保留气道中真菌孢子空间动力学的小鼠肺成像的有效方法

摘要

我们提出了一种真菌发病机制模型的方法，该方法保留了真菌孢子在肺气道中的自然定位，以便通过荧光显微镜进行分析。

摘要

当环境孢子被吸入肺部时，真菌会感染人类。肺是一个异质性器官。传导气道（包括支气管和细支气管）分支，直到终止于发生气体交换的肺泡空腔。起源于细支气管或肺泡的感染会引起不同的宿主反应和疾病表现。因此，准确了解孢子在肺部自然定位的位置，尤其是在感染后不久，扩大了研究宿主-病原体相互作用的机会。在此，我们详细介绍了感染 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ 节孢子虫的小鼠肺的原位分析。传统的组织学保存方法包括用固定液对气道进行液体充气，固定液取代吸入的真菌颗粒的自然位置，将孢子从近端细支气管推到末端气腔。

相反，这种使用脉管系统灌注固定进行充气的方法保留了真菌孢子在细支气管内的生理位置。此外，我们描述了一种低温保存、包埋和成像肺标本的简单方法。我们还通过开源 QuPath 程序共享高通量计算技术，以分析真菌孢子在肺内的空间分布。这里介绍的方法简单快捷，需要最少的设备来执行，并且可以很容易地适应许多呼吸道真菌感染模型。

引言

人类每天可以从各种环境真菌中吸入多达数十亿个孢子¹。要了解我们对这些吸入孢子的屏障防御，我们必须了解这些孢子落在气道和肺实质内的精确微观解剖环境。气道的细胞组成（即上皮细胞）沿气管、支气管、细支气管和肺泡显着变化。这些不同区域中的每一个都由具有不同功能的细胞类型组成，这些细胞类型利用防御库来防止病理感染。

肺真菌孢子沉积的确切位置在柱状上皮衬里细支气管、肺泡管或肺泡² 的气道管腔之间可能有所不同。大多数临床相关的真菌种类产生直径在 1 μm 到 10 μm 之间的孢子³。这些孢子颗粒在肺中的沉积取决于几个因素，例如空气动力学、密度、电荷和泳力，这些因素会影响吸入后沉降的机制⁴。通常，大颗粒 （> 6 μm） 沉积在上气道，中等颗粒 （2-6 μm） 可以沉积在较小的气道中，小颗粒 （<2 μm） 到达肺泡区域⁵。据报道，曲霉孢子 （2-3 μm） 可到达肺泡间隙，但临床病理报告也表明支气管和细支气管疾病的负担很大⁶。由于可弯曲支气管镜检查的日益普及，烟曲霉、粗球孢子菌、念珠菌属、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌和接合菌的支气管内真菌感染也越来越受到认可⁷。小鼠曲霉菌感染的显微镜成像的最新进展还表明，支气管和细支气管等更近端的气隙可能对病理性真菌增殖承担最高的负担⁸。对宿主对肺部真菌感染反应的研究表明，细支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞都作为免疫哨兵发挥着重要作用，因此阐明孢子沉积和上皮相互作用的确切位置对于未来的工作至关重要 ^2,9,10。

研究这些近端气道发病机制动力学很困难，因为标准的肺固定和切片制备技术可以将孢子从上皮衬里气道的这些近端位置移位，并将它们推向远端末端肺泡区域。通常，使用 10% 福尔马林或 4% 多聚甲醛使肺部充气并迅速使整个肺暴露于固定剂中。在准备用于冷冻切片的肺部时，一些小组将最佳切割温度 （OCT） 化合物注入肺部以提高冷冻切片性能¹¹。这些做法在正确的环境中是有用的，但我们的实验室和其他小组发现它们会从近端位置移动孢子和颗粒，从而干扰对孢子暴露的细胞类型和随后的宿主反应的解释¹²。

