用于研究小鼠身份识别的行为学任务

摘要

通过将具有负性或正性情绪价值的体验与特定社会性目标配对，我们设计了用于检测C57BL/6小鼠个体识别能力的行为学任务。这些任务可用于研究健康状态及社会认知受损的疾病相关小鼠模型中，对特定社会性目标的社会记忆机制。

摘要

社会性动物（如啮齿类动物）能够识别并区分熟悉个体的身份。识别熟悉个体的身份对于建立社会结构（如等级制度、亲缘关系和家庭关系）具有重要意义。然而，社会身份识别背后的机制仍不明确。目前大多数关于啮齿类动物社会识别的研究基于动物与新异社会目标互动的倾向，这一现象被称为社会新异性。然而，用于检测社会新异性的行为任务无法揭示基于身份对熟悉同种个体的识别能力。本文介绍了一种行为学任务，可通过将两个熟悉的个体与有情感价值或无情感价值的经历相关联，来检测C57BL/6小鼠的身份识别能力。实验动物分别与两只小鼠进行互动，其中一种情况为无情感价值（中性）经历，另一种情况为具有情感价值（负性或正性）经历，并由此熟悉这两只小鼠。负性情感小鼠与电击刺激相关联，而正性情感小鼠则与食物奖励相关联。训练结束后，可通过社会辨别测试揭示对这些熟悉小鼠身份的识别，表现为与中性小鼠相比，更偏好正性情感小鼠并回避负性情感小鼠。身份识别行为任务可用于探究社会记忆机制，以及自闭症谱系障碍或精神分裂症等伴有社会认知功能受损的疾病的病理生理过程。

引言

个体识别，即基于先前经验识别熟悉个体的能力，对社会性动物的生存至关重要¹。在啮齿类动物中，社会等级的形成、配偶与后代的识别、领地防御以及群体的建立与维持等行为，均依赖于成功的个体识别能力^2,3。目前对社会记忆的理解主要基于啮齿类动物研究，其核心是区分新异个体与熟悉同种个体的能力。这些实验范式有助于揭示被认为介导社会记忆的脑区，例如海马CA2区⁴和腹侧CA1区⁵。然而，此类研究在阐明个体识别的潜在机制方面仍存在局限，因其仅局限于对社会新异性进行类别化识别。

通过关联学习范式，已独立于社会新颖性之外实现了身份识别，其中具有情感效价的显著经历会与两个（或更多）熟悉的社会目标之一相关联。这些任务基于以下观点：社会互动通常与情感意义相关联，负面经历会导致回避冲突的行为，而 playful 或养育性的互动通常具有奖赏性。与社会互动相关联的情感效应被称为社会效价。雄性金黄地鼠能够区分两个熟悉同种目标，当其中一个先前攻击过它们时⁶。个体雄性Wistar大鼠的识别记忆对于社会等级的建立也具有重要意义⁷。

最近，研究人员通过将个体C57BL/6小鼠与或不与奖赏性刺激进行关联，考察了这种在神经科学研究中最常用的小鼠品系的身份识别能力⁸。该方法采用头部固定的动物进行数百次训练试验，限制了其在自由活动小鼠中研究自然行为的应用。在其他研究中，C57BL/6小鼠的身份识别表现为对摄入乙醇的同种个体的偏好^9,10。然而，外源物质的施用可能引入混杂因素。此外，这些研究中极少有同时涵盖两性啮齿类动物身份识别的。因此，一种易于采用且适用于雄性和雌性C57BL/6小鼠的方法，对于进一步推动身份识别研究至关重要。

本文介绍了一种可用于雄性和雌性小鼠的个体识别研究范式。为了在排除新奇性影响的情况下研究个体识别，实验中使用两个熟悉的社会目标个体，并将其中一个目标个体与显著的情感体验相关联，以推测其对互动行为的影响。对于负性社会效价的建立，采用类似于社会恐惧条件反射的方法，使小鼠对特定社会目标产生回避行为¹¹。若某个个体与负性社会效价（如令人厌恶的足底电击）相关联，则预期小鼠与其社会目标的互动会减少。相反，若某个特定个体与正性社会效价（如奖赏性刺激）相关联，则在后续测试中预期小鼠与其互动会增加。综上所述，上述行为学任务可简便地应用于大多数实验室，用于研究C57BL/6小鼠及其他小鼠品系的个体识别能力。

