRB）的批准，查阅机构关于使用人体组织和传染性材料的政策，并取得组织捐献的知情同意。组织采集应在迷路切除术或经迷路入路至内听道的手术过程中进行，该过程属于标准临床诊疗的一部分。
  2. 准备患者。
    1. 在麻醉诱导前，与麻醉团队沟通避免使用长效麻痹药物，以便能够监测面神经功能。
    2. 全身麻醉诱导后，对患者进行气管插管，并将手术台旋转180°。放置面神经监测电极，并确保已给予术前抗生素预防用药。
    3. 在耳道及耳后区域注射含1:100,000肾上腺素的1%利多卡因。使用聚维酮碘按常规方法对手术耳区进行消毒准备。
  3. 使用#15刀片在耳后皱襞后方1 cm处做一标准的（5–6 cm）耳后曲线切口 。
  4. 抬起耳后软组织。
    1. 上方辨认颞肌筋膜，将耳后皮瓣向前掀起至外耳道方向。
    2. 做标准的“7”字形骨膜切口，向前剥离骨膜，直至辨认出Henle棘和骨性耳道。放置自持式牵开器。
  5. 行乳突切除术。
    1. 完成乳突切除术，上方辨认颅中窝板（tegmen），后方辨认乙状窦，前方磨薄外耳道骨壁。
    2. 辨认水平半规管及砧骨短突。
      注：乳突腔不应过度刮除成碟状，以确保其保持为可容纳液体的容器，便于水下组织采集。
  6. 辨认半规管（SC）。
    1. 在手术显微镜下（2–4倍放大），使用3 mm粗颗粒金刚砂钻头去除上半规管外侧的迷路周气房、弓下气房以及后半规管后方的迷路后气房，向上延伸至总骨脚。
  7. 淹没迷路结构。
    1. 将乳突腔浸入平衡盐溶液（BSS）中，使用0度内窥镜配合带镜头清洁功能的灌注套管系统观察迷路结构。
    2. 使用该灌注系统以BSS持续冲洗乳突腔，清除血液，改善迷路结构的可视性。
  8. “蓝线法”标记半规管。
    1. 在保持乳突腔内BSS液面充足并使用内窥镜观察的前提下，用3 mm金刚砂钻头小心磨除耳囊骨质，对全部三个半规管实施“蓝线法”处理，即磨削至半规管在内窥镜下呈现为一条蓝线状结构。
    2. 使用灌注系统间歇性地以BSS冲洗乳突腔，清除血液，实现充分可视化，如图1所示。
  9. 采集半规管壶腹组织。
    1. 在BSS液下进入外半规管的穹窿部，并向前追踪至其壶腹。进入上半规管并向内侧追踪至其壶腹，可连同上半规管壶腹一并采集。锐性切断外半规管管壁以利于组织取出。
    2. 使用Rosen针从壶腹嵴处剥离水平和上半规管壶腹，分离传入神经纤维与上皮及膜迷路结构，随后将这些组织取出。
    3. 横断后半规管穹窿部，并向下和向前追踪至其壶腹。同样采集后半规管壶腹，将所有组织置于含冰BSS中保存。
  10. 采集耳石器（macula）组织。
    1. 去除水平半规管与后半规管壶腹之间的骨质，暴露前庭。由于壶腹移除时椭圆囊的膜性壁已被撕裂，只要维持液面，耳石器仍会前向附着；将其抬起并取出。
    2. 球囊位于球形隐窝内，需锐性将其从隐窝中抬起并取出。同样将组织样本置于含冰BSS中保存。
  11. 在组织采集后1小时内，将样本置于冰上，从手术室转运至实验室进行固定处理。