为了准确确定吸入真菌孢子的微观解剖定位，我们开发了一种快速、低资源的方法，用于保存真菌孢子在小鼠气道中的位置。我们采用了 Thomas 等人（2021 年）的小鼠空气充气血管灌注固定方法，其中我们减少了获得满意结果所需的设备、时间和技术技能的数量¹³。从这里描述的方法中，我们观察到 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ 节孢子（大小）比以前显示的在近端积累得更多，即在远端细支气管和支气管-肺泡交界处，而不是末端肺泡。这些信息可以集中有关与肺这些区域相关的关键细胞类型及其对吸入真菌孢子的早期反应的影响的生物学问题。

方案

本协议中描述的所有方法均已获得罗格斯生物医学健康科学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。

1. 用细胞内荧光标记孢子

1. 在 30 °C 下，用 5 μM 的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 （CFSE）、Cell Tracker Orange 或 Cell Tracker Red（或选择的细胞内染料）染色 1 x 10⁶ 个孢子 30 分钟，然后用 PBS 洗涤，并以 12,000 x g 旋转孢子 。 重复此洗涤一次。
2. 准备适当浓度的孢子接种物，使 25 μL 含有适合一只小鼠的孢子剂量。

2. 使用异氟醚麻醉通过吸入吸入小鼠接种孢子

注意:异氟醚是一种挥发性麻醉剂，必须在管道式生物安全柜或通风橱内使用。

1. 要制备异氟醚暴露罐，请将折叠的餐巾纸放入 1 L 螺口 Nalgene 染色缸中，并在餐巾纸上放置一个塑料网圈作为小鼠的平台。餐巾纸中加入 2 mL 异氟醚，盖上罐子，等待 1-2 分钟，让气体在容器中达到平衡。

图 1:孢子接种异氟醚开滴法的装置。 将折叠的餐巾纸放入 1 L 螺旋盖罐的底部，然后插入圆形塑料网作为小鼠的平台。 请单击此处查看此图的较大版本。

2. 在将小鼠暴露于麻醉下之前，准备装有 25 μL 接种物的移液管。将鼠标放入异氟醚容器中并倾斜容器以监测鼠标是否失去扶正反射，此时鼠标已经失去知觉并倒置。这通常需要大约 10 秒。
3. 监测呼吸频率 （RR），直到它减慢到一致的每分钟 50-80 次呼吸 （bpm），约为静息 RR 的 50%。这通常需要另外 10 秒。此时，从异氟醚罐中取出鼠标。
   注意:这是一种高浓度的异氟醚，会产生快速麻醉诱导，必须非常密切地监测小鼠。致死性异氟醚过量是一种风险，因为异氟醚的浓度是可变的，并且对异氟醚的剂量反应曲线非常陡峭。如果呼吸频率低于 50 bpm 和/或不规则，请将鼠标从异氟醚中取出，让它恢复 3-5 分钟，然后重试（最多重复尝试两次）。
4. 通过对脚趾捏无反应来确认麻醉深度。然后，将鼠标单手仰卧，让鼠标以更高的速率（从 50-60 bpm 开始）和活力定期呼吸 3-5 次。开始时，将移液管尖端放在小鼠口咽部的后部，并在吸入过程中释放接种物。
   注意:这些通过嘴巴发出的喘息声会使头部下方震动，因为需要募集辅助呼吸的肌肉。在这些喘息过程中插入移液管时，每次喘息时，嘴都应该张开。如果嘴巴没有张开，则小鼠的麻醉不充分，可能不会从口咽部吸入内容物。移液管应压住舌头，将其推向口腔底部和前部，以防止吞咽接种物。当移液管在嘴里并且老鼠被充分麻醉时，老鼠每次喘息都会张开嘴巴。
5. 用手和拇指握住鼠标，感觉小鼠胸部后部和前部是否有湿啰音，以确认接种物的吸入。

3. 小鼠的安乐死

1. 在处死时间点前 10 分钟，用 200 mg/kg 氯胺酮和 24 mg/kg 甲苯噻嗪的混合物腹膜内注射小鼠。
2. 注射后等待 10 分钟，直到小鼠进入麻醉手术平面，通过对脚趾捏无反应来确认。