方案

本研究使用雄性成年C57BL/6小鼠（8–10周龄；体重：18–25 g）。作为社交目标的小鼠来自不同来源（见材料表），以确保其与实验小鼠来自不同的窝且此前互不熟悉。所有实验方案均经道格拉斯研究中心动物护理委员会批准，并遵循加拿大动物护理委员会的指导方针（方案编号：DOUG-5935）。

1. 材料（见图1）

1. 设置一个大型透明笼子（24 cm × 36 cm × 19.5 cm），作为负性社会效价实验中的中性环境
2. 使用一个黑色侧壁的三角形电击箱（每边长度 = 46 cm；高度 = 29 cm）作为负性效价环境。确保电击箱的底部由金属栅格组成，并连接至随机化栅格电流发生器。
3. 使用一个大型透明笼子（26 cm × 47 cm × 21 cm）作为正性社会效价实验中的食物习惯化环境。
4. 使用一个大型黑色侧壁笼子（24 cm × 36 cm × 19.5 cm）作为正性社会效价实验中的中性环境。
5. 使用一个大型白色侧壁笼子（24 cm × 36 cm × 19.5 cm），并配备一个食物入口，作为正性社会效价环境。食物入口使用一根塑料管（直径 0.5 cm），穿过笼壁一侧，并在管子下方放置一个白色塑料碟。
6. 将白色画板纸预先裁剪成合适尺寸，用作中性环境（负性和正性社会效价实验中的中性训练）及正性社会效价环境的底部铺垫。裁剪时略小于环境底部面积，以防止实验小鼠在纸下挖掘。在不同实验小鼠之间更换画板纸。
7. 使用无尘精密颗粒饲料（20 mg，巧克力味）作为与正性效价社会目标互动后的奖励信号。
8. 使用天平在正性社会效价实验期间每日称量实验小鼠的体重。
9. 使用一个三室箱（81 cm × 23 cm × 23 cm），中间室设有通向左右两侧室的开口，用于社会辨别测试。使用可移动的隔门 在测试间歇期间将实验小鼠限制在中间室，以避免抓取带来的应激。
10. 使用两个相同的矩形聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）围栏（10 cm × 5 cm × 30 cm）进行负性和正性社会效价训练。
11. 使用四个圆形金属丝杯（8 cm × 8 cm × 10 cm） 进行社会辨别测试。在社会辨别测试的第一阶段，保持其中两个金属丝杯为空。在第二阶段，将用于正性或负性社会效价训练的社会目标动物放入另外两个金属丝杯中。
    注：应对金属丝杯进行标记（例如使用胶带），以区分外观相同的杯子。在同一次实验中，应始终将各金属丝杯用于相同用途。若需在金属丝杯中更换不同的社会目标动物，应使用肥皂、水和基于过氧化氢的快速消毒剂彻底清洁金属丝杯。
12. 在社会辨别测试期间，将两个玻璃瓶放置在倒置的金属丝杯上方，以防止实验小鼠攀爬到金属丝杯顶部。
13. 确保负性社会效价实验中训练所用围栏的底部采用非导电材料。例如，可使用塑料或纸板并覆盖电工胶带，以确保在训练过程中负性效价社会目标动物不会受到电击。
14. 使用静音计时器，以避免可能干扰动物行为的外部声音提示。
15. 使用连接至笔记本电脑的高分辨率（1,080 p/30 fps）网络摄像头，记录训练和社会辨别测试期间小鼠的行为。
16. 使用白噪声发生器，在环境中心位置产生强度为 60 dB 的静态白噪声。
    注：所有行为实验均应在环境中心处维持 60 dB 的静态白噪声条件下进行，以屏蔽可能影响动物行为的环境声音。
17. 所有行为实验均使用红光灯照明。
    注：红光提供较暗的环境条件，有助于促进小鼠的探索行为，并便于在视频记录中观察动物行为。
18. 在不同实验小鼠之间，使用 70% 乙醇清洁所有围栏（包括空置和有动物的围栏），因其干燥迅速。训练和测试环境则需使用基于过氧化氢的快速消毒剂进行清洁，以消除前一只实验小鼠留下的嗅觉线索对后续动物行为的潜在影响。

