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方法文章

分离人BAMBIhighMFGE8high脐带来源间充质基质细胞

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DOI：

10.3791/67545

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2025年1月10日

 ,  , 
1Department of Rheumatology and Immunology, Nanjing Drum Tower Hospital, Affiliated Hospital of Medical School, Nanjing University

本文内容

摘要

分离构成异质性人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）三大主要亚群之一的BAMBIhighMFGE8high 间充质干细胞（MSCs），有助于全面理解该亚型的特性与功能，从而为其未来在特定疾病中提升临床疗效的应用提供支持。本文介绍了一种分选BAMBIhighMFGE8high UC-MSCs的方法。

摘要

脐带来源的间充质基质细胞/干细胞（UC-MSCs）具有低免疫原性和强大的免疫调节作用，可用于治疗多种疾病。人UC-MSCs是一类异质性细胞群体，包含三种主要亚群，其细胞形态、增殖速率、分化能力及免疫调节功能各不相同。此前研究发现，从UC-MSCs中成功分离出的第一个亚群——BAMBIhighMFGE8high UC-MSCs，无法缓解狼疮性肾炎。因此，该亚群在MSC治疗疾病中的功能及其潜在机制仍不清楚。有必要对BAMBIhighMFGE8high UC-MSCs进行分离，并进一步研究其表型、代谢特征和功能，以全面了解该MSC亚群的本质。本实验方案详细描述了从人UC-MSCs中分离BAMBIhighMFGE8high亚群的方法。通过流式细胞术分选，利用两种表面标志物BAMBI和MFGE8对UC-MSCs亚群进行标记。分离后的细胞进行培养，并通过流式细胞术分析进行验证。采用RT-qPCR技术鉴定BAMBIhighMFGE8high UC-MSCs中特异性表达的基因。该方案可实现高效且高纯度的细胞分选，并阐明BAMBIhighMFGE8high UC-MSCs的标志物表达谱。

引言

人类间充质基质/干细胞（MSCs）是一类体细胞前体细胞，具有分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞及其他细胞类型的潜能1。MSCs最初从骨髓中分离获得，目前也广泛来源于脐带、脂肪组织及其他组织2。由于脐带来源的MSCs（UC-MSCs）易于获取，并且具有低免疫原性和免疫抑制作用，因此在多种疾病的临床试验中得到广泛应用3,4,5。尽管MSC治疗在疾病干预方面展现出良好的应用前景，但其治疗效果在不同个体间存在不一致性6。然而，导致MSC治疗效果不稳定的原因仍不明确。

分子波动性、形态、分化潜能和治疗功能构成了间充质干细胞（MSC）的异质性。一些研究还提出，MSC包含具有不同功能的亚群7,8，并利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术探索MSC的异质性9,10。研究结果表明，人脐带来源的MSC（UC-MSC）具有不同转录组特征的独特亚群，然而，目前仅有少数研究成功分离出所谓的MSC亚群。我们先前通过scRNA-seq和生物信息学分析，根据其分子特征将人UC-MSC划分为三个亚组，并进一步纯化和功能验证了其中BAMBIhighMFGE8high UC-MSC亚群11。然而，该亚群未能缓解狼疮性肾炎。因此，有必要在其他疾病模型中测试BAMBIhighMFGE8high MSC的治疗效果，以明确其真实功能。

本方案描述了通过流式细胞术结合荧光激活细胞分选（FACS）从人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）中分离BAMBIhighMFGE8high亚群的方法，以及该BAMBIhighMFGE8high亚群的特征。

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方案

本研究遵循1989年《赫尔辛基宣言》提出的原则，并经南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员会批准（批准号：202019701）。人脐带来自南京大学医学院附属鼓楼医院健康产妇自然分娩后，产妇均已知情同意将其用于本研究。人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）的分离方法如先前报道所述11。

1. 分离前脐带间充质干细胞的培养与鉴定

  1. 当MSCs达到70-80%融合度（P0代）时，用PBS洗涤细胞一次，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，37 °C孵育2分钟。随后加入9 mL完全培养基以中和胰蛋白酶，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在300 × g条件下离心5分钟收集细胞。弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，将每皿细胞分种至三个T75培养瓶（P1代），置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养。
  2. 经胰蛋白酶消化传代2次后，在P3代时按照步骤1.1所述方法收获细胞。离心后弃去上清液，将细胞重悬于FACS染色缓冲液（含2% FBS的1× PBS）中并进行细胞计数。用FACS染色缓冲液调整细胞浓度至终浓度为5-10 × 106 个细胞/mL，并将细胞悬液置于冰上保存。
  3. 将上述细胞悬液按每管100 µL分装至不同的1.5 mL离心管中。在4 °C条件下，向各管中分别加入同型对照抗体以及针对CD29、CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45、CD79和HLA-DR的FACS抗体（均为1:200稀释），避光孵育30分钟。
  4. 用FACS染色缓冲液洗涤细胞两次，每次在300 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀细胞重悬于200 µL FACS染色缓冲液中，用于流式细胞术分析以鉴定MSC表面标志物。

