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方法文章

邻近连接分析法研究癌基因诱导的转录-复制冲突

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DOI：

10.3791/67537

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2025年1月10日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Preventio, Hunan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital

本文内容

摘要

本文介绍一种利用邻位连接实验（PLA）检测癌基因诱导的转录-复制冲突（TRCs）的高灵敏度和高特异性方法。该方法利用特异性靶向PCNA和磷酸化CTD的RNA聚合酶II（RNAPII）的抗体，能够评估RNA聚合酶II介导的转录过程与DNA复制 machinery 之间的TRC发生频率。

摘要

DNA复制和RNA转录均以基因组DNA为模板，因此需要在空间和时间上对这两个过程进行分离。复制与转录机器之间的冲突，即转录-复制冲突（TRCs），对基因组稳定性构成重大威胁，而基因组稳定性是癌症发生中的关键因素。尽管已鉴定出若干调控此类碰撞的因子，但由于缺乏用于直接可视化和清晰解读的工具，确定其主要成因仍然困难。在本研究中，我们利用邻近连接实验（PLA）直接可视化TRCs，采用针对PCNA和RNA聚合酶II磷酸化CTD的特异性抗体。该方法可精确测量由RNA聚合酶II介导的复制与转录过程之间的TRCs。通过将共价连接DNA引物的抗体与荧光探针的PCR扩增相结合，进一步提高了该方法的灵敏度和特异性，从而实现对内源性TRCs的高效检测。荧光显微镜可用于可视化这些冲突，为研究与癌症相关的基因组不稳定性机制提供了有力工具。该技术填补了直接可视化TRCs的空白，有助于更全面地分析和理解驱动细胞内基因组不稳定的潜在过程。

引言

基因组是复制和转录等重要生物学过程的模板。在健康细胞中，RNA转录和DNA复制机制通常协同作用，并在空间和时间上相互分离1,2,3,4。然而，在病理条件下（如癌基因过表达），这种协调的协作可能被破坏。

癌基因通常会驱动转录水平升高，从而增加转录与复制机器之间发生碰撞的可能性5。某些癌基因会改变染色质结构，使其更易于转录，但可能阻碍复制叉的前进5。此外，癌基因的激活可通过加速细胞周期诱导复制应激6。在G1/S期转换期间，由于周期蛋白依赖性激酶（CDK）对Rb蛋白的磷酸化，释放出E2F转录因子，进而促进包括周期蛋白、CDK以及管家基因在内的关键蛋白的转录，导致RNA聚合酶II（RNAPII）活性显著升高7。组蛋白基因的表达在S期达到峰值，与DNA复制同步进行8。此外，某些极长基因全长转录本的合成可能需要超过一个细胞周期的时间9。每次进入S期时，转录与复制机器在同一基因组区域的同时活动可能导致有害的相互作用，从而引发冲突。这些冲突是基因组不稳定性的一个主要内在来源，与肿瘤发生密切相关。复制机器如何与RNAPII转录协调以避免有害碰撞并维持基因组稳定性，仍是亟待解决的重要问题。因此，直接可视化RNAPII相关的转录-复制冲突（TRCs）对于理解解决这些冲突的分子机制至关重要，并可能为将来利用此类冲突开发治疗策略奠定基础。

转录-复制冲突（TRCs）可能以两种方向出现：迎面冲突，即转录与复制进程彼此相向进行；以及共向冲突，即两者沿相同方向移动。迎面冲突比共向冲突更具破坏性10,11,12,13。DNA-RNA杂交体（R环）的形成已被确认为TRCs的主要驱动因素；因此，大量研究通过检测R环及其在复制和/或转录失调条件下的分布区域，间接推断TRCs的存在10,11。然而，转录来源的R环积累是否构成与复制呈比例的障碍，并与TRCs直接相关，仍是尚未解决的问题。研究人员还通过分析复制叉动态来研究TRCs。例如，报告基因的二维凝胶电泳可揭示位点特异性的复制体暂停现象12，而DNA纤维实验则使研究人员能够检测复制叉速度、复制起始点密度以及复制叉不对称性的变化13。下一代测序技术的发展催生了多种创新方法，如冈崎片段测序（Ok-seq）14,15、起始位点测序（ini-seq）16,17、新生短链测序（SNS-seq）18、Repli-seq19以及聚合酶使用测序（Pu-seq）20。这些技术提供了全基因组范围内复制起始点使用情况、复制叉方向性及复制终止的图谱，揭示了参与复制与转录协调的关键因子。TRIPn-seq是少数能够直接检测转录与复制共占位的技术之一，显著拓展了我们对生理与病理条件下DNA复制与转录动态组织的理解21。尽管这些基于测序的方法提供了宝贵的见解，但其高昂的成本和耗时的特性限制了其更广泛的应用。因此，建立一种更明确、高灵敏度、便捷且快速的检测方法，以在单细胞水平上可视化并量化TRCs，显得尤为关键。