2. 行为学实验步骤

1. 负性社会效价
   1. 情境适应
      1. 实验期间，在实验室内配备白噪声和环境红光。
      2. 通过在电击箱中央放置一个底部为非导电材料的空有机玻璃 enclosure，准备电击箱。
      3. 将实验小鼠置于电击箱的一个角落，允许其自由探索 5 分钟。
      4. 将实验小鼠放回其居住笼中。
      5. 对剩余小鼠重复进行电击箱适应程序。
      6. 至少 1 小时后，在中性情境下重复情境适应程序（步骤 2.1.1.1–2.1.1.5）。
   2. 负性效价训练
      1. 在完成两种情境的适应后至少 1 小时，开始负性效价训练。
      2. 将电击箱的电流设置为 0.3 mA。
         注：推荐的电流设置基于我们所使用的电击箱及实验设计（3 天训练）。该设置可根据其他实验设计进行调整（例如，在训练次数较少的设计中可使用更强的电流）。
      3. 将具有负性效价的社会目标小鼠放入电击箱中央、底部为非导电材料的有机玻璃 enclosure 中。
      4. 开始视频录制，并将实验小鼠置于电击箱的一个角落。
      5. 启动计时器，允许实验小鼠自由探索。
      6. 在第 4 分钟和第 4.5 分钟时，给予一次持续 1 秒的电击。
         注：这可在实验小鼠经历厌恶性电击前，确保其与社会目标之间有足够互动时间。
      7. 在第 5 分钟时移除实验小鼠，并停止录制和计时。
      8. 将实验小鼠放回其居住笼中。
      9. 对电击箱进行消毒，并对剩余实验小鼠重复负性效价训练。
   3. 中性训练
      1. 在负性效价训练结束后至少 2 小时，开始中性训练。
      2. 将中性社会目标小鼠放入位于情境中央、底部为非导电材料的 enclosure 中。
         注：使用非导电底部是为了确保负性与中性情境具有相同的情境线索。中性训练中不给予电击。
      3. 开始视频录制，并将实验小鼠置于中性情境的一个角落。
      4. 启动计时器，允许实验小鼠自由探索。
      5. 在第 5 分钟时移除实验小鼠，并停止录制和计时。
      6. 将实验小鼠放回其居住笼中。
   4. 训练顺序
      1. 第 1 天：完成两种情境的适应（步骤 2.1.1）后，在负性效价训练（步骤 2.1.2）2 小时后进行中性训练（步骤 2.1.3）。
      2. 第 2 天：第 2 天重复训练，但顺序相反（步骤 2.1.3 然后 2.1.2；即先进行中性训练，2 小时后再进行负性效价训练）。
      3. 第 3 天：第 3 天重复训练，顺序再次相反（步骤 2.1.2 然后 2.1.3；即先进行负性效价训练，2 小时后再进行中性训练）。
2. 正性社会效价
   1. 食物剥夺
      1. 实验期间每日称量每只实验小鼠的体重。
         注：若实验过程中任何一只小鼠体重减轻超过原始体重的 15%，必须立即停止食物剥夺，并将其从后续实验中剔除。
      2. 在居住笼中为每只实验小鼠提供 1 克常规鼠粮。
         注：实验小鼠为群养，每只小鼠可获得 1 克食物。例如，若四只小鼠共同饲养，则在居住笼中放置 4 克食物。
      3. 在整个正性社会效价实验期间每日重复食物剥夺（即在每次食物颗粒适应、情境适应和正性效价训练后的每一天）。
   2. 蔗糖食物颗粒适应
      1. 在开始食物剥夺 12 小时后，开始食物颗粒适应。
      2. 实验期间，在实验室内配备白噪声和环境红光。
      3. 将实验小鼠置于食物适应情境的一个角落。
      4. 启动计时器，并在 10 分钟内每分钟递送 1 颗蔗糖食物颗粒。
      5. 在第 10 分钟时移除实验小鼠，并将其放回居住笼中。
      6. 记录实验小鼠消耗的蔗糖食物颗粒数量。
      7. 共进行 3 天的蔗糖食物颗粒适应。
         注：若小鼠在 3 天后仍未摄取任何蔗糖食物颗粒，可增加适应天数。
      8. 在食物颗粒适应期间未摄取任何蔗糖食物颗粒的实验小鼠应从研究中剔除。
   3. 情境适应