2. 免疫组织化学与成像

  1. 固定样本。
    1. 将组织样本置于含4%多聚甲醛（PFA）的1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）中，在室温（RT）下轻轻振荡或轨道摇动（100 rpm）孵育1小时。
      ​注意：4% PFA溶液（总体积5 mL）：625 μL 32% PFA储备液 + 500 μL 10×PBS + 3875 μL ddH2O。
  2. 将组织样本转移至1× PBS溶液中，在室温下轻轻振荡或轨道摇动，清洗3次，每次15分钟（必要时可延长）。
  3. 在解剖显微镜下，于室温的1× PBS中去除组织下方多余的结缔组织。
  4. 脱钙处理样本。
    1. 将组织样本转移至含5%乙二胺四乙酸（EDTA）的1× PBS溶液中，以清除感觉上皮中的细小骨碎片和耳石。在室温下轻轻振荡或轨道摇动孵育15–30分钟。
  5. 再次将组织样本转移至1× PBS溶液中，在室温下轻轻振荡或轨道摇动，清洗3次，每次15分钟（必要时可延长）。
  6. 向每个样本中加入125–200 μL 2×封闭缓冲液（2× BB），在室温下孵育1.5–5小时，或在4 °C下过夜（ON），孵育过程中保持持续的轨道摇动。
    ​注意：2×封闭缓冲液（2× BB）：将1 g牛血清白蛋白（BSA）溶于含0.5% Triton X-100的1× PBS中，定容至5 mL。BSA用于封闭非特异性抗原结合位点。
  7. 使用一抗进行染色。
    1. 将适量的一抗混合物溶于1× BB中，按所需稀释比例加入120–150 μL。兔抗tenascin-C抗体按1:200稀释（2.5 μg/mL），山羊抗oncomodulin抗体按1:200稀释（2.5 μg/mL），小鼠抗calretinin抗体按1:300稀释（2.2 μg/mL），DAPI按1:1000稀释（1 μg/mL）。然后将样本（避光）转移至4 °C（冰箱或冷室）中，在轻微轨道摇动下过夜孵育。
      ​注意：1× BB：将等体积的2× BB与含0.5% Triton X-100的1× PBS混合。
  8. 将组织样本在1× PBS溶液中清洗，室温下轻轻振荡，每次15分钟，共3次（必要时可延长）。
  9. 使用二抗进行染色。
    1. 将荧光标记的二抗混合物溶于1× BB中，按1:2000稀释（1 μg/mL），加入120–150 μL。使用488 nm标记的抗兔二抗、568 nm标记的抗小鼠二抗和647 nm标记的抗山羊二抗。
    2. 然后将样本（避光）在室温下轻轻轨道摇动孵育1.5–2小时（或在4 °C下过夜）。
  10. 将组织样本在1× PBS溶液中清洗，室温下轻轻振荡，每次15分钟，共3次（必要时可延长）。
  11. 进行显微解剖与封片。
    1. 在解剖显微镜下，去除前庭感觉上皮周围的多余组织和膜结构。用70%乙醇清洁载玻片表面，晾干后滴加55 μL适当的封片介质。
    2. 将感觉组织样本转移至封片介质中，使用精细镊子轻轻调整样本方向，使纤毛束面朝上。
    3. 将适当大小的盖玻片轻轻覆盖在含有样本的封片介质上，尽量减少气泡产生。确保盖玻片为共聚焦显微镜所需的#1.5厚度等级。
    4. 将载玻片置于避光处（如实验台抽屉）使封片介质固化。用透明指甲油将盖玻片密封至载玻片，并在避光处干燥后再使用共聚焦显微镜观察。完成后，将密封的载玻片避光保存（置于载玻片盒或载玻片夹中）于4 °C，直至成像。
  12. 使用共聚焦显微镜，设置40×–100×放大倍数，结合488 nm和657 nm通道对样本进行成像。

结果

采用该技术可完整获取人球囊以及水平半规管和上半规管壶腹，且创伤极小（图2）。如图2所示，壶腹可连同大部分膜性管结构一并获取。使用抗腱生蛋白-C（细胞外基质蛋白）和抗肿瘤调节蛋白（parvalbumin蛋白家族的小钙结合蛋白）进行免疫荧光标记，结果显示Ⅰ型前庭毛细胞保持完整（图3）。毛细胞密度为每10,000 μm2 82个。这些结果表明，该技术在获取人内耳组织时能最大程度减少对神经上皮的损伤，具有良好的应用价值。

内耳解剖图，显示半规管（PSCC、HSCC、SSCC）和砧骨结构。
图1：手术设置示意图。手术设置示意图：图示左侧乳突腔，包含外侧、上方和后方的半规管。乳突腔浸没在平衡盐溶液中，使用0度内窥镜观察乳突腔，同时使用金刚石钻头开放迷路。请点击此处查看该图的放大版本。

组织学分析；两个染色的组织样本；A 和 B；显微镜图像；生物学研究。
图 2：膜迷路。在 5 倍放大倍数的体视光学显微镜下观察采集的（A）人球囊以及水平半规管和（B）上半规管壶腹。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示蛋白质定位的荧光显微镜图像，绿色/红色标记的细胞，50μm比例尺。
图3：椭圆囊。 使用共聚焦显微镜在40倍放大下拍摄的人类椭圆囊免疫荧光标记的最大强度投影图像。抗腱生蛋白-C抗体标记瓶状突触裂隙（绿色），抗肿瘤调节蛋白抗体标记Ⅰ型前庭细胞（红色）。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了一种使用内窥镜在BSS溶液中进行前庭终器水下采集的新技术，并利用免疫荧光成像对其进行分析。在此，我们展示了完整前庭终器的采集过程，所获样本中的前庭毛细胞保持完整，且组织质量足以成功进行免疫标记。本研究样本中的毛细胞密度与其他来自活体器官捐献者的研究结果相似13。据我们所知，这是首次报道可在接近生理条件下进行前庭终器水下采集的技术。该方法借鉴了用于上半规管 裂开 修复的水下技术，该技术在打开迷路进行封堵时使用BSS以维持生理环境14,15。