原位邻近连接检测（in situ proximity ligation assay, PLA），也称为 Duolink PLA 技术，是一种用于评估组织切片或细胞培养中靶蛋白物理邻近关系的强有力方法。该技术仅在两种蛋白或蛋白复合物彼此距离在 40 nm 范围内时才会产生信号。该方法需要针对靶蛋白的两种一抗，且每种一抗应来自不同物种（例如小鼠/兔、兔/山羊或小鼠/山羊）。将样本与这两种一抗孵育后，再加入被称为 PLA 探针的二抗（一种 PLUS 探针和一种 MINUS 探针）。与常规二抗结合于一抗恒定区不同，PLA 探针共价连接有特定的 DNA 引物。当靶蛋白彼此靠近（小于 40 nm）时，连接寡核苷酸可同时与两个 PLA 探针杂交，从而促进其连接的寡核苷酸通过酶促反应连接成完整的 DNA 分子。这一新形成的 DNA 分子作为所检测蛋白相互作用的替代标志物，并可作为扩增的模板。随后使用荧光标记的寡核苷酸探针对扩增产物进行可视化检测。若蛋白之间的距离超过 40 nm，则 PLA 探针无法形成 DNA 模板，因而不会产生可检测的信号。PLA 的示意图见图 1。通过荧光显微镜可观察到代表蛋白邻近关系和/或相互作用的荧光点，这些荧光点的数量和强度均可被定量分析。自 2002 年发明以来，由于其高灵敏度和高特异性，PLA 已广泛应用于蛋白相互作用的监测。与基于测序的检测方法不同，PLA 所需样本量极少，因此特别适用于稀有样本的分析。

研究表明，致癌性KRAS G12D突变的表达会导致转录-复制冲突（transcription-replication conflicts, TRCs）22,23。例如，Meng等人23的研究表明，在人胰腺导管上皮（HPNE）细胞中异位表达KRAS G12D会增强TRCs以及与TRC相关的R-loop。为了实现对细胞系中RNAPII转录与复制机器之间碰撞的检测，我们提供了一种专门为此开发的实验方案。将KRAS (G12D)质粒和空载对照分别转染至人肺上皮BEAS-2B细胞，并通过Western blot验证KRAS (G12D)的表达以及DNA损伤标志物（γH2AX）。通过S9.6点杂交分析确认R-loop的累积，这些结果共同表明表达KRAS (G12D)的细胞中存在复制阻滞和基因组不稳定性。最后，将细胞固定在载玻片上进行PLA检测。为实现对碰撞位点的原位检测，首先使用RNAPII和PCNA的一抗对细胞进行染色，随后使用偶联了PLA探针的二抗进行孵育。在成功连接后形成环状DNA分子，作为后续滚环扩增（rolling circle amplification, RCA）的模板。然后将载玻片用适当的封片介质封片，并在荧光显微镜下观察。图像可使用ImageJ软件进行分析。