      1. 在蔗糖食物颗粒适应结束后一天（第 4 天），通过在情境一角放置一个空的有机玻璃 enclosure，准备正性效价情境。
      2. 将实验小鼠置于正性效价情境的一个角落，允许其自由探索 10 分钟。
      3. 将实验小鼠放回其居住笼中。
      4. 对剩余小鼠重复正性效价情境适应程序。
      5. 至少 1 小时后，在中性情境中重复情境适应程序。
   4. 正性效价训练
      1. 在完成两种情境的适应后至少 1 小时，开始正性效价训练。
      2. 将具有正性效价的社会目标小鼠放入正性效价情境中央的 enclosure 中。 
      3. 开始视频录制，并将实验小鼠置于正性效价情境的一个角落。
      4. 启动计时器，允许实验小鼠自由探索 10 分钟。
      5. 每当实验小鼠与社会目标的互动持续时间 >2 秒时，通过食物递送口递送 1 颗蔗糖食物颗粒。互动定义为实验小鼠鼻部距离有机玻璃 enclosure 边缘 <2 cm 的时间段，且小鼠头部朝向 enclosure。 
         注：鼻探和嗅闻可能发生，但并非递送蔗糖食物颗粒的必要条件。
      6. 在第 10 分钟时移除实验小鼠，并停止录制和计时。 
      7. 将实验小鼠放回其居住笼中。
      8. 记录通过食物递送口递送的蔗糖食物颗粒数量及实验小鼠实际消耗的数量。
      9. 更换画板纸地面，对正性效价情境进行消毒，并对剩余实验小鼠重复正性效价训练。
   5. 中性训练
      1. 在正性效价训练结束后至少 2 小时，开始中性训练。
      2. 将中性社会目标小鼠放入中性情境一角的 enclosure 中。 
      3. 开始视频录制，并将实验小鼠置于中性情境的一个角落。
      4. 启动计时器，允许实验小鼠自由探索 10 分钟。
      5. 在第 10 分钟时移除实验小鼠，并停止录制和计时。 
      6. 将实验小鼠放回其居住笼中。
      7. 更换画板纸地面，对设备进行消毒，并对剩余实验小鼠重复中性训练。
   6. 训练顺序
      1. 第 1–3 天：进行食物颗粒适应（步骤 2.2.2）。
      2. 第 4 天：完成两种情境的适应（步骤 2.2.3）后，先进行正性效价训练（步骤 2.2.4），2 小时后再进行中性训练（步骤 2.2.5）。
      3. 第 5 天：第 5 天重复训练，但顺序相反（步骤 2.2.5 然后 2.2.4；即先进行中性训练，2 小时后再进行正性效价训练）。
3. 社会辨别测试
   1. 在实验室内配备白噪声和环境红光。
   2. 将实验小鼠转运至实验室内，允许其在不受干扰的情况下适应环境至少 1 小时。
      注：确保社会目标小鼠在适应期间始终位于实验室外。
   3. 在第 1 阶段，将两个空的金属丝杯分别放置在三室社会辨别箱左右两侧 chamber 的对角角落。 
      注：在金属丝杯上方放置相同的大型重物（如玻璃瓶），以防止实验小鼠攀爬至杯顶。
   4. 开始视频录制，将实验小鼠置于中间 chamber 的中央位置，并启动计时器。 
      注：若可能，离开房间以尽量减少实验人员对实验小鼠的干扰。
   5. 8 分钟后，返回测试室，在不触碰实验小鼠的情况下，使用 chamber 门将其限制在中间 chamber 内。 
   6. 将空的金属丝杯替换为另一组相同但不同的杯子，其中放入社会目标小鼠。
      注：社会目标小鼠为之前用于负性或正性社会效价训练的小鼠。 
   7. 打开 chamber 门，当实验小鼠进入第 2 阶段探索时启动计时器。 
   8. 8 分钟后，停止录制，并将实验小鼠和社会目标小鼠分别放回其居住笼中。 
   9. 用 70% 乙醇清洗杯子，并用消毒剂清洁测试区域。
   10. 对剩余实验小鼠重复社会辨别测试（步骤 2.3.3–2.3.9）。
   11. 当半数实验小鼠完成测试后，交换金属丝杯的位置以进行平衡。
       注：社会目标小鼠应随其对应的金属丝杯一同移动，以避免产生冲突的嗅觉线索。 
   12. 用肥皂、水和消毒剂彻底清洗所有金属丝杯。用消毒剂清洁三室社会辨别箱。

