细粒棘球蚴小细胞外囊泡的分离和树突状细胞摄取

细粒棘球蚴 是一种人畜共患的寄生蠕虫，可导致称为囊型棘球蚴病¹ 型的长期感染。在中间宿主，如牲畜和人类，寄生虫感染主要影响肝脏和肺，幼虫阶段发展为充满液体的囊肿或含有原头骨（幼虫本身）的多头球蚴。像所有绦虫一样，这种寄生虫缺乏消化系统和排泄系统，因此已经进化出活跃的内吞和外吞细胞过程，以调节代谢物的摄取和排泄以及细胞外囊泡的释放^2,3。细胞外囊泡 （EV） 是显然由所有细胞类型分泌的脂质双层封闭颗粒。特别是，小细胞外囊泡 （sEV），定义为小于 200 nm 的 EV，无论其生物发生起源如何⁴，都可以充当细胞间免疫介质。这种功能在寄生虫中尤为重要，寄生虫依靠宿主免疫调节来确保其生存³。免疫作是通过宿主树突状细胞摄取 sEV 来实现的，宿主树突状细胞是唯一能够在 体内 激活幼稚 T 细胞并启动适应性免疫反应的细胞，这将导致这些寄生虫的慢性感染。树突状细胞是先天免疫系统的专业抗原呈递细胞，将抗原肽加工并加载到主要组织相容性复合物 I 类和 II 类（MHC I 和 MHC II）上，并将它们展示在它们的膜上，用于排他性初始 T 细胞启动（分别为 CD8⁺ 和 CD4⁺ T 细胞）⁵。树突状细胞通过诱导共刺激标志物 CD80/CD86 和 CD40 以及 MHC-II 的表达来诱导其成熟，并在识别外来抗原时从外周组织迁移到次级淋巴器官，加载它们以进行独家初始 T 细胞启动⁶。因此，该协议的总体目标是以现实的方式研究蠕虫寄生虫-宿主通信，分析以 sEV 形式寄生虫成分的包装和递送，这些寄生虫成分在到达宿主免疫细胞后，会影响感染的发展和慢性寄生虫病的进展。

通过研究 sEVs 来解决蠕虫-宿主界面的分析有几个优点。首先，被皮是扁虫的外层覆盖物，是一种双膜结构，构成了寄生虫与其宿主之间的主要交叉点，使 sEV 很容易从该结构中产生或渗透⁷。其次，sEV 高度加载了来自寄生虫生命周期各个阶段的蛋白质抗原，代表了宿主免疫系统在蠕虫感染期间对抗原进行采样的自然方式 ^8,9。由于其生物生产、易于纯化（无需组织破坏或蛋白质分离）以及与宿主细胞的直接相互作用，蠕虫 sEV 能够开发体外实验以模拟寄生虫-宿主相互作用的体内条件。最后，sEV 代表了具有可被宿主细胞吞噬或内化的寄生结构的可能性，克服了对整个寄生虫进行吞噬或内化的不可能性，尤其是在包囊蠕虫的情况下。

考虑到上述优势以及蠕虫病是普遍且典型的慢性疾病的事实，其中寄生虫可能纵宿主免疫系统作为生存策略，寄生虫衍生的 EV 的分离及其与树突状细胞相互作用的研究为探索这种免疫调节提供了一个有价值的框架¹⁰。从这个意义上说，已经描述过蠕虫（包括线虫和扁形蠕虫，如曼氏血吸虫、肝片吸虫、马来布鲁亚和细粒棘球菌）的 EV 的内化诱导树突状细胞的成熟和激活 9,11,12,13,14,15。

蠕虫衍生的 EV 的分离不仅能够研究免疫相互作用，可能导致针对过敏或自身免疫性疾病的保护性疫苗或免疫治疗剂的开发，而且还有助于探索其他生物相互作用和功能 ^8,16,17.在这种情况下，在寄生虫感染的自然史中发挥作用的 EV 可用于研究寄生虫的发育和与特定宿主细胞的相互作用。此外，它们可能作为早期或差异生物标志物用于诊断寄生虫病、监测治疗反应以及有助于控制和管理寄生虫感染^17,18。