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方案

1. 慢病毒的制备及其对靶细胞系的转导

  1. 慢病毒生产24​
    1. 将293T包装细胞以每10 cm培养皿3 × 106个细胞的密度接种于高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；完全培养基）中。在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中继续培养18–20小时。
    2. 在两个1.5 mL离心管中，分别配制总体积为500 µL的Opti-MEM（低血清培养基）DNA混合物，其中包含9.2 µg psPAX2、2.8 µg pMD2.G，以及12 µg pLVX-KRAS质粒或空载体。
      注意：由于内毒素会显著降低转染效率，建议在质粒纯化过程中去除内毒素。
    3. 将144 µL聚乙烯亚胺（PEI；1 mg/mL）溶于1 mL低血清培养基中，混匀后室温（RT）孵育5分钟。
    4. 在轻柔振荡离心管的同时，将500 µL稀释后的PEI逐滴加入稀释的DNA混合物中。将PEI/DNA混合物于室温孵育15分钟。
    5. 孵育期间，轻轻吸除先前接种的10 cm培养皿中的培养基，并更换为10 mL新鲜完全DMEM培养基。
    6. 孵育结束后，缓慢将DNA:PEI转染混合物滴加至10 cm培养皿中，注意避免细胞脱落。
      注意：PEI是一种常用的转染试剂，但其浓度必须仔细优化，以平衡转染效率与细胞毒性。尽管Lipofectamine 3000（转染试剂）成本较高，但在某些细胞系中表现出比PEI更高的转染效率和更低的细胞毒性，从而提高病毒产量。电穿孔是另一种利用电脉冲将核酸导入细胞的方法。虽然有效，但需要专用设备且操作更为繁琐。
    7. 继续培养细胞18小时，随后小心更换为含25 μM氯喹的新鲜10 mL完全DMEM培养基。
    8. 转染72小时后，收集含有病毒颗粒的培养上清液。以500 × g离心5分钟，去除包装用293T细胞。
    9. 收集上清液，并通过0.45 µm聚醚砜（PES）滤膜过滤。可直接使用病毒上清液。
      注意：病毒上清液应分装后在液氮中速冻，并保存于-80 °C，以避免滴度下降。
  2. 靶细胞的慢病毒感染
    1. 将2 × 106个靶细胞BEAS-2B分别接种于两个6 cm培养皿中，在37 °C、5% CO2条件下过夜培养。转导时，确保BEAS-2B细胞融合度约为70%。
    2. 小心吸除旧培养基，分别向两个培养皿中加入适量的0.5 mL KRAS或空载体慢病毒颗粒，并各加入3 mL新鲜完全RPMI-1640培养基。
    3. 将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中培养18–20小时。随后更换含慢病毒颗粒的旧培养基，加入3.5 mL新鲜预热的完全培养基。转导72小时后，收集细胞用于后续实验。
      注意：若病毒过夜孵育导致细胞毒性，可将孵育时间缩短至4小时。为平衡转导效率与细胞健康状态，需考虑以下策略：（1）优化感染复数（MOI）；（2）使用高质量的病毒制剂；（3）使用多聚阳离子（如polybrene）提高转导效率，从而允许使用较低病毒滴度并降低潜在毒性；（4）对于长期研究，可考虑使用可诱导表达系统以时间依赖性方式调控外源基因表达，减轻细胞负担并最小化潜在毒性。

