高度再生性栉水母复杂感觉器官的手术切除

摘要

我们介绍一种简单的方法，用于去除栉水母 Mnemiopsis leidyi 的平衡囊及相关组织，该方法适用于活体成像。

摘要

栉水母 Mnemiopsis leidyi 是一种经典的全身再生动物模型。由于其在多种实验技术中具有较高的可操作性，并且在系统发育上可能是其余后生动物的姐妹群，近年来科学界对栉水母的研究兴趣显著回升。它们能够再生任何缺失的器官或细胞类型，包括仅从约占身体体积 ~15% 的微小片段实现完整的全身再生，整个过程在数天内完成。与大多数栉水母一样，M. leidyi 在反口极位置具有一个感知重力的感觉器官，该器官将感觉输入与运动输出相连接，从而调控其身体的位置与方向。本实验方案展示了对 M. leidyi 反口极器官（AO）复合体及相关结构的手术切除方法，并介绍了适用于观察随后数小时至数天内伤口愈合与再生过程的培养、操作和成像固定技术。这些简便的技术可广泛适用于不同的实验范式和实验室条件。

引言

栉水母（也称为栉板水母）广泛分布于地球的海洋环境中，是生态系统中的重要成员，尤其在食物网中扮演关键角色。Mnemiopsis leidyi 是一种历史悠久且日益流行的全身再生研究动物模型^1,2。它们再生任何缺失器官或细胞类型的能力在胚胎发育末期开始出现，并持续存在于整个胚后生命周期^3,4（体长约为 0.1 至 >1,000 mm）。它们在整个生命过程中身体透明，适用于多种活体和固定样本成像技术。所有现存栉水母的 最近共同祖先 已具有多种细胞类型和复杂的器官结构；大多数现存的栉水母在其至少一个生活阶段中具备这些特征：一个位于反口极、感知重力的器官（历史上称为顶器，本文中称为反口器官，AO），由高度有序的粗纤毛组成的、以协调方式摆动的特化运动结构（栉板），可伸缩的摄食触手，以及在受到有害刺激时能够发出生物荧光的光细胞（图1）。

尽管栉水母具有多种细胞类型以及复杂且依赖于环境的行为，但大量的基因组数据支持栉水母可能是所有其他现存动物的姐妹群^5,6,7,8。与其他具有神经系统的动物（两侧对称动物和刺胞动物）相比，栉水母神经系统在细胞和功能基础上存在显著差异，这提示了栉水母神经系统可能独立起源的假说；然而，这一观点仍未确定^9,10,11,12。

反口端感觉器官复合体包括平衡囊，其中包含多种细胞类型，如多种假定的神经感觉细胞^{13,14,15,16,17,18}，且在未受干预的栉板动物中持续维持。机械感觉细胞具有粗大的纤毛束，可由由生物矿化细胞（称为石细胞）构成的平衡石偏转，从而感知重力。两个"极区"位于平衡囊附近，其中含有功能未知的假定感觉结构¹⁴以及可能的光感受细胞¹⁶。

对M. leidyi再生能力的实验研究涵盖了从胚胎到幼体转变阶段的最小个体（约100 µm）直至自由生活的宏观成体（>2 cm）。体径约1 mm的M. leidyi个体足够大，可无需显微操作仪等特殊设备而进行手工手术操作；同时又足够小，可直接置于标准显微镜载玻片上，便于使用高倍物镜进行成像观察。本实验方案展示了如何手术切除反口极感觉器官及其相关结构，并介绍了适用于记录随后数小时至数天内伤口愈合与再生过程的培养与成像方法。