3. 行为学分析

1. 训练
   1. 分析实验动物与每个社交目标的互动时间，并记录互动次数。
      注意：分析可手动进行（动物头部距离围栏边缘小于<2 cm，且头部角度为180°），也可使用自动化程序完成。
   2. 记录在正向社交价值训练期间消耗的食物颗粒数量，以确保社交行为的变化并非由摄取食物奖励的动机差异所致。
2. 社交辨别测试
   1. 测量实验小鼠对每个杯子的探究时间。当实验人员离开房间后，测试开始，持续8分钟且不得中断。
      注意：分析可手动进行（动物头部距离金属丝杯边缘小于<2 cm，且头部角度为180°），也可使用自动化程序完成。
   2. 进行成对分析，以更准确地捕捉测试会话中的个体变化。此外，进行双因素重复测量方差分析（因素为会话和杯子），以检测探索行为在不同会话间的差异。

结果

我们采用正性和负性社会效价任务来评估C57BL/6小鼠的身份识别能力（图2）。与蔗糖食物颗粒适应期第1天（H1，图2B）相比，大多数小鼠在食物适应期最后一天（H3）已消耗完所有提供的食物颗粒。在训练阶段（T1和T2），实验小鼠在不同情境下分别与两只CD1小鼠接触，从而熟悉它们：一只为中性小鼠（Neu），另一只为与正性效价相关联的小鼠（PV）。仅在实验小鼠与PV小鼠互动后，才会获得食物奖励。在社会辨别任务中，我们发现，与中性小鼠相比，经过训练的小鼠更倾向于与PV小鼠互动（* p < 0.05，配对样本Student’s t-检验）。第二次互动时间与第一次互动时间的会话间比率也显示出对PV小鼠的偏好（* p < 0.05，配对样本Student’s t-检验）。

我们还使用负性社会效价任务来检测个体识别能力（图2C）。实验小鼠分别在不同环境中与两只CD1小鼠——中性小鼠（Neu）和与负性效价相关的小鼠（NV）——进行互动，从而熟悉这两只小鼠。在与NV小鼠互动阶段接近结束时，给予两次电击刺激，而在与Neu小鼠互动后则不给予电击。在每次训练日中，实验小鼠与Neu小鼠或NV小鼠的互动时间之间未发现显著差异。然而，在社会辨别测试中，实验小鼠与NV小鼠的互动时间明显减少（* p < 0.05，配对样本Student’s t-检验）。此外，第二次互动时间相对于第一次互动时间的会话间比率也显示出实验小鼠更倾向于与Neu小鼠互动（* p < 0.05，配对样本Student’s t-检验）。

