本文描述了in vitro条件下多房棘球绦虫（Echinococcus granulosus）的培养条件、外泌体（EVs）的分离及其产量的提升。采用动态光散射和透射电子显微镜对外泌体中的小型EVs进行表征。通过共聚焦显微镜和流式细胞术研究了骨髓来源树突状细胞对EVs的摄取及其表型调控作用。
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本文内容
摘要
摘要
绦虫分泌的细胞外囊泡对于寄生虫之间以及与宿主组织之间的细胞通讯至关重要。特别是小细胞外囊泡（sEVs）可作为纳米级载体，传递天然抗原，在宿主免疫调节和寄生虫存活中发挥关键作用。本文提供了一种从绦虫幼虫阶段培养物中分离sEVs的逐步实验方案 细粒棘球绦虫 并分析这些物质被从小鼠骨髓获得的树突状细胞的摄取情况，这些细胞在培养一周后成熟，获得黏附能力和抗原呈递能力 体外 培养。本文提供了利用超速离心法生成、纯化和定量小细胞外囊泡（sEVs）的全面信息，并结合动态光散射和透射电子显微镜进行平行分析。此外，还详细阐述了一种实验方案，用于分离和培养小鼠骨髓细胞，并通过Flt3L诱导其分化为树突状细胞。这些树突状细胞可将抗原呈递给初始T细胞，从而调节免疫反应的类型 体内因此，建议采用包括共聚焦显微镜和流式细胞术分析在内的替代性实验方案，以检测先前暴露于寄生虫sEVs的树突状细胞所获得的成熟表型。最后值得注意的是，所述方案可整体或分步应用于开展寄生虫相关研究 体外 培养、分离细胞外囊泡，建立骨髓来源树突状细胞培养物，并利用这些细胞进行摄取实验。
引言
细粒棘球绦虫 是一种人畜共患的寄生性蠕虫，可引起一种称为囊型包虫病的长期感染1在中间宿主（如家畜和人类）中，该寄生虫感染主要影响肝脏和肺脏，其幼虫阶段发育为充满液体的囊泡或含原头节（一种幼虫形态）的中绦期幼虫。与所有绦虫一样，该寄生虫缺乏消化系统和排泄系统，因此进化出了活跃的内吞和外排细胞过程，以调控代谢物的摄取与排出，并释放细胞外囊泡。2,3细胞外囊泡（EVs）是由几乎所有细胞类型分泌的脂质双层包裹的颗粒。特别是小细胞外囊泡（sEVs），定义为直径小于200 nm的EVs，无论其生物发生来源如何4，可作为细胞间免疫介质。这一功能在寄生虫中尤为重要，因为寄生虫依赖宿主免疫调节以确保其存活3通过宿主树突状细胞摄取sEVs实现免疫调控，树突状细胞是唯一能够激活初始T细胞的细胞 体内 并启动适应性免疫反应，导致这些寄生蠕虫的慢性感染。树突状细胞是先天免疫系统的专职抗原呈递细胞，可加工抗原并将抗原肽装载至主要组织相容性复合体I类和II类（MHC I和MHC II），随后将其呈递于细胞膜表面，以特异性激活初始T细胞（CD8+ 和 CD4+ T细胞，分别）5树....
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方案
所有涉及动物的实验程序均经过马德普拉塔大学精确与自然科学学院动物实验委员会的评估和批准（许可编号：RD544-2020；RD624-625-2021；RD80-2022）。本方案中，小鼠的安乐死操作依据美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理与使用指南》以及国家卫生服务与食品质量局（SENASA）的相关指导原则进行。
1. Echinococcus 幼虫阶段培养
注意：所有操作均需在无菌条件下进行。
- E. granulosus 原头蚴获取
- 使用21 G针头和10 mL注射器从感染牛的肺或肝中抽取部分包虫囊液，以降低囊肿张力（图2A).
注意：感染的肺和肝来自屠宰场常规屠宰的牛。器官必须在4℃下保存 °C并在宰杀后24小时内进行处理。 - 用剪刀打开包囊，使用镊子将包囊中的角质层和生发层取出。将这些组织连同残留的囊液一起置于无菌培养皿中图2B，C).