此外，如前所述，细粒棘球菌的幼虫阶段易受胞质钙浓度变化的影响，这除了在寄生虫活力中发挥作用外，还控制胞吐作用率^19,20。在这种情况下，并且知道细胞内钙升高会增强 EV 释放，使用细胞内钙增强剂作为洛哌丁胺可能是增加 EV 数量的关键策略。这种方法对于需要大量人口产生足够数量的 EV 用于货物和功能分析的细胞系统特别有趣 11,21,22。目前的方案（图 1）详细说明了获得细粒 E. 细粒球菌幼虫阶段纯培养物的方法以及提高 sEV 生产的条件。它还描述了分离和表征这些囊泡的工作流程，以及它们被小鼠树突状细胞摄取，这是宿主免疫系统调节初步研究中的重要步骤。

所有涉及动物的程序均由马德普拉塔精确与自然科学学院动物实验委员会评估和批准（许可证编号：RD544-2020;RD624-625-2021 年;RD80-2022 年）。在该方案中，根据 NIH 发布的“实验动物护理和使用指南”以及国家卫生服务和食品质量 （SENASA） 的指南，对小鼠实施安乐死。

1. 棘球蚴 幼虫阶段培养

注：所有程序均在无菌条件下进行。

1. E. granulosus protoscoleces 获得
   1. 用 21 G 针头和 10 mL 注射器从受感染牛的肺或肝脏中吸出部分包虫液，以减少囊肿膨胀（图 2A）。
      注意：受感染的肺和肝脏来自屠宰场常规屠宰的牛。它们必须保持在 4 °C 并在屠宰后 24 小时内加工。
   2. 用剪刀打开囊肿，用镊子从囊肿中取出层状层和生发层。将它们与任何剩余的包虫液一起放在无菌培养皿上（图 2B，C）。
      注意：此时，建议在倒置显微镜下观察培养皿，以评估原头节和育雏囊的质量。避免从超过 50% 的原头节塌陷的囊肿中汇集生物材料，这些包囊通过其收缩的体细胞、较深的颜色和杂乱无章的喙部和失去钩子来识别。
   3. 用补充有抗生素（100 μg/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、100 μg/mL 庆大霉素 100 μg/mL）的无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗各层，以去除原头节。
      注意：所有洗涤都将使用补充有抗生素的 PBS 进行。
   4. 使用巴斯德移液管将原头节悬浮液转移到无菌玻璃 Khan 管中。
   5. 使用巴斯德移液管在4°C下用补充的PBS洗涤原头节，以去除死亡的寄生虫。大力重悬悬浮液以打破育雏囊，促进原头节的释放。让原头骨在试管底部沉降 1-2 分钟;然后丢弃含有死亡原头节的上清液。
      注意：由于密度不同，活的原头节比死的寄生虫沉降得更快。
   6. 重复洗涤过程，直到去除所有死亡和漂浮的原头骨。
      注意：当所有寄生虫都以相同的速率沉降时，会去除死亡的寄生虫。
   7. 使用亚甲基排斥试验确定原头节的活力。
      1. 用移液管重悬洗涤过的原头骨，并在载玻片上滴一滴。加入一滴 0.1 mg/mL 亚甲蓝，并用盖玻片盖住。等待 2-3 分钟，然后在显微镜下观察。
      2. 计算活的（未染色的）和死的（蓝色染色的）原头骨的总数，并计算活原头骨的百分比（图 2D 和插图）。
         注意：在建立培养物之前，原头节的存活率应在 98% 左右。染色时间不应超过 10 分钟，因为较长的持续时间可能会导致活寄生虫染色。
2. E. granulosus metacestodes 钝
   1. 通过用悬浮在 0.5 mL 补充 PBS 中的 1500 只原头骨（相当于 10 μL 的 protocolex 颗粒）腹膜内感染雌性 CF1 小鼠（体重 25 ± 5 g），产生实验性继发性包虫病（图 2E）。
      注：建议将原头节在补充有抗生素的 PBS 中在 4 °C 下维持 24 小时，或在感染前培养 3-5 天。
   2. 多棘菜在感染后 4-6 个月内发育（图 2F）。在此期间，将动物饲养在受控的实验室条件下（温度 20 ± 1 °C，12 小时光照/黑暗循环， 随意提供水和食物）。一旦囊肿发育，使用氯胺酮-甲苯噻嗪 （50 mg/kg/小鼠-5 mg/kg/小鼠）麻醉小鼠，并通过颈椎脱位对它们实施安乐死。
   3. 用 70% 酒精清洁小鼠的腹面，并使用剪刀和镊子手术打开腹膜腔以去除发达的多头绦虫。
   4. 将 metacestodes 团块转移到无菌培养皿中。
      注：metacestode 肿块由多个被结缔组织包围的内部囊肿组成。
   5. 如果需要，使用镊子小心地去除覆盖在多棘蚴上的结缔组织，从双棘蚴肿块中释放囊肿。
      注意：此步骤确保寄生虫没有宿主组织。
   6. 在4°C下用补充的PBS洗涤获得的多棘蚴（图2G）。
3. E. granulosus 原头球蚴和后棘球蚴培养
   1. 培养基制备方法如下：加入 100 μg/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素、100 μg/mL 庆大霉素、4 mg/mL 葡萄糖、50 mM Hepes 缓冲液 pH 7.5 和培养基 199 以达到所需的最终体积，并通过倒置轻轻混合。
   2. 将 5 mL 制备的培养基转移到每个 Leighton 管中（图 2H-I）。
   3. 将寄生虫添加到培养基中，并在 37 °C 下孵育 5 天，不更换培养基。以 15° 角孵育 Leighton 管，以确保生物材料在平面上均匀分布。这最大限度地提高了寄生虫对培养基的暴露，同时防止与橡胶塞接触。
      注：添加 9,000–10,000 个原头节或 50 个多头球蚴（直径在 5 mm 至 15 mm 之间，每管分布 10 个囊肿）。
   4. 或者，将 20 μM 洛哌丁胺（亚致死浓度）溶解在二甲基亚砜中 16-24 小时添加到寄生虫培养基中，以增加胞质钙水平并增强 细粒棘球蚴幼虫阶段的 EV 释放。
      注意：鉴于细胞内钙浓度的增加会增强 EV 的产生，用影响钙稳态的化合物处理寄生虫将提高 EV 的释放。