图 1：用于个体识别任务的装置。（A）用于负性社会情感测试的中性情感环境。环境中底部放置一张白色画板纸。（B）正性社会情感环境。注意盒子底部中央的食物递送口（箭头）。（C）用于正性社会情感测试的中性情感环境。（D）食物习惯化环境。食物递送口安装在盒子右侧，如图 E（虚线圆圈）和 F（放大图）所示。（G）电击箱。（H）聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglass）围栏。（I）金属丝杯。（J）用于社会辨别测试的三室社会辨别箱。用于将实验小鼠限制在中央腔室的可移动隔间门如图 K 所示（箭头）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：个体识别任务的设计与预期结果。 （A）个体识别任务的正性（上图）和负性社会效价版本（下图）的示意图。C57BL/6小鼠被训练每日与中性（小鼠Neu）以及与效价相关联的社会目标（小鼠PV或NV）进行互动。训练后一天，将受试小鼠放入三室装置中进行社会辨别测试。我们预期，在经历正性和负性社会效价训练后，受试小鼠将分别对具有正性效价（绿色，小鼠PV）和负性效价（红色，小鼠NV）的小鼠表现出偏好和回避行为。（B）正性社会效价训练实验的代表性数据。受试小鼠每日与具有正性效价的小鼠（小鼠PV）和中性小鼠（小鼠Neu）互动，持续2天。第2天时互动顺序被调换。左图：柱状图显示在适应期（H1–3，代表适应第1–3天）和训练期（T1–2，代表训练第1–2天）期间消耗的蔗糖食物颗粒百分比，训练对象为小鼠PV。右图：柱状图显示在社会辨别测试中与具有正性效价的小鼠PV的社会互动时间增加。会话间比率（第2次会话互动时间/第1次会话互动时间）反映了对具有正性效价的小鼠PV的偏好。* p < 0.05，配对Student’s t-检验。（C）负性社会效价训练实验的代表性数据。受试小鼠每日与具有负性效价的小鼠（小鼠NV）和中性小鼠（小鼠Neu）互动，持续3天。每天的互动顺序均被调换。左图：柱状图显示在不同训练日与小鼠Neu和NV的互动时间。右图：柱状图显示在社会辨别测试中与具有负性效价的小鼠NV的社会互动时间减少。会话间比率表明对具有负性效价的小鼠NV的回避行为。* p < 0.05，配对Student’s t-检验。缩写：Neu = 中性；PV = 正性效价；NV = 负性效价；H = 适应；T = 训练。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

身份识别范式的设计旨在使实验室能够以最少的专用设备和一周内较少的训练次数轻松实施。可根据现有资源和所需的研究问题采用其他具有情感色彩的经历。例如，在攻击性社会目标的攻击后出现的负性情感身份识别，最初在金黄地鼠中被描述，随后在我们的模型中被改编用于小鼠^6,12。

带有情感效价的身份识别范式在社会记忆领域具有更广泛的应用前景。这些任务不仅可用于进一步研究社会记忆或社会情感效价机制，还可用于研究已知存在社会识别障碍的疾病模型。身份识别能力的损害是精神分裂症^13,14,15和自闭症谱系障碍^16,17,18等疾病中社会行为缺陷的基础，据估计，约三分之一的自闭症成人存在面孔个体身份识别困难¹⁹。例如，Shank3基因敲除小鼠和Df(16)A^+/−小鼠是已知表现出社会认知障碍的自闭症谱系障碍和精神分裂症小鼠模型^20,21,22。我们的新范式可能重现社会记忆缺陷，可用于疾病模型的表征，以及识别能够改善社会行为缺陷的干预手段或治疗方法。此外，也可使用非生命物体替代社会性目标，以进一步区分支持物体识别与社会识别的神经机制¹²。

图1 中使用的社会性目标为同性别CD1品系小鼠，但我们使用同品系C57BL/6小鼠作为目标也获得了相当的情绪效价性身份识别效果。因此，我们建立了一种易于采用的方法，可用于进一步研究社会情绪加工、社会身份识别，以及脑部疾病动物模型中这些社会认知功能的缺陷。