2. 验证KRAS (G12D) 诱导的DNA损伤及R-loop形成

  1. 通过WB实验确认基因表达和DNA损伤
    1. 吸出培养板中的培养基。
    2. 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤细胞，以去除任何残留的培养基或碎片。
    3. 加入少量 1x PBS 以保持细胞在刮取过程中的湿润。
    4. 使用细胞刮刀，以一定角度持握，沿同一方向轻柔地将细胞从表面刮下。
      注意：避免施加过大压力，以免损伤细胞。
    5. 倾斜培养板，用移液器将细胞悬液收集至离心管中，在500 x g 5 分钟后弃去上清液。
    6. 通过稀释2x RIPA缓冲液（见 表1），并在使用前立即加入蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物。
    7. 用预冷的RIPA缓冲液（1x）裂解细胞沉淀，冰上孵育30分钟。在4°C下以15,000 x g离心，去除碎片 g 孵育10分钟。收集上清液，并使用Bradford法测定蛋白浓度。
    8. 向 supernatant 中加入 4 x 十二烷基硫酸钠 (SDS) 样品上样缓冲液，在 95 ℃ 下变性蛋白质 5 分钟 ˚C. 首先，分离40 µg 蛋白质样品在 12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶中电泳分离，随后转移至 0.2 µm 硝酸纤维素膜（参见 材料表).
    9. 转膜结束后，用封闭缓冲液（含0.1% Tween 20的Tris缓冲盐水[TTBS]中加入5%脱脂奶粉）封闭膜 表1]）孵育1小时。
    10. 用 TBST 短暂漂洗膜，然后将膜与抗 FLAG 标签的一抗（以 PBST 1:2500 稀释）共同孵育 γH2AX（PBST中1:1000稀释）（参见 材料表）在4℃下过夜 ˚C.
    11. 移除一抗，用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。
    12. 将膜浸入稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗溶液（1:5,000，溶于含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液）中，室温（RT）孵育1小时。
    13. 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。
    14. 通过增强型化学发光（ECL）试剂可视化蛋白水平（参见 材料表).
  2. 点印迹法检测R-loop25​
    1. 吸出培养板中的培养基。
    2. 用1× PBS轻轻洗涤细胞，以去除任何残留的培养基或碎片。
    3. 加入少量 1x PBS 以保持细胞在刮取过程中的湿润。
    4. 使用细胞刮刀，以一定角度持握，沿同一方向轻柔地将细胞从表面刮下。
      注意：避免施加过大压力，以免损伤细胞。
    5. 倾斜培养板，用移液器将细胞悬液收集至离心管中，在500 x g 5 分钟后弃去上清液。
    6. 裂解 2 × 106 细胞与300 µ冰冷的细胞裂解缓冲液（L）（参见 表1）。冰上孵育10分钟。以500 × g离心 g 4℃下5分钟 ˚C，弃去上清液。沉淀物含有细胞核。
    7. 使用宽孔枪头将每个沉淀重悬于300 µ预冷的核裂解缓冲液 L（参见 表 1).
    8. 加入3 µ20 mg/mL 蛋白酶K 的 L（参见 材料表) 加入各样本，55℃消化3-5小时 °C.
    9. 加入100 µ洗脱缓冲液 L（参见 表1) 加入每个试管中并充分混匀。
    10. 加入400 µL 酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，pH 8.0）加入各管。剧烈涡旋后，于 12,000 x g 4℃下5分钟 °C 以分离 DNA 与其他细胞成分。
    11. 小心地将上层水相转移至新试管中。
    12. 加入1/10体积的3 M醋酸钠（pH 5.2）和2.5体积预冷的100%乙醇至样品中，沉淀DNA。充分混匀后于-20℃孵育4小时或过夜。 ˚C.
      ​注意：添加糖原（参见 材料表) 加入样品可提高乙醇沉淀中的DNA回收率。最终糖原浓度约为0.05–1 µ克/µL.
    13. 通过在 12,000 x g 条件下离心沉淀 DNA g 4℃下孵育30分钟 °C. 弃去上清液，注意不要扰动沉淀。
    14. 用1 mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀，然后在12,000 x g下再次离心5–15分钟 g 4℃时 °C.
    15. 小心弃去上清液，避免扰动DNA沉淀。
    16. 将DNA沉淀在空气中干燥5-10分钟。
    17. 加入50 μL溶液溶解DNA沉淀 µL 预热的 TE 缓冲液（pH 8.0），37℃孵育 30 分钟 °C. 测定每个样本的DNA浓度。
    18. 在TE缓冲液中将DNA稀释至所需浓度（5 ng/ µL 至 200 ng/µL). 均匀地点样 20 µ使用点印迹装置将每个样品的 L 加到带正电荷的尼龙膜上。
      注意：使用点杂交法检测R-loop时，建议每个点点样约500 ng基因组DNA。该用量在使用特异性结合RNA-DNA杂交体的S9.6单克隆抗体时，已被证明可提供足够的检测灵敏度。
    19. 通过将 DNA 与尼龙膜交联来固定 DNA（参见 材料表）通过紫外交联仪 "自动交联" 设置（1,200 µJ × 100）（参见 材料表).
    20. 将膜浸入 封闭缓冲液 （参见 表1) 室温孵育1小时。然后用TBST短暂漂洗膜。
    21. 过夜孵育膜与一抗（参见 材料表) 在 4°C. S9.6 在含 5% BSA 的 TBST 中的稀释比例为 1:1,000。
    22. 除去一抗，用TBST洗涤3次，每次10分钟。
    23. 在室温下，用含5% BSA的TBST缓冲液将膜与HRP标记的二抗孵育1小时。
    24. 去除二抗，用 TBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
    25. 通过 ECL（增强型化学发光）试剂可视化 R-loop 水平（参见材料表）。