2. 细胞外囊泡纯化

1. 从每个 Leighton 管中收集寄生虫培养基，并将其转移到 15 mL 锥形管中。
   注意：培养基可以在第一次离心前储存 24 小时，对囊泡的浓度或大小分布的影响最小。原头节可以用 PBS 缓冲液洗涤 3 次，收获，并在 -20 °C 下储存在 1.5 mL 试管中。
2. 在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟，然后使用移液器将上清液转移到新的 15 mL 锥形管中。
   注意：此步骤去除死亡的原头骨。每个离心步骤后，确保沉淀上方至少有 0.5 cm 的上清液，以避免污染。
3. 将上清液在 4 °C 下以 2,000 x g 离心 10 分钟，然后使用移液管将其转移到新的 1.5 mL 试管中。
   注意：此步骤去除较大的细胞碎片。
4. 在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 30 分钟以去除较小的细胞碎片。
5. 使用移液管将上清液转移到适合超速离心机转子的试管中。在将每根试管放入超速离心机转子之前，用记号笔标记每根试管的一侧。然后，将试管放入转子中，标记面朝上。
   注意：该标记用作超速离心后定位沉淀的参考点。试管必须装满四分之三并精确平衡;因此，如果需要，添加 PBS。如果上清液体积超过单管的容量，请将样品分成多个试管，并在重悬过程中合并。
6. 在 4 °C 下以 100,000 x g 离心 1 小时，然后快速倒出上清液。让管子倒置 1 分钟。在此阶段，颗粒可能不可见。
   注意： 所用转子的 k 因子为 103。
7. 用至少 3 mL 的 PBS 洗涤沉淀，以去除污染蛋白。通过从管的上侧到底部在所有管面上上下多次上下吹打来重悬沉淀，但主要是在预计沉淀所在的标记侧。
   注：如果适用，将来自同一上清液的重悬沉淀合并到单个试管中。
8. 在 4 °C 下以 100,000 x g 离心 1 小时，然后快速倒出上清液。让管子倒置 1 分钟。
   注意： 所用转子的 k 因子为 103。
9. 按照步骤 2.7 中描述的过程，将沉淀重悬于 30 μL PBS 中。
   注：此时，建议测量重悬沉淀中的总蛋白浓度，以估计分泌的 sEV 的量。可以通过使用超微量分光光度计测量 280 nm 处的吸光度来确定蛋白质浓度。
10. 将样品转移至 1.5 mL 试管中。将细胞外囊泡在-80°C下冷冻。
    注：为了在下游应用中保持囊泡完整性，请尽快冷冻重悬的沉淀，并避免重复冻融循环。

