邻近连接分析法研究癌基因诱导的转录-复制冲突

摘要

本文介绍一种利用邻位连接实验（PLA）检测癌基因诱导的转录-复制冲突（TRCs）的高灵敏度和高特异性方法。该方法利用特异性靶向PCNA和磷酸化CTD的RNA聚合酶II（RNAPII）的抗体，能够评估RNA聚合酶II介导的转录过程与DNA复制 machinery 之间的TRC发生频率。

摘要

DNA复制和RNA转录均以基因组DNA为模板，因此需要在空间和时间上对这两个过程进行分离。复制与转录机器之间的冲突，即转录-复制冲突（TRCs），对基因组稳定性构成重大威胁，而基因组稳定性是癌症发生中的关键因素。尽管已鉴定出若干调控此类碰撞的因子，但由于缺乏用于直接可视化和清晰解读的工具，确定其主要成因仍然困难。在本研究中，我们利用邻近连接实验（PLA）直接可视化TRCs，采用针对PCNA和RNA聚合酶II磷酸化CTD的特异性抗体。该方法可精确测量由RNA聚合酶II介导的复制与转录过程之间的TRCs。通过将共价连接DNA引物的抗体与荧光探针的PCR扩增相结合，进一步提高了该方法的灵敏度和特异性，从而实现对内源性TRCs的高效检测。荧光显微镜可用于可视化这些冲突，为研究与癌症相关的基因组不稳定性机制提供了有力工具。该技术填补了直接可视化TRCs的空白，有助于更全面地分析和理解驱动细胞内基因组不稳定的潜在过程。

引言

基因组是复制和转录等重要生物学过程的模板。在健康细胞中，RNA转录和DNA复制机制通常协同作用，并在空间和时间上相互分离^1,2,3,4。然而，在病理条件下（如癌基因过表达），这种协调的协作可能被破坏。

癌基因通常会驱动转录水平升高，从而增加转录与复制机器之间发生碰撞的可能性⁵。某些癌基因会改变染色质结构，使其更易于转录，但可能阻碍复制叉的前进⁵。此外，癌基因的激活可通过加速细胞周期诱导复制应激⁶。在G1/S期转换期间，由于周期蛋白依赖性激酶（CDK）对Rb蛋白的磷酸化，释放出E2F转录因子，进而促进包括周期蛋白、CDK以及管家基因在内的关键蛋白的转录，导致RNA聚合酶II（RNAPII）活性显著升高⁷。组蛋白基因的表达在S期达到峰值，与DNA复制同步进行⁸。此外，某些极长基因全长转录本的合成可能需要超过一个细胞周期的时间⁹。每次进入S期时，....

方案

1. 慢病毒的制备及其对靶细胞系的转导

1. 慢病毒生产²⁴​
   1. 将293T包装细胞以每10 cm培养皿3 × 10⁶个细胞的密度接种于高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；完全培养基）中。在37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中继续培养18–20小时。
   2. 在两个1.5 mL离心管中，分别配制总体积为500 µL的Opti-MEM（低血清培养基）DNA混合物，其中包含9.2 µg psPAX2、2.8 µg pMD2.G，以及12 µg pLVX-KRAS质粒或空载体。
      注意：由于内毒素会显著降低转染效率，建议在质粒纯化过程中去除内毒素。
   3. 将144 µL聚乙烯亚胺（PEI；1 mg/mL）溶于1 mL低血清培养基中，混匀后室温（RT）孵育5分钟。
   4. 在轻柔振荡离心管的同时，将500 µL稀释后的PEI逐滴加入稀释的DNA混合物中。将PEI/DNA混合物于室温孵育15分钟。
   5. 孵育期间，轻轻吸除先前接种的10 cm培养皿中的培养基，并更换为10 mL新鲜完全DMEM培养基。
   6. 孵育结束后，缓慢将DNA:PEI转染混合物滴加至10 cm培养皿中，注意避免细胞脱落。
      注意：PEI是一种常用的转染试剂，但其浓度必须仔....

结果

γH2AX 可作为 DNA 损伤的生物标志物。KRAS（G12D）的过表达会损害这些细胞的基因组稳定性，这在 Western 印迹分析中表现为 γH2AX 信号增强（图 2A）。此外，与空载对照组相比，表达 KRAS（G12D）的细胞中 S9.6 点杂交信号增强（图 2B），表明致癌性 KRAS 的表达导致异常 R-loop 的积累，这可能促进 DNA 断裂的形成。

图3展示了邻近连接实验（PLA）的代表性图像。在这些图像中，细胞核内明亮的绿色点状信号表明PCNA相关复制复合物与RNAPII转录复合物之间的距离小于40 nm。在载体对照细胞中，几乎检测不到绿色点状信号，而在表达KRAS（G12D）的细胞中，每个细胞核内可观察到多个绿色点状信号。这表明致癌性KRAS的表达增加了RNAPII与复制复合物之间相互接触的频率。这些PLA结果与Western blot（图2.......

讨论

RNAPII 转录机器可能阻碍 DNA 复制叉的前进^26,27，从而促进转录-复制冲突（TRCs）和 DNA 损伤，尤其是在癌细胞中^28,29。解析调控 TRCs 的蛋白质并深入理解其作用机制，有助于我们认识这些有害事件的发生过程，并为未来开发新的治疗策略提供指导。因此，要全面理解 TRCs，快速且可靠的 TRC 检测方法至关重要。

本文介绍了一种利用原位 PLA 检测法（in situ PLA assay）检测转录-复制冲突（TRCs）发生频率的实验流程。该方法可简便地评估在癌基因信号存在条件下细胞内 TRC 的发生频率，且无需昂贵的仪器或大量起始材料。本实验方案还包括 S9.6 点印迹（dot blot）和蛋白质印迹（Western blot），以验证由 KRAS (G12D) 表达所产生的 TRC 信号的特异性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Clarity Western ECL 底物	Bio-Rad	1705061
Duolink 原位检测试剂（绿色）	Sigma	DUO92014
FLAG 抗体	Millipore	F7425
gamma H2AX 抗体	Cell Signaling	25955
糖原，分子生物学级	ThermoFisher	R0561
Image J	NIH	https://imagej.net/ij/
硝酸纤维素膜	Amersham	10600004
PCNA 抗体	Cell Signaling	13110
pLVX-Kras G12D	N/A	N/A
pMD2.G	Addgene	12259
蛋白酶 K，重组型，PCR 级	ThermoFisher	EO0491
psPAX2	Addgene	12260
RNAPII 抗体	SCBT	sc-56767
S9.6 抗体	Active motif	65683
UV 交联仪	Fisher Scientific	FB-UVXL-1000