制备 结核分枝杆菌 利用培养滤液研究结核病发病机制

摘要

本文演示了结核分枝杆菌（Mtb）培养滤液（CF）的制备方法，该滤液是含有细菌分泌蛋白的培养基。Mtb通过分泌蛋白质来调控宿主的信号通路和免疫应答，这对致病过程至关重要。所制备的CF通过质谱分析，以鉴定所有分泌因子。

摘要

结核分枝杆菌（Mtb）会向宿主细胞分泌多种蛋白质，以调控宿主的多种细胞过程，例如宿主信号通路、免疫应答、细胞凋亡等，从而增强其存活能力。尽管少数分泌因子的功能已被阐明，但仍有大量分泌蛋白尚未被表征。因此，研究Mtb的分泌蛋白是当前重要的科研方向。Mtb在三种不同的分泌系统——通用分泌系统、双精氨酸转运系统以及特化的Ⅶ型分泌系统——的协助下，将蛋白质分泌至胞外空间。为了鉴定新的分泌分子并功能表征已知因子，研究人员需要制备分泌组（secretome）。本文概述了分泌组制备及质谱分析样品前处理的方法。分泌组的制备需格外谨慎，以避免胞质蛋白的污染，可通过使用针对已明确表征的膜蛋白、分泌蛋白和胞质蛋白的抗体进行检测来监控污染情况。所获得的培养滤液可用于多种研究目的，包括探究其对宿主免疫调节的特性。

引言

结核分枝杆菌（Mtb），这种全球最致命的病原体之一，可通过感染者打喷嚏或咳嗽时产生的气溶胶传播，感染健康个体¹进入肺部后，它会被肺泡巨噬细胞吞噬，并劫持宿主免疫系统以维持自身存活。在多种宿主调节机制中 Mtb 生存所需的因素之一是分泌型毒力因子。细菌在生长过程中分泌到培养基中的蛋白质被称为培养滤液（CF）蛋白。²这些培养滤液蛋白有助于细菌在宿主细胞内的恶劣环境中存活。 Mtb 具有三种不同类型的分泌系统：一种特化的Ⅶ型分泌系统（T7SS）、一种通用的Sec分泌系统（Sec系统）和一种双精氨酸分泌系统（Tat系统）。T7SS是放线菌中最特有的分泌系统，不同于革兰氏阴性菌中的Ⅰ至Ⅵ型分泌系统³跨膜分泌非折叠蛋白主要由Sec系统介导，这些蛋白通过其N端信号序列被识别。^4,5折叠或部分折叠的蛋白质通过Tat系统进行转运，该系统由N端含有双精氨酸基序的信号序列所识别^6,7Sec 和 Tat 系统如何调控蛋白质分泌仍有待阐明。

已知在结核分枝杆菌（Mtb....

方案

注意：此处，我们使用 H37Rv 致病性实验室菌株 Mtb应在生物安全三级实验室（BSL-3）中进行细菌培养的培养及培养上清液的分离操作。从菌种复苏到滤液制备的全过程均需在BSL-3设施中完成。

1. 接种 Mtb 培养

1. 生物安全三级实验室工作区域的准备
   1. 使用前打开生物安全柜的紫外灯照射10分钟。使用前后均需用75%乙醇清洁生物安全柜。根据生物安全指南，将使用过的材料丢弃至适当的废物容器中。
2. 初级和次级抗体的制备 Mtb H37Rv 培养物
   1. 从 -80 °C 取出甘油菌种保存液，在室温下解冻。使用四个独立的保存液样本作为生物学四重重复。
   2. 取10 mL 7H9培养基（表1) 含10% ADC（9 mL 7H9培养基和1 mL ADC）的100 mL灭菌带螺口盖锥形瓶中。
      注意：7H9 + ADC：7H9 为商业获取的富含营养的培养基，我们向其中添加 ADC（ADC：白蛋白、右旋糖和过氧化氢酶）； 表 2ADC 和 OADC 均可用于培养菌种。锥形瓶可为培养物提供更好的通气效果，但也可使用组织培养瓶来培养细菌细胞。