4. PBS 和福尔马林灌注肺部

1. 用 70% 乙醇喷洒麻醉的小鼠。用剪刀剪回小鼠的皮肤，拉开皮肤，露出四面八方的腹膜。将鼠标上半部分的皮肤拉过头顶，从皮肤中拉出手臂。
2. 在胸骨和胸腔的下侧切开腹膜，露出腹膜。将肝脏向下移位，露出隔膜。用剪刀小心地将隔膜从肺实质上刺出，以避免在肺部本身刺穿一个洞。
   注意:无意中刺穿肺部将使随后的空气无法充气。
3. 隔膜穿刺后，空气进入胸部，使肺部塌陷。切开左侧的胸腔，露出心脏。用 30 G 针头以每 5 秒 1 mL 的速率将 5-10 mL PBS 注入右心室（以避免损坏血管），迅速美白肺部。
   注意:福尔马林是一种有害的挥发性物质，应在管道式生物安全柜或通风橱内处理。
4. 完成后，取出针头并使用新针头以相同的速率将 5 mL 10% 中性缓冲福尔马林 （NBF） 注射到右心室中。

5. 给灌注的肺充气

1. 去除胸腔的前半部分。要暴露气管，请切开颈部左右两侧的上肋骨和锁骨。注意避免在气管所在的中线附近切割。用镊子将剩余的上肋和锁骨扣在颈部中线上，然后向上拉，直到气管暴露出来。
2. 准备一根 10 厘米长的缝合线，将其拉到气管下方，并在暴露的气管下端预先打一个松散的结。准备一个带有 1 G 导管的 1 mL 空气注射器。使用 18 G 针在暴露区域上端的气管上打一个孔。
3. 将导管放入该孔中，确保相对紧密的配合以防止空气逸出。在 10 秒内缓慢将 1 mL 空气注入肺部，观察所有肺叶的肺充气情况。完全充气导致肺部略微包裹心脏并填充它们在未穿刺的横膈膜中占据的体积。
4. 拉紧气管周围的结，然后取出导管。握住气管，用钝剪刀从小鼠身上取出肺部，注意不要刺穿肺部。

6. 浸入式固定和脱水

1. 将肺放在装有 20 mL 10% NBF 的 50 mL 锥形管的顶部边缘。将缝合线保持在锥形体外，拧下盖子，倒置锥形，使肺倒悬在 20 mL NBF 中。将其在 4 °C 下放置 24-48 小时。
2. 用 PBS 冲洗肺部，然后在 4 °C 下置于 30% 蔗糖-PBS （w/v） 溶液中 72-96 小时，以使肺部脱水，为冷冻保存做准备。从蔗糖中取出肺，将肺放入具有最佳切割温度 （OCT） 培养基的低温模具中，并将样品在 -80 °C 下冷冻。

7. 冷冻切片

1. 切片前，将 OCT 冻存块中的标本平衡至低温恒温器的 -20 °C 温度 1 小时。以 20-100 μm 的厚度切块。
   注意:充气会导致标本的脆性增加，增加厚度切割可以防止切片过程中组织破损。
2. 将切片收集到载玻片上，晾干 30 分钟至 1 小时，以确保组织粘附在载玻片上。
   注意:在此阶段，载玻片可保持在 -80 °C。