注意：此时建议在倒置显微镜下观察培养皿，以评估原头蚴和生发囊的质量。应避免合并来自原头蚴塌陷比例超过50%....
- 使用21 G针头和10 mL注射器从感染牛的肺或肝中抽取部分包虫囊液，以降低囊肿张力（图2A).
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结果
总结维持纯培养物主要步骤的流程图 E. granulosus 幼虫阶段、sEVs 的分离与表征及其被小鼠树突状细胞摄取的过程如图所示 图1. 为实现高产量的小细胞外囊泡（sEV）制备 E. granulosus 原头蚴和中绦期幼虫，一种 体外 采用实验室先前建立的培养方法，以最大限度地提高所研究寄生虫的存活率和代谢稳态图2).
图1：获取实验样品的实验流程概述 E. granulo.......
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讨论
培养寄生虫、分离寄生虫来源的小细胞外囊泡（sEVs）、从骨髓分化树突状细胞以及分析这些细胞对sEVs摄取的实验流程如图1所示。本方案旨在详细描述各个实验步骤，这些步骤可整体或独立实施，并强调确保方法成功实施的关键注意事项。对来源于完整寄生虫生物体的细胞外囊泡（EVs）群体进行分析，对于研究寄生虫与宿主之间的相互关系具有重要意义，本实验方案正是在此背景下制定的。
寄生虫病的新见解一直受到以下困难的阻碍： 体外 培养这些寄生虫中的一些种类。由于寄生性蠕虫在人工条件下无法完成其整个生命周期，因此它们只能以完整生物体的形式在培养中存活。因此，本方案提出的研究蠕虫-宿主相互作用界面的方法是：分别独立培养每种寄生形态（成虫及不同幼虫阶段），以富集和分离小细胞外囊泡（sEVs），随后将这些sEVs与宿主靶器官细胞或免疫系统细胞共孵育，使其分别被细胞内化或吞噬。此外，建立用于分离细胞外囊泡（EVs）的蠕虫培养体系的关键步骤是严格筛选活体寄生虫作为起始材料 体外 培养并尽量缩短孵育时间，以减少寄生虫死亡和.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者感谢阿根廷国家科学技术研究委员会电子显微镜服务中心的Cecilia Gutiérrez Ayesta学士（Lic.）以及阿根廷拉普拉塔国立大学INIFTA研究所的Leonardo Sechi学士（Lic.）和Eliana Maza学士（Lic.），分别为透射电子显微镜和动态光散射实验提供了技术协助。我们还感谢阿根廷INBIOTEC-CONICET-FIBA的Graciela Salerno博士（Dra.）、Corina Berón博士（Dra.）和Gonzalo Caló博士（Dr.）提供超速离心机的使用支持。作者衷心感谢阿根廷马德普拉塔SENASA的Kelly学士（Lic.）和阿根廷马德普拉塔国立大学国家科学技术研究委员会的H. Núñez García学士（Lic.）在小鼠福利评估方面的合作，同时感谢兽医J. Reyno、兽医S. Gonzalez和兽医L. Netti在寄生虫材料获取方面的贡献。本研究工作（包括实验、试剂和设备费用）由阿根廷国家科学技术促进局（ANPCyT）资助的PICT 2020 No. 1651项目支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 离心管 | Henso | N14059 | |
| 24孔板 | JetBiofil | CAP011024 | 聚苯乙烯，平底，无菌 |
| 6孔板 | Henso Medical Co. Ltd. | N14221 | 平底，聚苯乙烯材质，无菌 |
| 70 mm 聚丙烯细胞筛 | Biologix集团有限公司 | 15-1070 | 无菌的 |
| 阿尔新蓝 8 GX 染料 | Santa Cruz | sc-214517B | |
| 自动 CO2 培养箱 | Nuarire | UN-5100E/G DH | |
| 牛血清白蛋白 | 维纳实验室 | 1443151 | |
| CD11c 单克隆抗体-PECy5 100 µg | eBioscience | 15-0114-82 | 克隆（N418） |
| CD40 单克隆抗体-FITC 100 µg | eBioscience | 11-0402-82 | 克隆（HM40-3） |
| CD80 单克隆抗体-APC 100 µg | eBioscience | 17-0801-82 | 克隆（16-10A-1） |
| CD86单克隆抗体-FITC 100 µg | eBioscience | 11-0862-82 | 克隆（GL-1） |