3. PLA 检测

  1. 细胞准备
    注意：用 KRAS G12D 癌基因转导细胞会导致转录-复制冲突（TRCs）增加，这可通过阳性 PLA 信号加以证实。该方法可有效区分癌基因驱动的 TRCs 与背景水平，无需抗生素筛选。然而，在转导后实施抗生素筛选可通过富集成功转导的细胞群体，从而提高检测信号的整体强度，增强该检测方法的灵敏度和特异性。
    1. 将直径为 12 mm 的盖玻片放入 12 孔板的每个孔中。
    2. 在感染后 24 小时，将慢病毒转导的细胞接种至这些孔中，并在 37 °C、5% CO2 条件下，用 500 µL 完全 RPMI-1640 培养基在盖玻片上培养细胞。
    3. （优化步骤）若实验设计中包含抗生素筛选以富集成功转导的细胞，可在该阶段向培养基中加入适当的抗生素。
    4. 监测细胞，确保其在感染后 48–72 小时达到约 60% 的汇合度。
    5. 小心移除 RPMI-1640 培养基，并在冰上用预冷的 0.5% NP-40 对细胞进行预提取 4 分钟。
    6. 直接加入 500 µL 固定缓冲液（见表 1），在室温下固定细胞 15 分钟。
      注意：建议在固定步骤前不要洗涤细胞，因为这可能导致细胞从生长表面脱落，尤其是对脱落敏感的细胞系；因此，通常更推荐直接添加固定液。
    7. 通过移除固定缓冲液并用 1× PBS 小心洗涤细胞 3 次，以终止反应。
    8. 吸除 PBS，并向细胞中加入 500 µL 预冷的 100% 甲醇。
    9. 在 -20 °C 下孵育 15–30 分钟，以透化细胞。
    10. 用 Duolink 封闭液在室温下封闭细胞 1 小时。
  2. 抗体染色
    1. 将小鼠抗 RNAPII 8WG16 抗体（1:500）和兔抗 PCNA (D3H8P) 抗体（1:500）用 Duolink 抗体稀释缓冲液稀释。将细胞与一抗混合物在湿盒中于 4 °C 孵育过夜。
      注意：可仅使用其中一种一抗（抗 RNAPII 或抗 PCNA）进行 PLA 实验，而省略另一种一抗，以帮助识别由单个抗体或 PLA 探针非特异性相互作用引起的背景信号。
    2. 使用无绒废纸轻轻从载玻片上移除一抗，避免接触细胞。随后用 1× PBS 洗涤细胞 3 次。
    3. 按照以下步骤配制 PLA 探针（或二抗）（见表 2），混匀后室温静置 20 分钟。
    4. 将二抗混合物加至载玻片上，在湿盒中室温孵育 2 小时。
  3. 连接与扩增
    1. 弃去二抗混合物，用 1× Buffer A 洗涤载玻片两次，每次 5 分钟。
    2. 按照以下步骤配制连接反应混合液（见表 2）。
    3. 向每张盖玻片上加 15 µL 连接混合液，在湿盒中 37 °C 孵育 30 分钟。
    4. 用 1× Buffer A 洗涤载玻片两次，每次 2 分钟。
    5. 按照以下步骤配制扩增混合液（见表 2）。
    6. 向每张载玻片上加 15 µL 扩增混合液，在湿盒中 37 °C 孵育 100 分钟。弃去扩增混合液，并用 1× Buffer B 洗涤两次，每次 10 分钟。
    7. 用 0.01× Buffer B 洗涤载玻片一次，持续 1 分钟。
    8. 吸除 Buffer B，并用含 DAPI 的 Duolink In Situ 封片液封片。
  4. 图像分析与阈值确定：
    1. 使用 ImageJ 对 PLA 焦点数量进行定量。自动图像分析软件有助于客观地量化 PLA 信号。选择每个细胞核中 3 个或以上 PLA 焦点作为阈值，因为在未受干扰条件下，仅有不到 1% 的对照细胞会出现 3 个 PLA 焦点。
      注意：由于该阈值是通过分析多个样本和对照实验确定的，为确保可比性，所有样本的成像参数（如曝光时间、增益）必须保持一致。