8. 玻片准备和封闭

1. 将载玻片在室温 （RT） 下放入 PBS 浴（在培养皿或 Coplin 罐中）中 30 分钟，以从载玻片中取出 OCT。
   注:较厚的部分 （40-100 μm） 可能无法粘附在载玻片上，较薄的部分最好将它们平整和直立在培养皿中，而不是侧放到 Coplin 染色缸中。
2. OCT 从组织中溶解后干燥载玻片。使用抹布擦干组织标本周围载玻片周边的多余液滴。
3. 使用疏水性 Pap 笔在标本周围画一个周边，然后晾干 5 分钟。
4. 制备不含动物成分的封闭溶液的封闭缓冲液，每张载玻片含有 0.3% Tween-20 和 1:100 Fc 封闭剂，每张载玻片 300 mL。
   注:对于细胞内靶标，可使用 1% Tween-20。300 μL 的体积通常就足够了，但覆盖组织所需的体积完全取决于疏水标志物的周长大小。从这一点开始，组织不应干燥。
5. 将封闭溶液在载玻片上在 RT 下放置 1 小时。

9. 免疫染色

1. 通过吸出液体并加入 300-500 μL PBS 来清洗载玻片。重复洗涤一次。
2. 在含 0.33% Tween-20（或 1% 用于细胞内靶标）的无动物阻断剂溶液中制备一代 AlexaFluor-647 偶联的大鼠抗小鼠 EpCAM（克隆 G8.8）抗体（气道上皮标志物）。每张载玻片加入 300 μL 该溶液，并在 4 °C 下染色过夜。
   注:应凭经验测试抗体的染色浓度、时间和温度。对于大多数抗体，薄切片 （8-20 μm） 在 37 °C 下染色 30 分钟，较厚的切片 （20-100 μm） 在 4 °C 下染色过夜。如果使用未偶联抗体，洗涤 2 次（如上所述），并在经验确定的时间和温度下使用二抗荧光抗体。通常，二抗染色在 RT 下以 1:1000 稀释度进行 1 小时。
3. 从样本中取出抗体溶液，用 300 mL PBS 洗涤载玻片 5 分钟。重复此洗涤一次。擦干载玻片，去除标本和周围玻璃杯中所有多余的液体。
4. 向每块纸巾中加入一滴 RT 软固封片剂（例如 SlowFade Glass）。注意避免气泡，让瓶子倒置，然后慢慢将每一滴到纸巾上。放置适当大小的盖玻片，使其超出样品和疏水标志物的周边。

10. 通过荧光显微镜成像

1. 使用多通道荧光显微镜以无偏倚的方式扫描整个肺切片，使用具有足够分辨率的物镜来分辨单个孢子和宿主细胞（例如，Zeiss Axioscan 7 使用 NA = 0.8 或类似值的 20 倍油物镜）。
   注意:确保将激光功率和 PMT 电压增益设置为在用荧光减一 （FMO） 控制确定的背景上最大化目标的信噪比。
2. 收集足够的图像瓦片以捕获整个肺叶（例如，~200 个 400 μm x 400 μm 的瓦片）。使用显微镜软件程序（例如，Zeiss ZEN 3.7 或类似程序）导出合并的平铺图像以进行下游处理。

11. 通过 QuPath 进行空间分析

1. 在免费的开源软件^{QuPath 14} 中，创建一个项目文件并将荧光图像添加到该文件中。
2. 通过单击顶部菜单选项 Classify，然后单击 Pixel classification > Create Thresholder，将 EpCAM+ 像素分类为上皮。选择最能识别目标区域的分辨率、通道、平滑 Sigma 和阈值。将分类器保存在唯一名称下，然后选择 Create Objects （创建对象）。
3. 在新的 Create objects 窗口中，选择 New object type as Annotation。对于肺上皮，将最小物体尺寸和最小孔尺寸设置为 100 mm²。无需在此处选择 Split Objects （拆分对象 ）。选择 OK（确定）后，将创建注释，并且可以使用左上角的 Brush（画笔 ）工具通过眼睛对其进行修改。
4. 要对孢子进行分类，请使用捕获孢子的通道重复 11.3-11.4 中的步骤，并创建新的对象类型 Detection ，而不是 Annotation。将最小对象大小和最小孔尺寸设置为 0 mm²，然后选择 分割对象。
5. 要对孢子进行空间分析，请选择顶部菜单选项 Analyze > Spatial Analysis > Calculate signed distance to annotations 2D。将计算每个检测到的孢子到 EpCAM + 上皮的距离。通过顶部菜单选项 Measure > Export Measurements 导出这些测量值。