3. 分离囊泡的表征

1. 使用动态光散射 （DLS） 测定 EV 尺寸
   注：动态光散射是一种可靠且灵敏的方法，用于评估复杂流体中纳米颗粒的大小（基于流体动力学半径 Rh）和形状，无论其类型如何。使用 633 nm 的 He-Ne 单色激光束进行 DLS 和 zeta 电位测量。如果在采样当天无法进行分析，则可以在储存前将样品冷冻在预过滤缓冲液中。
   1. 解冻样品并将其保存在冰上，直到进行测量。
      注：冷冻样品可能会影响 sEV 的颗粒分布和完整性。因此，请避免冻融循环，因为它们会导致 LS 信号减弱，峰高降低。
   2. 通过 0.2 μm 孔径过滤器过滤用于 DLS 的水样品。
      注：在 LS 实验中，必须过滤所有溶液、缓冲液和水性样品，以去除可能干扰测量的大颗粒和灰尘。
   3. 在预过滤的 PBS 中以 1：10 至 1：50 的比例稀释样品。
   4. 每次测量前通过温和倒置混合样品，以防止沉淀，因为样品处理时间较长，LS 强度会降低。
   5. 将 1 mL 样品加入干净的比色皿中，将左侧激光路径中的非磨砂面置于仪器中。盖上盖子，静置 2-3 分钟进行平衡，然后测量样品。
   6. 在执行 zeta 电位测量之前，根据流体动力学半径 （Rh） 测量尺寸。在 25 °C ± 1 °C 下以单个散射角（θ = 90° 至 150°）记录测量值。
   7. 单击 控制面板 检查 读数并开始数据采集 。
      注：根据 sEV 的平均 Rh 值和评估的尺寸分布，应观察到 30 nm 和 200 nm 之间的峰（图 3）。Rh 中低于 15 nm 的峰归因于悬浮液中的核酸和蛋白质。通常，尺寸分布是根据平均流体动力学半径计算的。但是，也可以报告 Z 平均值（样品中的平均粒径）、多分散指数（PDI，确定样品的尺寸异质性）和散射光强度的角度依赖性。
2. 通过透射电子显微镜 （TEM） 测定结构和粒度
   注：使用包括固定、脱水、树脂包埋和整装 sEV 制备的对比的标准方案进行负染色透射电子显微镜检查以评估 sEV 的大小、结构和纯度。
   1. 解冻步骤 2.10 中浓缩的 sEV 样品并将其保存在冰上。
   2. 将 sEV 固定在 1.5 mL 试管中。小心地将 5-10 μL 2.5% 戊二醛溶于 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液 （pH 7） 中，溶于 ~5 μL 的 sEV 样品沉淀中（所需 sEV 浓度≈ 1 x 10^8–1 x 10^{9 mL-1}），并在 4 °C 下孵育 2 小时。
      注：在进一步处理之前，sEV 可以在 4 °C 的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液中储存长达 1 周。因此，如果 TEM 分析需要外部技术服务，请将固定的 sEV 样品装在 1.5 mL 试管中冷藏发送。
   3. 将 5 μL 重悬的沉淀沉积在 300 目 Formvar 碳涂层的 EM 铜网格上。为每个样品准备两个或三个网格。
   4. 让样品在干燥环境中吸附 20 分钟，然后使用滤纸从网格中取出多余的样品。
   5. 将 100 μL PBS 滴剂滴在一张薄膜上。使用干净的镊子将网格（吸附的样品面朝下）转移到 PBS 液滴中进行洗涤。
   6. 干燥吸附样品的另一侧，确保在以下任何步骤中，网格的样品侧不会干燥。
      注：对于所有后续步骤，将试剂滴到平面薄膜上，并使用镊子将网格转移到液滴上。
   7. 将网格转移到 50 μL 的 1% 戊二醛液滴中 5 分钟。
   8. 用 100 μL 蒸馏水液洗网格，静置 3 分钟。重复 9 次，总共洗涤 10 次。
   9. 用 50 μL 滴 1% w/v 乙酸铀酰溶液 （pH 7） 对比样品网格 1 分钟。
   10. 对比并将网格嵌入 100 μL 4% 乙酸铀酰和 900 μL 2% 甲基纤维素的混合物中。
   11. 当网格保持在回路上时，将网格风干 5-10 分钟，然后用 80-100 kV 的电子显微镜以 0.2 nm 的分辨率和 100,000 倍的放大倍率观察它们。
   12. 将网格存放在干燥的储存箱中以便长期存放。

4. 骨髓来源的树突状细胞生成

注意：该程序应使用年轻小鼠进行，其特征是具有活性增殖和分化能力的强大造血系统。相比之下，老年小鼠表现出造血功能下降、干细胞储备减少、生态位相互作用改变以及更发达的记忆库，这对于长期免疫和对病原体或与年龄相关的变化（如免疫衰老）的反应至关重要。