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结果

γH2AX 可作为 DNA 损伤的生物标志物。KRAS（G12D）的过表达会损害这些细胞的基因组稳定性，这在 Western 印迹分析中表现为 γH2AX 信号增强（图 2A）。此外，与空载对照组相比，表达 KRAS（G12D）的细胞中 S9.6 点杂交信号增强（图 2B），表明致癌性 KRAS 的表达导致异常 R-loop 的积累，这可能促进 DNA 断裂的形成。

图3展示了邻近连接实验（PLA）的代表性图像。在这些图像中，细胞核内明亮的绿色点状信号表明PCNA相关复制复合物与RNAPII转录复合物之间的距离小于40 nm。在载体对照细胞中，几乎检测不到绿色点状信号，而在表达KRAS（G12D）的细胞中，每个细胞核内可观察到多个绿色点状信号。这表明致癌性KRAS的表达增加了RNAPII与复制复合物之间相互接触的频率。这些PLA结果与Western blot（图2...

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讨论

RNAPII 转录机器可能阻碍 DNA 复制叉的前进26,27，从而促进转录-复制冲突（TRCs）和 DNA 损伤，尤其是在癌细胞中28,29。解析调控 TRCs 的蛋白质并深入理解其作用机制，有助于我们认识这些有害事件的发生过程，并为未来开发新的治疗策略提供指导。因此，要全面理解 TRCs，快速且可靠的 TRC 检测方法至关重要。

本文介绍了一种利用原位 PLA 检测法（in situ PLA assay）检测转录-复制冲突（TRCs）发生频率的实验流程。该方法可简便地评估在癌基因信号存在条件下细胞内 TRC 的发生频率，且无需昂贵的仪器或大量起始材料。本实验方案还包括 S9.6 点印迹（dot blot）和蛋白质印迹（Western blot），以验证由 KRAS (G12D) 表达所产生的 TRC 信号的特异性。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由南华大学的启动资金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Clarity Western ECL 底物Bio-Rad1705061
Duolink 原位检测试剂（绿色）SigmaDUO92014
FLAG 抗体MilliporeF7425
gamma H2AX 抗体Cell Signaling25955
糖原，分子生物学级ThermoFisherR0561
Image JNIHhttps://imagej.net/ij/
硝酸纤维素膜 Amersham10600004
PCNA 抗体Cell Signaling13110
pLVX-Kras G12DN/AN/A
pMD2.G Addgene 12259
蛋白酶 K，重组型，PCR 级ThermoFisherEO0491
psPAX2Addgene 12260
RNAPII 抗体SCBTsc-56767
S9.6 抗体Active motif65683
UV 交联仪Fisher ScientificFB-UVXL-1000