结果

这种方法最终使用生理性空气充气来保持气道不受干扰，从而产生小鼠肺的免疫荧光图像。重要的是，沿途的多个检查点将确认协议的组件已成功执行。在接种过程中，重要的是要通过感觉小鼠后胸壁上的"噼啪声"来确认接种物是被吸入的，这表明液体已进入气道。如果没有湿啰音的感觉，则可能是小鼠吞下了接种物。用 PBS 灌注小鼠肺应导致肺部出现白色斑点，然后整个肺完全变白（图 2A）。如果美白不完全，随后的福尔马林灌注将无法到达肺实质的所有区域（图 2B）。当用空气给肺充气时，肺应缓慢扩张，直到达到生理大小。系好气管缝合线以固定肺内的空气后，肺部的大小不应收缩。如果他们这样做，则肺很可能在手术过程中被刺穿。

在这里，我们显示了在空气充气和福尔马林液体充气肺中具有标记 的 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ 孢子（绿色）和 EpCAM + 柱状细支气管上皮（洋红色）的切片的代表性图像（分别为图 3A、B ）。这些孢子主要积聚在远端细支气管内和紧邻这些远端细支气管的肺泡间隙中，可能在肺泡管中。充气固定剂灌注肺包含孢子，孢子更频繁地出现在细支气管内并聚集在更靠近细支气管（图 3A），而不是液体固定剂，其中孢子似乎从细支气管上皮略微分散（图 3B）。通过 QuPath 空间分析，我们测量了单个孢子到最近的 EpCAM+ 细支气管上皮的距离，以指示孢子从细支气管扩散到更远端肺泡空间的扩散水平。我们表明，与生理性空气充气相比，液体充气将孢子进一步分散在远离细支气管的地方（图 4A、B）。充气血管灌注保留了这些孢子在远端细支气管中的自然定位，并防止这些孢子通过气管内固定滴注人工分散到更远端的肺泡间隙。

图 2:肺灌注成功指示。 （A） 成功灌注的肺将完全变白。（B） 未完全灌注的肺在外观上会出现粉红色或斑驳。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:空气充气福尔马林灌注肺与福尔马林充气肺中孢子分布的代表性图像。 在 （A） 充气的肺中，细胞内荧光孢子（绿色）分布得更靠近 EpCAM+ 细支气管上皮（洋红色），而不是在 （B） 福尔马林充气的肺中。在多通道荧光显微镜上以 20 倍放大倍率从每个治疗组小鼠左叶后表面深度为 1.2 mm 的切片中获得图像，并使用显微镜软件拼接瓷砖。比例尺 = 800 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

图 4:空气充气和福尔马林充气的孢子处理肺之间孢子距离 （mm） 到细支气管上皮的比较。 每个治疗组 3 只小鼠的肺，在接种 1 x 10⁶ 个 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ 节孢子后 1.5 小时成像。在距左叶后表面 0.8 mm、1.2 mm、1.6 mm 和 2.0 mm 处对每只小鼠的四个切片进行采样，染色，并在多通道荧光显微镜上成像。在 QuPath 中检测每组的所有孢子并进行空间分析，以确定 （A） 到最近的 EpCAM + 柱状细支气管上皮的距离，以及 （B） 中位数和 95% 置信区间以微米为单位显示。空气膨胀孢子，n = 11,673。液体膨胀孢子，n = 9,837。由于缺乏正态性，进行 Mann-Whitney t 检验，p < 0.0001。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