身份识别范式关注对特定个体的记忆。在设计实验时，必须确保训练阶段和测试阶段完全不同，唯一保持不变的线索是社交目标个体的身份。例如，进行训练和测试的房间、容纳社交目标的围栏，以及与训练和测试情境相关的各种线索都必须不同。

四个金属丝杯必须彼此完全相同，但应尽可能与亚克力罩在材料（例如亚克力与金属）、形状（例如矩形与圆形）以及颜色（例如透明与玫瑰金）方面存在差异。这样做是为了确保在测试期间，影响探索行为的唯一线索是社交目标的身份。

情境适应在训练的第一天进行。这样做的目的是促使实验小鼠在训练期间更多地探索社交目标，而非所处环境，因为实验小鼠此前已熟悉该环境。此外，建议在具有情绪效价的训练和中性训练之间至少间隔2小时。训练之间留出时间间隔被认为有助于减少泛化，因为时间上越接近的经历越容易被关联起来²³。出于同样的原因，训练在后续几天中重复进行，但顺序采用交叉平衡设计。重复训练被认为有助于进一步将特定经历与相应的社交目标建立联系。理想情况下，延长训练之间的间隔时间可能更有利于实验小鼠学习将社交目标与其对应的情绪性经历关联起来。出于实际操作考虑，将等待时间设定为2小时，以便在同一天内完成8至12只小鼠的中性训练和情绪性训练。例如，训练12只小鼠大约需要2小时，此时最早接受训练的小鼠即可开始下一轮训练。当然，延长等待时间可能提升实验小鼠的表现，但会增加实验人员的时间投入。

实验小鼠和社交目标小鼠应至少在行为训练开始前7天到达动物房，以尽量减少运输应激的影响。社交目标小鼠应单笼饲养，因为笼伴的嗅觉线索可能干扰个体识别。同一对社交目标小鼠最多可用于12只实验小鼠组成的队列。重要的是，在每只实验小鼠测试之间的清洁和准备期间，必须将社交目标小鼠放回其原居笼中。将社交目标小鼠及时放回原居笼非常重要，因为在测试箱中长时间拘禁可能改变其行为，进而影响实验小鼠与其互动的决策。

实验小鼠和社交目标可以是相同或不同品系的同种个体。若使用相同品系的社交目标，则必须确保它们与实验小鼠不属于同一窝，且彼此之间互不相识。可通过从不同的动物供应商订购实验小鼠和社交目标，或订购年龄略有差异的动物（例如，8周龄的实验小鼠和7周龄的社交目标）来实现这一要求。如果需要进行耳标标记操作，应至少在行为训练开始前24小时完成，以尽量减少外部应激因素对实验小鼠行为的影响。在所有行为训练和测试过程中，建议每次仅处理一只实验小鼠。尽管同时训练和测试多只实验小鼠可能节省时间，但这会增加实验室内嗅觉线索的累积，可能影响身份识别信息的编码或回忆。因此，我们建议每批实验小鼠的数量为8至12只。在正向社会效价实验中，建议在训练前每天对动物进行抓取适应，以减少操作应激，避免抑制其对新食物的摄取。此外，建议在适应性训练开始前3天，每天在每只小鼠的饲养笼中放置2至3粒蔗糖食物颗粒，以促进适应过程的顺利进行。 

尽管本文呈现的数据是手动评分的，但已有用户友好且自动化的分析工具可用于更高效地对训练和测试视频中的社交互动进行评分。例如，DeepLabCut 是一种利用用户训练的神经网络对动物位置进行无标记标注的软件，可优化用于精确识别满足探究行为的视频帧²⁴。