方案

1. 准备工具和耗材

1. 使用标准本生灯，手工拉制玻璃毛细管微量移液器以制备玻璃解剖针。对于体长超过1毫米的动物，应使用专为液体操作设计的校准钠钙玻璃微量移液器。
   注意：100 μl 规格在 0.5–3 mm 的焦距范围内表现良好。
   1. 在本生灯中建立一个锐利的蓝色锥形火焰。
   2. 将玻璃移液管的中心点置于火焰中，直至其软化到可在轻柔压力下移动为止。
   3. 将移液管从火焰中取出，立即沿直线向两侧拉直，以制成一根短而坚固的针状物。
      注意：若首次尝试未获得满意结果，可将玻璃针材重新熔化，并可保存断裂的针头再次拉制。参见 图2 有关使用此方法制备的可用与不可用针头的示例。
      ​替代方案：26 G ½ 英寸针头同样适用，尤其是在焦域尺寸范围较大的情况下。
2. 通过0.22 µm滤膜过滤天然或人工海水，制备无菌海水。
3. 制作测量移液管。
   1. 使用锋利的剪刀或剃须刀片裁剪塑料移液管，以获得所需内径大小的开口。至少准备一根适用于目标尺寸范围上限的移液管和一根适用于下限的移液管。参见 图3 以一组量筒为例。
      注意：这些移液器适用于长度约8 mm以内的测量。也可通过显微测微尺或基于照片的测量工具来估算尺寸。

2. 准备实验动物

1. 选择形态正常且大小和发育阶段符合要求的个体。
   注意：我们发现直径约为 0.5–3 mm 的动物最适合在载玻片上固定。检查动物是否无法进入尺寸范围下限的移液管底部，但可轻松进入尺寸范围上限的移液管。
2. 将实验动物饥饿处理 8–16 小时。
   注意：尽管 M. leidyi 在光学上透明且自发荧光较弱，但其消化系统中循环的食物通常不透明且常具有自发荧光。

3. 进行切割

1. 使用比实验动物体形更粗的移液管，将其转移至含有无菌海水的35 mm聚苯乙烯培养皿中。
2. 在解剖显微镜下观察样品。用非惯用手将一只动物翻转至其食道侧面（图1）。此视角最便于去除反口极器官。将焦点对准反口极器官。
   注意：最适用的放大倍数可能因动物大小和使用者偏好而异。通常12–20倍放大效果良好。
3. 用非惯用手持一根玻璃针轻轻固定动物位置。
4. 用惯用手将针尖插入反口极器官稍下方，以倾斜角度从反口极器官的一个可见边缘切入，直至其基部下方。抽出针后，进行第二次切割，切除包含反口极器官所有结构的楔形组织（见图4，上图）。仔细检查动物和切除的组织，以确认手术成功。
5. 使用同一根移液管将刚切割的动物转移至另一个含有无菌海水的新培养皿中。
   注意：伤口会迅速闭合，因此根据实验目的（例如获取多个同步再生样本，或成像观察愈合与再生的早期阶段），必须迅速操作以制备多个样本。建议使用计时器控制手术时间，使再生动物群体的处理时间尽可能接近。

4. 检查切割是否正确

注意：即使在解剖显微镜下仔细检查，偶尔仍有可能遗漏手术错误。

1. 按照以下步骤将每只术后个体临时固定在载玻片上，使用微分干涉差显微镜（DIC）检查预定切除的所有结构是否均已正确移除。即使当前不进行进一步成像，也应执行此检查。
   注意：栉水母具有极强的愈合能力，适合用于移植实验；我们始终将切除的反口端器官从培养容器中移除，以避免被切下的反口端器官与原个体的切口边缘粘连并融合。
   若不立即进行长期成像，不要密封载玻片。这有助于实验动物快速恢复并返回培养环境。建议在高倍镜下检查手术准确性。特别需要注意的是，平衡石可能在未完成手术的情况下从顶膜脱落。