本研究在既往建立的前庭器官获取技术基础上进行了拓展，这些技术包括在迷路切除术或前庭神经鞘瘤切除术中获取前庭组织6,7,8，以及从活体器官捐献者中获取前庭组织11,12。水下操作技术可便捷地应用于前庭神经鞘瘤切除术，因为在乳突切除术后，迷路的开放方式与此类似。目前对活体器官捐献者前庭终器的获取仅在有限范围内开展，且采用经耳道入路12。该经耳道入路需先移除鼓膜和听小骨，并扩大前庭窗，然后才能进行前庭终器的采集。从活体器官捐献者获取组织时，需与移植手术团队在患者床头有限的空间内协同操作，同时还要与麻醉团队共用该区域。因此，本文所述技术难以适应活体器官捐献过程中在时间和空间上的严格限制。然而，该技术具有明显优势，即可便捷地暴露并采集半规管的壶腹，而经前庭窗途径则难以实现这一操作。

人类内耳组织的研究对于阐明内耳疾病（其中许多病因仍属不明）的病理生理机制至关重要。例如，梅尼埃病在耳科临床中十分常见，但其病因至今未明，且尚无经过验证的治疗方案16,17。空间转录组学和免疫荧光成像等技术为揭示内耳疾病的机制提供了令人期待的机遇，但迄今为止应用仍十分有限。获取并保存内耳器官的方法为应用新型分子技术提供了可能，并可作为传统颞骨组织学（TBH）的有益补充。尽管本文所述方法目前仅用于免疫荧光染色，但我们认为所获取的组织质量足以满足空间转录组学分析的需求。

本方案的主要局限性在于其依赖于可获取的手术材料。目前，迷路切除术很少被用于梅尼埃病的治疗，即使是繁忙的转诊中心，每年也可能仅进行数例此类手术。经迷路入路前庭神经鞘瘤切除术的实施频率较高；然而，该技术可能会延长原本就已较长的手术时间。我们估计，将乳突腔浸入水中并在水下开放半规管的操作会使手术时间增加约30分钟。此外，尚未开展并行比较分析，以评估采用本技术获取的组织质量与在迷路切除术或前庭神经鞘瘤切除术中常规获取前庭器官组织的质量差异，因为无法利用单个供体获取的组织进行此类分析。未来还需进一步研究，以明确器官获取过程中各种条件对组织在显微镜检查及其他技术应用中的质量影响。

综上所述，我们介绍了一种在迷路切除术期间进行水下采集前庭终器的新技术，该技术能够获得高质量的组织样本，且保留了前庭毛细胞及其神经连接。该方法可在尽可能接近正常生理条件的环境中进行组织采集，可能为研究人类内耳提供一种有用的工具。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Mohamed Lehar 在本项目中的协助。本研究由国家聋哑与其他交流障碍研究所（U24DC020850）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10倍磷酸盐缓冲液储备液Sigma-AldrichP5493
32%多聚甲醛储备液ThermoFisher Scientific50-980-495
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔二抗Jackson Immunoresearch111545144
Alexa Fluor 568 标记的山羊抗小鼠二抗Jackson Immunoresearch115575146
Alexa Fluor 647 标记的山羊抗山羊二抗Jackson Immunoresearch705607003
平衡盐溶液ThermoFisher Scientific14040117
牛血清白蛋白Sigma-Aldrich10711454001
共聚焦显微镜Nikon A1 A1
盖玻片（18 mm × 18 mm，厚度 #1.5）Corning 2850-18
Endo-Scrub 2 镜头清洁套件MedtronicIPCES2SYSKIT
乙二胺四乙酸（EDTA）酸性溶液Sigma-AldrichE8008
山羊抗肿瘤调蛋白抗体R&D SystemsAF6345
Hopkins 0度望远镜Karl Storz
小鼠抗钙视网膜蛋白抗体BD Biosciences610908
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP10144
兔抗腱生蛋白C抗体MilliporeAB19013
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5

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