可采用进一步的对照实验来验证是否已成功实现身份识别方案¹²。颠倒训练顺序应仍能引发身份识别，从而证实结果并非由正负性与中性训练的先后顺序所致。训练可按前述方法进行，但在测试阶段可使用中性社交目标与一个新的社交目标，若实验小鼠对新目标表现出更高的互动水平，则表明其对中性目标具有社交记忆，并已识别出该目标为熟悉个体。类似地，也可使用两个全新的社交目标进行测试，以确认回避或接近行为确实分别特异性地针对具有负性与正性情感价值的社交目标。尽管目前尚未验证同一只实验小鼠是否可先后接受负性和正性社交情感训练，但我们认为，若研究者能够使用多种社交目标品系或不同的训练环境，则该操作是可行的。若在正性和负性情感实验中使用同一品系的社交目标，可能会导致品系与特定情感价值之间的关联复杂化。如条件允许，使用不同的社交目标品系可能有助于促进探索行为，并避免正性与负性体验之间的泛化。同样，重复使用相同的训练环境会增加相反情感体验之间的泛化，因此建议采用不同的训练环境以尽量减少此类影响。若实验时间允许，建议将正性和负性情感实验间隔数周进行。

如果在建立身份识别实验方案时遇到困难，我们建议针对所遇到的常见问题采取相应的解决方案。群体饲养实验小鼠可能起到消退训练的作用，因为随着与笼伴的正常互动，与特定社交目标相关的情感反应会逐渐消失²⁵，但群体饲养仍是必要的，因为社交隔离会损害社交记忆并改变社交行为^26,27。事实上，我们发现单只饲养的雄性小鼠无法引发身份识别反应。然而，若动物正在从立体定位手术中恢复，或携带可能因接触而脱落的颅内植入物时，则可能需要单只饲养。在此类情况下，我们已成功将小鼠成对饲养于大型笼具中，并使用带孔隔板进行分隔，且在此条件下成功重复了身份识别实验结果¹²。

在正向社会效价任务中，小鼠通常对摄取新型蔗糖颗粒表现出犹豫。为解决这一问题，可延长禁食时间，或在习惯化训练前2-3天将少量颗粒放入小鼠的饲养笼中，使其熟悉颗粒。在某些情况下，若大多数小鼠均未摄取任何食物颗粒，增加习惯化训练的次数也可能有所帮助。尽管我们注意到雄性小鼠在食物颗粒习惯化期间的进食量通常少于雌性小鼠，但这并不影响其识别具有正向效价的社会目标的能力。

最后，可以调整身份识别任务的参数以降低或增加任务的难度。例如，为了揭示生物学因素对身份识别的细微影响，可以缩短训练时间并减少训练次数，从而增加任务难度。

本方案中介绍的行为学任务操作简便，易于建立，并可适用于雄性和雌性小鼠，用于研究个体识别。这些任务可灵活使用奖赏性或厌恶性刺激，从而有助于考察社会效价在个体识别中的作用。这些任务将有助于研究健康小鼠个体识别的生物学机制，或在表现出社交功能障碍的疾病相关小鼠模型中，研究这些机制的缺陷。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70% 乙醇
黑色壁笼（24 cm × 36 cm × 19.5 cm）		中性情境，正向社会价值实验
C57BL/6小鼠	查尔斯河实验室，杰克逊实验室		杰克逊实验室的社会性目标
无尘精密颗粒	BioServ	F05301	20 mg，巧克力味
电工胶带
玻璃瓶（2）
基于过氧化氢的消毒剂
塑料或纸板			用于 enclosure 底板的非导电材料
矩形有机玻璃 enclosure（2 个，10 cm × 5 cm × 30 cm）		相同
电击箱（三角形，每边长度 = 46 cm；高度 = 29 cm）
静音计时器
单输出随机动物电击器	Lafayette Instrument	HSCK100AP
三室箱（81 cm × 23 cm × 23 cm），中间室设有通向左侧室和右侧室的开口	社会歧视测试
透明笼子（24 cm × 36 cm × 19.5 cm）		负面社会效价
透明笼子（26 cm × 47 cm × 21 cm）			食物习惯化（正向社会效价）
网络摄像头	罗技	C920x
体重秤
白色画架垫纸			中性环境的底部
白噪声发生器			60 dB
白色塑料培养皿
白色墙壁的笼子（24 cm × 36 cm × 19.5 cm），带有一个直径为1 cm的塑料管作为食物入口	积极社会情感背景
金属丝网杯（圆形，四个，8 cm × 8 cm × 10 cm）