2. 通过流式细胞术分离BAMBIhigh MFGE8high UC-MSCs

  1. 分离BAMBIhighMFGE8high UC-MSC时，将UC-MSC培养至密度约为5-10 × 106个细胞。用0.5 mM EDTA消化细胞5分钟，直至细胞开始呈现圆形形态，加入完全培养基将细胞转移至15 mL锥形管中，并反复吹打细胞悬液数次以制备单细胞悬液。取10 µL细胞悬液进行细胞计数，计算收获的细胞总数。将含细胞悬液的锥形管在300 × g下离心5分钟以收集细胞。
  2. 将细胞重悬于1 mL完全培养基中，终浓度为5-10 × 106个细胞/mL，并将细胞悬液置于冰上保存。
  3. 将细胞分装至四个1.5 mL微量离心管中（仅空白细胞；BAMBI标记细胞；MFGE8标记细胞；以及同时标记BAMBI和MFGE8的细胞）。
  4. 向各管中加入适当浓度的一抗（MFGE8和BAMBI，均为1:100），混匀后室温孵育15分钟。
  5. 用1× PBS洗涤标记后的细胞一次，并在300×g下离心5分钟。弃去上清液。将细胞重悬于1 mL完全培养基中，加入偶联荧光二抗（山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647，均为1:1,000），混匀后避光室温孵育15分钟。
  6. 按照步骤2.5所述方法，用1× PBS洗涤标记细胞一次。将细胞重悬于500 µL完全培养基中，经70 µm细胞筛过滤以去除团块和碎片，将滤液转移至15 mL管中用于流式细胞分选。
  7. 运行未加抗体的空白细胞管（阴性对照），调节前向散射（FSC）和侧向散射（SSC），以确定抗体染色阴性群体的设门范围。
  8. 运行单抗体标记的细胞管（即MFGE8 + 山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor 488，或BAMBI + 山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor 647）作为设门对照，以确定图中阳性信号的起始位置。
  9. 运行实验样本管进行分选，收集BAMBIhighMFGE8high细胞群体。
  10. 将分选后的BAMBIhighMFGE8high MSC接种于24孔板中，在37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养。
  11. 当分选后的BAMBIhighMFGE8high MSC传代两次以获得足够数量的细胞后，消化细胞并进行分选后分析，通过流式细胞术确认分选细胞群体的纯度，操作如步骤2.1–2.9所述。或者，若收集的细胞数量过少，可采用针对人BAMBI和MFGE8表达的传统免疫荧光法检测分选细胞的纯度。

3. BAMBIhigh MFGE8high 间充质干细胞的表征

  1. 将分选后的BAMBIhighMFGE8high MSCs接种于12孔板中培养，在显微镜下观察其细胞形态，并与未分选的MSCs进行比较。
    注意：通常情况下，BAMBIhighMFGE8high细胞的生长速度比未分选的脐带间充质干细胞（UC-MSCs）更快。
  2. 当12孔板中的细胞融合度达到约90%时，吸除细胞培养基，用1× PBS洗涤细胞一次，然后向每孔加入500 µL RNA提取试剂，在室温（RT）下缓慢振荡5分钟。
  3. 用移液器吹打混匀后，将混合液转移至无RNase和DNase的离心管中。加入100 µL氯仿，盖紧管盖，涡旋剧烈振荡15秒，随后于室温静置3分钟。
  4. 在11,000 × g、4 °C条件下离心15分钟。
  5. 将约200 µL上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，充分上下吹打数次混匀，然后于室温静置10分钟。
  6. 在11,000 × g、4 °C条件下离心15分钟，弃去上清液。
  7. 向管中沉淀加入500 µL 75%乙醇，轻轻颠倒混匀数次。
  8. 在6,000 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。再以6,000 × g离心10秒，小心用移液器吸除残留液体，并在室温下干燥沉淀。
  9. 加入10 µL无RNase的水溶解RNA沉淀，使用分光光度计测定RNA浓度。
  10. 按照试剂盒说明书，以最多1 µg总RNA为模板合成第一链cDNA。
  11. 根据试剂盒说明书，使用qPCR试剂盒检测并定量基因表达水平。
    注意：所用DNA引物的序列列于表1中。

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结果

图1 显示了人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）的细胞表面标志物表达谱。培养的间充质干细胞对CD44、CD73、CD90和CD105的表达呈强阳性，而对CD14、CD34、CD45、CD79和HLA-DR的表达呈阴性。BAMBIhighMFGE8high MSCs从培养的人UC-MSCs中分选获得，并在扩增3-4代后通过流式细胞术重新分析其BAMBI和MFGE8的表达水平（图2）。在此过程中，BAMBIhighMFGE8high MSCs的比例因供体差异和解离方法不同而有所波动（图3和 图4）。图5展示了与未分选的MSCs相比，BAMBIhighMFGE8high MS...