参考文献

  1. Wei, X., Samarabandu, J., Devdhar, R. S., Siegel, A. J., Acharya, R., Berezney, R. Segregation of transcription and replication sites into higher order domains. Science. 281 (5382), 1502-1505 (1998).
  2. García-Muse, T., Aguilera, A. Transcription-replication conflicts: how they occur and how they are resolved. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 553-563 (2016).
  3. Hamperl, S., Cimprich, K. A. Conflict resolution in the genome: how transcription and replication make it work. Cell. 167 (6), 1455-1467 (2016).
  4. Merrikh, H., Zhang, Y., Grossman, A. D., Wang, J. D. Replication-transcription conflicts in bacteria. Nat Rev Microbiol. 10 (7), 449-458 (2012).
  5. Kotsantis, P., Petermann, E., Boulton, S. J. Mechanisms of oncogene-induced replication stress: Jigsaw falling into place. Cancer Discov. 8 (5), 537-555 (2018).
  6. Gnan, S., Liu, Y., Spagnuolo, M., Chen, C. -L. The impact of transcription-mediated replication stress on genome instability and human disease. Genome Instab Dis. 1, 207-234 (2020).
  7. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 8518-8528 (2013).
  8. Stein, G. S., Stein, J. L., Van Wijnen, A. J., Lian, J. B. Transcriptional control of cell cycle progression: the histone gene is a paradigm for the G1/S phase and proliferation/differentiation transitions. Cell Biol Int. 20 (1), 41-49 (1996).
  9. Helmrich, A., Ballarino, M., Tora, L. Collisions between replication and transcription complexes cause common fragile site instability at the longest human genes. Mol Cell. 44 (6), 6966-6977 (2011).
  10. Lang, K. S., et al. Replication-transcription conflicts generate R-loops that orchestrate bacterial stress survival and pathogenesis. Cell. 170 (4), 787-799 (2017).
  11. Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. Transcription-replication conflict orientation modulates R-loop levels and activates distinct DNA damage responses. Cell. 170 (4), 774-786 (2017).
  12. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. EMBO J. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  13. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Mechanisms of transcription-replication collisions in bacteria. Mol Cell Biol. 25 (3), 888-895 (2005).
  14. Chen, Y. H., et al. Transcription shapes DNA replication initiation and termination in human cells. Nat Struct. Mol Biol. 26 (1), 167-177 (2019).
  15. Petryk, N., et al. Replication landscape of the human genome. Nat Commun. 7, 110208(2016).
  16. Guilbaud, G., Murat, P., Wilkes, H. S., Lerner, L. K., Sale, J. E., Krude, T. Determination of human DNA replication origin position and efficiency reveals principles of initiation zone organisation. Nucleic Acids Res. 50 (13), 7436-7450 (2022).
  17. Langley, A. R., Gräf, S., Smith, J. C., Krude, T. Genome-wide identification and characterisation of human DNA replication origins by initiation site sequencing (ini-seq). Nucleic Acids Res. 44 (21), 10230-10247 (2016).
  18. Besnard, E., et al. Unraveling cell type-specific and reprogrammable human replication origin signatures associated with G-quadruplex consensus motifs. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 837-844 (2012).
  19. Zhao, P. A., Sasaki, T., Gilbert, D. M. High-resolution Repli-Seq defines the temporal choreography of initiation, elongation and termination of replication in mammalian cells. Genome Biol. 21 (1), 176(2020).
  20. Koyanagi, E., et al. Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome. Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).
  21. St Germain, C. P., Zhao, H., Sinha, V., Sanz, L. A., Chédin, F., Barlow, J. H. Genomic patterns of transcription-replication interactions in mouse primary B cells. Nucleic Acids Res. 50 (4), 2051-2073 (2022).
  22. Edwards, D. S., et al. BRD4 prevents R-Loop formation and transcription-replication conflicts by ensuring efficient transcription elongation. Cell Rep. 32 (12), 108166(2020).
  23. Meng, F., et al. Base-excision repair pathway regulates transcription-replication conflicts in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Rep. 43 (10), 114820(2024).
  24. Pirona, A. C., Oktriani, R., Boettcher, M., Hoheisel, J. D. Process for an efficient lentiviral cell transduction. Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa005(2020).
  25. Ramirez, P., Crouch, R. J., Cheung, V. G., Grunseich, C. R-Loop analysis by dot-blot. J Vis Exp. 167, e62069(2021).
  26. Gómez-González, B., Aguilera, A. Transcription-mediated replication hindrance: a major driver of genome instability. Genes Dev. 33 (15-16), 1008-1026 (2019).
  27. Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V., Macek, B., Popov, N. RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nat Commun. 14 (1), 5147(2023).
  28. Zardoni, L., et al. Elongating RNA polymerase II and RNA:DNA hybrids hinder fork progression and gene expression at sites of head-on replication-transcription collisions. Nucleic Acids Res. 49 (22), 12769-12784 (2021).
  29. Xiao, Y., et al. Profiling of RNA-binding protein binding sites by in situ reverse transcription-based sequencing. Nat Methods. 21, 247-258 (2024).
  30. Tang, J., et al. Enhancing transcription-replication conflict targets ecDNA-positive cancers. Nature. 635, 210-218 (2024).

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