5. 活体成像

1. 固定
   1. 用硅烷化试剂（如玻璃处理用的疏水剂）处理标准玻璃显微镜载玻片，并使其完全干燥。
   2. 用移液管将一只术后动物转移至已准备好的载玻片上。确认液滴在载玻片上形成水珠，且动物位于其中。
   3. 在盖玻片的每个角落放置少量建模粘土（约1.5 mg），形成"脚"，作为间隔物，使盖玻片与动物之间保持一定距离。
   4. 将盖玻片（粘土面朝下）轻轻放置在动物上方。用手捏住盖玻片的每个角，轻轻滚动，使动物处于成像所需的位置。轻压盖玻片，使动物略微受压并固定。根据需要多次调整样品位置，直至获得满意的视野。
   5. 若成像时间超过约30分钟，需在盖玻片的每一边缘涂抹一层薄薄的凡士林，以防止样品干燥。
      注意：M. leidyi 以这种方式固定的标本可轻松回收，用于后续培养或其他检测。然而，动物通常会在1-2小时内自行脱离并重新定位，因此若需进行超过2小时的连续延时成像，则需采用不同的成像方法。

6. 培养

1. 球形幼体培养条件
   1. 在接近室温的过滤天然海水或人工海水中培养经手术操作的动物及对照组。使用设定为 20–22 °C 的培养箱以确保结果一致。

结果

明樱蛤（M. leidyi）的钵形幼体阶段通常在受伤后约20分钟内完成伤口闭合（图4 和 图5），而器官的完全再生则需要1至3天。该过程存在一定的生物学变异性，但几乎总是在手术后72小时内完成（图6）。

从反口器官复合体及邻近组织中手术切除细胞和中胶层，随后伤口迅速闭合，导致整体体型直径减小，术前和术后图像（图3）展示了这一变化。

在我们的实验室中，本科生使用体长范围为 0.5–3 mm 的钵水母幼体阶段 M. leidyi，按照本方案成功开展了再生实验，结果显示在切除后 48 小时内有 53% 的个体完全再生出反口极器官，切除后 72 小时内完全再生率达到 100%（N = 30）。

手术后，可根据...

讨论

可根据需要对任意大小的M. leidyi进行类似的实验；该器官的形态发生与再生能力的出现是同步完成的⁴。动物可从野外采集¹⁹，也可在实验室中培养^20,21。若需要特定体型的个体，可让动物产卵，并将后代培养至所需大小。体型大小可使用本方案第1.3步中制作的测量移液管进行估算，将其切割至所需的内径（图3）。使用一支较小和一支较大的移液管，可收集到一定尺寸范围内的动物群体。体型较大的动物更易于操作，但固定和成像会更加困难，体长超过约5 mm的动物可能需要对本方案进行大量调整。我们发现约1周龄（或体径0.5–3 mm，如上述方案所示）的个体处于较为理想的尺寸范围。然而，只需对本方案进行少量调整，即可适用于任意体型。例如，可使用标准解剖工具或皮下注射针头（用于制备图7所示样本）从大型叶状类个体中移除听...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 μm SFCA 注射器滤器	Thermo/Nalgene	723-2520	制备无菌海水
35 mm 聚苯乙烯培养皿	Falcon/Corning	351008	进行切割操作；培养小型动物
60 mL 一次性鲁尔锁注射器	BH Supplies	BH60LL	制备无菌海水
校准玻璃移液管，100 μL	Drummond	2-000-100	进行切割操作
盖玻片，#1.5，18 mm 正方形	VWR	16004-326	成像固定用
栉水母	Gulf Specimens		活体动物
双凹槽玻璃载片，1.3 mm	VWR	470200-930	成像固定用
玻璃显微镜载片	VWR	16004-398	成像固定用
Instant Ocean 海盐	Instant Ocean		动物培养基
微型尺	Ted Pella	13623	测量塑料移液管
油性黏土（塑泥）	Pepy Plastilina		成像固定用
凡士林	Vaseline		成像固定用
塑料移液管（多种规格）	Cole-Parmer	06226-13, 06226-12, 06226-01	转移小型动物
Rain-X 玻璃处理剂	Rain-X		硅烷化显微镜载片
直尺	Westcott	10564	测量塑料移液管
剪刀	OXO		切割塑料移液管