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讨论

本方案描述了如何从人脐带间充质干细胞（UC-MSCs）中分离并富集 BAMBIhighMFGE8high 亚群。该方法对于进一步研究该间充质干细胞亚群的形态、生长及功能具有重要意义。其中某些步骤对于成功分离 BAMBIhighMFGE8high 细胞并获得较高得率至关重要。

首先，本方案中最关键的技术要点是使用适当的细胞解离溶液。尽管常规的0.25%胰蛋白酶-EDTA常用于间充质干细胞（MSCs）传代时的细胞解离，但在分选BAMBIhighMFGE8high亚群时，最好使用无酶的EDTA溶液，因为胰蛋白酶处理会降低BAMBIhighMFGE8high MSCs分选时的得率（图3）。可能的原因是胰蛋白酶会像影响其他蛋白一样，破坏细胞表面MFGE8和BAMBI跨膜蛋白的分布12。相比之下，EDTA溶液对MF...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（项目编号：82271843）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.6 mL 微量离心管Corning Axygen MCT-060-A
1.5 mL 微量离心管北京莱伯格科技MCT-001-150
100 mm 细胞培养皿 北京莱伯格科技12311
12 孔板北京莱伯格科技11210
15 mL 离心管南京诺唯赞材料科技TCF00115
24 孔板北京莱伯格科技11310
50 mL 离心管南京诺唯赞材料科技TCF00150
5 mL 圆底管CorningFALCON 352003
70 μm 细胞筛Falcon352350稀释比例：1:1000
APC 抗人 CD79a (Igα) 抗体BioLegend333505581
稀释比例：1:200
APC/Cyanine7 抗人 CD73 (外切-5'-核苷酸酶) 抗体BioLegend344022G46-6
稀释比例：1:200
APC-Cy7 小鼠 IgG1, κ 同型对照抗体BD Bioscience557873MOPC-31C (同型对照)
稀释比例：1:200
BAMBI 抗体Biossbs-12418R
Brilliant Violet 510 抗小鼠/人 CD44 抗体BioLegend1030445E10
稀释比例：1:200
Brilliant Violet 510 大鼠 IgG2b, κ 同型对照抗体BioLegend400646MOPC-21 (同型对照)
稀释比例：1:200
CD105 (内皮糖蛋白) 单克隆抗体  APCeBioscience17-1057-42HM47
稀释比例：1:200
细胞计数板上海求精XB-K-25
离心机北京百洋BY-320C
ChamQ Universal SYBR qPCR 主混合液VazymeQ711-02
氯仿西陇科学13700908
DMEM/F-12 (1:1) 基础培养基 (1x)GibcoC11330500BT
EDTA (0.5 M)，pH 8.0，无 RNaseInvitrogenAM9260G稀释比例：1:1000
乙醇  西陇科学12803405
胎牛血清 (FBS)Gibco10099-141C 
FITC 小鼠抗人 CD34BD Bioscience555821IM7
稀释比例：1:200
FITC 小鼠抗人 CD45BD Bioscience555482AD2
稀释比例：1:200
FITC 小鼠抗人 HLA-DRBD Bioscience555811SN6
稀释比例：1:200
流式细胞仪BD BioscienceFACSAria™ III 细胞分选仪 Aria
FlowjoBD BioscienceV10
温和细胞解离试剂STEMCELL Technologies100-0485
山羊抗小鼠 IgG H&L (Alexa Fluor 488)abcamab150113HI30
稀释比例：1:200
山羊抗兔 IgG H&L (AlexaFluor 594)abcamab150080稀释比例：1:1000
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA 擦除剂)VazymeR223-01
倒置显微镜NikonECLIPSE Ts2
异丙醇西陇科学12802505
MFGE8 抗体Biorbytorb388429稀释比例：1:100
微量离心机Thermo Fisher ScientificFRESCO 21
小鼠 IgG1 kappa 同型对照 APCeBioscience17-4714-42P3.6.2.8.1 (同型对照)
稀释比例：1:200
小鼠 IgG1 kappa 同型对照 FITCeBioscience11-4714-42eBMG2b (同型对照)
稀释比例：1:200
小鼠 IgG2b kappa 同型对照 FITCeBioscience11-4732-42RTK4530 (同型对照)
稀释比例：1:200
PBS (10x)生工生物 (上海)E607016-0500
PE-Cy5 小鼠抗人 CD90 BD Bioscience555597P3.6.2.8.1 (同型对照)
稀释比例：1:200
PE-Cy5 小鼠 IgG1 κ 同型对照BD Bioscience550618
青霉素-链霉素 100xCytivaSV30010稀释比例：1:100
实时荧光定量 PCR 系统Thermo Fisher Scientific 公司 Applied Biosystems 品牌Q6
无 RNase 水QIAGEN129112
分光光度计Thermo Fisher ScientificNanoDrop One(840-317400)
无菌移液器吸头北京莱伯格科技稀释比例：1:100
T75 细胞培养瓶北京莱伯格科技13212A
PCR 仪Thermo Fisher Scientific 公司 Applied Biosystems 品牌Veriti
Trizol 试剂Sigma AldrichT9424
胰蛋白酶-EDTA 溶液百川生物BC-CE-005
水套式 CO2  培养箱Thermo Fisher Scientific3111

参考文献

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