| 离心 | 赛默飞世尔科技 | IEC CL31R 多速 | |
| 共聚焦显微镜 | 尼康 | 尼康共聚焦显微镜 C1 | |
| 15 mL 圆锥形管，直径 17 x 120 mm | Citotest | 4610-1865 | |
| DAPI | Sigma | 107K4034 | |
| D-葡萄糖 | 默克 | 1.78343 | |
| 二甲基亚砜 | Anedra | 6646 | |
| 胎牛血清 500 mL | Sigma-Aldrich | 12352207 | |
| 流式细胞仪系统 | BD 生物科学 | BD FACSCanto™ II | |
| 折叠毛细管Zeta电位池 | 马尔文帕纳科 | DTS1070 | |
| 硫酸庆大霉素盐 | Sigma | G1264 | |
| 戊二醛溶液 | Fluka | 49630 | |
| Hepes | Gibco | 11344041 | |
| 皮下 21 G × 1 针头"25/8 | Weigao | 无菌的 | |
| 皮下 25 G × 5/8 英寸针头" | Weigao | 无菌的 | |
| 倒置显微镜 | Leica | DMIL LED 荧光 | |
| 氯胺酮 | 霍利迪 | ||
| 脂多糖 5 mg | Invitrogen | tlrl-rslps | 来自革兰氏阴性菌大肠杆菌K12的脂多糖。TLR2/4激动剂 |
| 盐酸洛哌丁胺 | Sigma-Aldrich | 5.08162 | |
| Medium 199 | Gibco | 11150059 | |
| 亚甲蓝 | Anedra | 6337 | |
| MHC I类分子（H2kb）单克隆抗体-PE 100 µg | eBioscience | 12-5958-82 | 克隆（AF6-88.5.5.3） |
| MHC II类分子（IA/IE）单克隆抗体-FITC 100 µg | eBioscience | 11-5321-82 | 克隆（M5/114.15.2） |
| 显微镜 | Olympus | CX31 | |
| 小鼠重组鼠源 Flt3L | PrepoTech | 250-31L-10UG | |
| Nanodrop | 赛默飞世尔科技 | ND-One | |
| 多聚甲醛 | Agar Scientific | R1018 | |
| 青霉素G钠盐 | Sigma | P3032-10MU | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26 | |
| 磷酸二氢钾 | Timper | 磷酸盐缓冲盐水（PBS） | |
| 红细胞裂解缓冲液 100 mL | 罗氏 | 11814389001 | |
| RPMI 培养基 1640 1x 500 mL | Sigma-Aldrich (Gibco) | 11875093 | |
| 二甲胂酸钠 | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| 氯化钠 | Anedra | 7647-14-5 | 磷酸盐缓冲盐水（PBS） |
| 磷酸氢二钠（无水）p. a. | 生物包 | 1639.07 | 磷酸盐缓冲盐水（PBS） |
| 硫酸链霉素盐 | Sigma | S9137 | |
| 10 mL 注射器 | 不来梅 | 无菌的 | |
| 厚壁聚碳酸酯管 | 贝克曼库尔特 | 13 × 55 毫米，标称容量 4 毫升 | |
| 透射电子显微镜 | Jeol | JEOL JSM 100CX II | |
| 超速离心机 | 贝克曼 | Optima LE-80k | 90 Ti 转子 |
| 赛拉嗪 | 里士满 | ||
| Zetasizer Nano | Malvern | Nano ZSizer-ZEN3600 | 进行动态光散射和Zeta电位测量 |
参考文献
- Wen, H., et al. Echinococcosis: advances in the 21st century. Clin Microbiol Rev. 32 (2), e00075-e00118 (2019).
- Geary, T. G., Thompson, D. P. Development of antiparasitic drugs in the 21st century. Vet Parasitol. 115 (2), 167-184 (2003).
- Drurey, C., Maizels, R. ....
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