我们已经建立了孢子吸入和分析吸入孢子空间沉积的管道。该管道提供了有价值的信息，以确定吸入 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ 节孢子细胞影响的肺部相关基质区域。我们观察到球孢子菌孢子和类似大小的惰性颗粒（数据未显示）积聚在远端细支气管区域和支气管-肺泡交界处，而不是完全分散在整个肺泡气道腔内。该模型需要相对较低的设备和技术技能来生产用于免疫荧光（或其他下游管道，如免疫组织化学 [IHC]）的冷冻切片，以保持气道内容物的生理完整性，同时保持自然的肺形态。如果没有空气充气，肺泡的塌陷会扭曲细支气管周围肺实质的自然结构^13,15。美国胸科学会和欧洲呼吸学会在定义肺结构定量评估标准时，联合官方研究政策声明指出，在组织学处理过程中肺空气量的损失是一个"严重问题"¹⁶。此外，气管内滴注固定剂会破坏近端气道分子和细胞成分（如粘蛋白、表面活性剂和气道纤毛）的性质和位置 17,18,19。此处描述的方法充分保留了肺的空气量以及与吸入真菌孢子相互作用的气道上的分子和细胞成分。

免疫荧光显微镜为研究肺成分的空间动力学提供了强大的工具，并且得到了很好的评价^20,21。通过这些切片的免疫荧光法可以对靶标进行染色没有限制，除了具有对福尔马林固定敏感的表位的抗体可能无法令人满意地结合其靶标。使用新抗体时，最好准备荧光减一 （FMO） 对照，以确定抗体是否在背景之上产生任何信号。如果使用二抗，请使用不含一抗的处理组来控制二抗的脱靶结合。一抗偶联单克隆抗体具有很强的特异性，因此在较高温度 （37 °C） 下染色的时间更短（30 分钟）是很常见的，并且通常与其靶标特异性结合。另一方面，未偶联的多克隆抗体对检测抗原更敏感，但特异性较低，因此在较冷温度 （4 °C） 下较长的孵育时间 （~16 h） 可优化信噪比。所有抗体都需要经验优化。

本研究中用于孢子定位的空间分析模型测量单个孢子到最近的细支气管上皮的距离。这需要利用其高 EpCAM 信号和形态学上独特的外观作为柱状上皮衬里管状结构来适当识别细支气管上皮。EpCAM 也可以通过肺泡上皮以较低水平表达，因此在 QuPath 中对 EpCAM 信号进行阈值处理以将定义的注释限制为形态学确认的细支气管区域非常重要。由于细支气管具有解剖学的最小尺寸，我们可以将这些区域的 QuPath 定义限制为 100 mm² 的最小面积，如步骤 11.3 所述。这将从 QuPath 注释中排除整个肺泡间隙中分离的高 EpCAM 表达细胞或伪影，例如肺泡 II 型上皮细胞。这些步骤使我们能够将细支气管上皮专门定义为 QuPath 注释，并确定孢子与该定义的细支气管上皮的接近程度。

此处描述的感染模型使用异氟醚麻醉在小鼠中诱导对真菌孢子的吸入的口腔喘息反应。异氟醚开滴法已被开发为一种快速、低资源的技术，用于诱导小鼠的短期麻醉 ^9,22,23。这种方法需要一些练习才能始终如一地执行。麻醉时间必须足够长，以充分麻醉小鼠以吸出咽内容物。如果老鼠没有被充分麻醉，它可以吞下接种物而不是抽吸它。当小鼠以约 50-60 次喘息/分钟的速度产生规律的口腔喘息时，达到充分麻醉的迹象。仰卧的老鼠的头应该随着每次喘息而向前移动。麻醉不足可以通过缺乏喘息或胡须、舌头或四肢的任何运动来确定。最佳做法是在接种时用移液管尖端压住舌头，以防止吞咽。过量的异氟醚会导致小鼠死亡，必须加以预防。防止这种情况的一个好的经验法则是在鼠标失去扶正反射的相同时间后将鼠标从异氟醚中取出。例如，如果鼠标需要 10 秒才能失去扶正反射，请在再过 10 秒后取下鼠标。由于异氟醚气体在多次小鼠治疗的过程中逸出，因此这个时间范围可能会增加。在我们手中，我们可以处理 6-8 只小鼠，而无需添加更多的异氟醚。