结果

在本实验方案中，我们展示了从Mycobacteria中分离培养滤液蛋白的方法（图1A）。随后通过检测多种标志物来验证培养滤液蛋白的分离效果。如方案所述，采用考马斯亮蓝染色检测蛋白上样量。在WCL组分中可观察到呈条带状分布的蛋白条带（最末泳道，图1B），而在CF（培养滤液）泳道中，所有蛋白均不可见，且各泳道的蛋白上样量均一。通过使用不同抗体进行蛋白质印迹（Western blot）检测所分离的不同组分。其中，Ag85B用于检测培养滤液组分，在图1C中可见大小约为35 kDa的蛋白条带，该条带在培养滤液和WCL中均存在。PknB用于检测胞质组分，在图1C中，大小约为75 kDa的PknB条带仅出现在WCL中，而未在培养滤液组分中检出，表明培养滤液的分离未受到胞质蛋白的污染。

将培养滤液蛋白用于质谱样品制备（

讨论

一个关键的研究领域是了解结核分枝杆菌（Mtb）的致病机制，并开发有效的诊断方法和疫苗^22,23。从Mtb培养基中分离培养滤液蛋白，是一种能够鉴定病原体所分泌毒力因子的方法。研究分泌蛋白在调控Mtb致病过程中的作用，不仅可以获得机制性认识，还可能为治疗干预提供候选靶点。研究表明，H37Rv菌株的培养滤液中含有能够调节宿主细胞稳态、细胞过程及转录调控的蛋白质。某些培养滤液蛋白有助于细菌侵入宿主细胞，并帮助细菌在巨噬细胞内存活。这些蛋白可操控宿主细胞信号通路，为细菌生存创造适宜的微环境。

本方案详细介绍了结核分枝杆菌（Mtb）培养滤液的制备流程，从在生物安全三级（BSL-3）实验室中复苏致病性Mtb菌株开始，培养至获得用于分离培养滤液的目标对数生长期细菌培养物。方案涵盖质谱分析前的样品制备及后续的数据分析。此外，我们还介绍了利用培养滤液处理腹腔巨噬细胞以评估其生物学.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 µm 注射器滤器	mdi	SYPL0601MNXX204
0.2µm 硝酸纤维素膜	Amersham	10600001
37% 盐酸	Merck	H1758
丙酮	EMPLURA MERCK	SL9F690866
乙腈	Sigma-Aldrich	34851-2L
丙烯酰胺	BIORAD	1610107
白蛋白	Bio Basic Canada	货号：AD0023
Amicon Ultra-15	Merck, Millipore	UFC900396
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	09830-500G
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	A3678-100G
抗 Ag85B 抗体	Abcam	AB43019
HRP 标记的抗小鼠二抗	Thermo Fischer	62-6520
天冬酰胺	Sigma-Aldrich	A0884-500G
双丙烯酰胺	SIGMA	146072-500G
BSA	Merck	MB083-500G
C-18 柱	Thermo Fischer	SEM SS18V
过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	C1345
柠檬酸	Sigma-Aldrich	C0759-500G
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
Difco Middle brook 7H9 肉汤	Fisher Scientific	271310
柠檬酸铁铵(III)	Sigma-Aldrich	F5879-100G
甲酸 98-100%	Merck	Z0823704246
冰乙酸 100%	Merck	CD0C700160
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G8898-1KG
甘氨酸	SIGMA	G8898-1KG
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
Immobilion Western 化学发光 HRP 底物	Merck	WBKLS0500
碘乙酰胺	Amersham	RPN6302V
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M7506-500G
Mycobroswer
油酸	Sigma	货号：O1008
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Fischer	23225
Pierce 胰蛋白酶蛋白酶	Thermo Fischer	90058
Proteome Discoverer 2.0	Thermo Fischer Scientific
Q-Exactive HF（Thermo Scientific）（蛋白质组学实验——肽段测序、蛋白质鉴定与定量）	Thermo Fischer Scientific
氯化钠	Sigma	货号：S3014
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7773-1KG
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L3771-1KG
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706-25
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281-100ML
Tris 碱	BioRad	161-0719
Tris-HCl	AMRESCO	0234-500G
吐温 80	Sigma-Aldrich	P1754
UniProt 蛋白质数据库
尿素	MP Bio	194857