此协议的组件存在一些限制。接种程序使用悬浮在 25 μL 液体 PBS 培养基中的孢子，其生理学性低于孢子的雾化接种。与其他接种方法（例如吸入空气中的孢子）相比，使用抽吸液是否会改变孢子/颗粒的定位，仍然存在一个悬而未决的问题。然而，雾化吸入需要大量的资源投资，并且还有其他限制（接种量有限、暴露可变、职业风险），根据研究和实验室环境的性质，这些限制可能不是最佳的。该方案的另一个限制是组织脆性可能在冷冻切片过程中发生，这可能是由于整个组织中存在空气或与气管内固定相比血管固定的有效性降低。这种冷冻切片的脆弱性可以通过切割 60-100 μm 的较厚切片并使用共聚焦显微镜对组织内的二维 （2D） 平面进行成像来克服。

我们相信这种方法的简单性和适应性将使其他群体能够发现他们选择的吸入病原体和感兴趣的宿主反应的效用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18 克，1 1/2 针 （305185）	Fisher	305185
1 升 螺口罐 （纳尔金，Nalgene）	Fisher Scientific	11-823-33
Air-Tite 散装非无菌注射器 10 mL 鲁尔锁	Fisher	14-817-175
AnaSed 注射液（甲苯噻嗪无菌溶液）	Akorn	59399-110-20
无动物阻断剂和稀释剂，R.T.U.	Vector	SP-5035-100
BD Insyte Autoguard 翼式屏蔽静脉导管，带 BD Vialon 导管材料 18 G x 1.88 英寸	BD	381547
BD Pharmingen 纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc Block™	BD	553142
CellTracker Orange CMRA 染料	Fisher Scientific	NC0873640
CFSE	Labviva	75003
球孢子菌 posadasii cts2/ard1/cts3Δ	BEI Resources	NR-166
康宁 70 微米过滤器	VWR	10054-456
EpCAM AlexaFluor647 单克隆抗体	Biolegend	118211
Exel International HYpodermic 针头 30 G x 1/2"	Labviva	EN3012
Fisherbrand 一次性使用无菌注射器（1mL，Leur Slip）Fisher		14-955-462
葡萄糖一水合	物 Azer Scientific	ES17530-500G
高真空润滑脂	VWR	59344-055
Hoechst 33342 溶液 20 mM （5 mL）	ThermoFischer	62249
异氟烷 USP	Covetrus	29405
氯胺酮盐	Dechra	1000001250
KIMWIPES 精密任务擦拭器 （4.4'' x 8.4"）	VWR	21905-026
Lexer 婴儿剪刀	FST	14078-10
Micro-Adson 镊子	FST	11018-12
中性缓冲福尔马林 （10%） （Azer Scientific）	Fisher	22-026-350
Nunc EasYFlask 组织培养瓶，T75，过滤盖	VWR	15708-134
PBS	VWR	45000-446
Peel-A-Way包埋模具	Sigma	E6032-1CS
QuPath 0.5.1 软件	开源	https://qupath.github.io/
丝缝线 线尺寸 3/0	FST	18020-30
载玻片 Micro载玻片 Superfrost Plus	VWR	48311-703
SlowFade 玻璃软固性抗淬灭封片剂 （2 mL）	ThermoFischer	S36917
蔗糖	Sigma	S0389-500G
组织-Tek OCT 化合物，Sakura Finetek	VWR	25608-930
吐温 20	ThermoFischer	J20605。
Vector Laboratories ImmEDGE 疏水屏障笔 2	Fisher Scientific	NC9545623
VWR 微型盖眼镜，矩形（24 mm x 40 mm #1.5）	VWR	48393-230
白色塑料丝网	MAPORCH	789862904922
酵母提取物	Fisher	BP9727-500
蔡司 AxioScan 7	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html	多通道荧光显微镜
ZEN 3.7 软件	Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html	显微镜软件