1. 根据机构道德准则对 5-8 周龄的雌性 CF-1 小鼠实施安乐死，最大限度地减少动物的痛苦。
2. 在将小鼠放入组织培养罩之前，用乙醇喷洒小鼠。
   注：以下步骤必须在无菌条件下进行。
3. 将鼠标仰卧放在解剖板上。使用镊子和解剖剪刀，在尿道上方做一个垂直的 “T ”形切口，并将其水平延伸到下肢的顶部，注意不要打破腹膜或刺穿任何器官，尤其是肠道。
4. 使用镊子将双后肢的皮肤分开，露出腿骨和组织。用手去除从脚踝推向腹部的每条腿的皮肤，将皮肤拉到另一侧。然后两条腿都将没有皮肤。
   注意：将小鼠身体丢弃在病原体残留袋中。
5. 使用剪刀和镊子小心地去除股骨和胫骨，避免断裂。用镊子固定每块骨头的尖端并切断肌腱，以去除骨头周围的肌肉筋膜。用餐巾纸彻底清洁肌肉组织。
6. 取出每块骨头后，将其放入含有 2 mL 完全培养基的无菌 50 mL 管中，该管中含有补充有 5% FBS、100 U/ml 青霉素、100 U/mL 链霉素和 10 μg/mL 庆大霉素的 RPMI 培养基以去除碎片。随后，吸出并丢弃培养基，用 70% 乙醇清洗骨头两次，每次 5 分钟。
7. 将骨头转移到无菌培养皿中。
8. 使用锋利的解剖剪刀切掉两个骨骨骺以进入骨髓细胞。
9. 使用 25 G 针头小心地将四块骨头中每块骨头的骨髓细胞冲洗到无菌培养皿中，该针头连接到含有完全培养基的 20 mL 注射器上。随着骨髓的提取，骨骼会变得更加透明。
   注：20 mL 体积的完全培养基应足以从两个股骨和胫骨中洗脱骨髓细胞。
10. 通过移液将培养基与洗脱的骨髓轻轻匀浆，以去除骨结缔组织和细胞肿块。然后，将样品转移至无菌 50 mL 锥形管中，使细胞通过无菌 70 μm 聚丙烯细胞过滤器，以去除结缔组织和骨碎屑。
11. 将细胞在 4 °C 下以 450 x g 离心 7 分钟。 小心去除并丢弃上清液，确保沉淀物仍然粘附在管壁上。
12. 在室温 （RT） 下孵育细胞 1 分钟，然后将它们重悬于 500 μL 红细胞 （RBC） 裂解缓冲液中。通过添加 3 mL 完全培养基来中和裂解缓冲液。
13. 将细胞在 4 °C 下以 450 x g 离心 7 分钟。 弃去上清液，将沉淀重悬于 5 mL 完全培养基中。
14. 将细胞悬液通过无菌 70 μm 聚丙烯细胞过滤器放入无菌 50 mL 锥形管中，以去除裂解红细胞中的细胞聚集体。
15. 使用血细胞计数器计数细胞。
16. 向培养基中加入 300 ng/mL 重组小鼠 Fms 相关酪氨酸激酶 3 配体 （Flt3L）。
17. 将细胞以 1 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度接种在多孔板中。
18. 将细胞在 37 °C 下，在 5% CO₂ 的潮湿环境中孵育 7 天。
    注意：避免在细胞分化和生长时摇晃细胞，以防止自发成熟。
19. 第 3 天，从每个孔中取出 1 mL 培养基（避免干扰细胞），并用 1 mL 预热的新鲜完全培养基替换，补充有 150 ng/mL 重组鼠 Flt3L。

5. 骨髓来源的树突状细胞与细粒棘球菌细胞外囊泡之间的相互作用

1. 细胞外囊泡膜染色
   1. 解冻步骤 2.10 中储存的 sEV 并将其保存在冰上。
   2. 在 10 μL 标记载体（稀释剂 C）中重悬 10 μL 纯化的 sEV。
   3. 加入 20 μL 的 2x PKH26 染料溶液，以达到 2 μM 的最终浓度。使用移液管轻轻混匀，并在 37°C 下在黑暗中孵育 35 分钟。
      注：必须在染色前立即制备 2x PKH26 染料溶液 （4 μM），方法是将 0.5 μL PKH26 乙醇染料溶液添加到 125 μL 稀释剂 C 中。
   4. 在孵育过程中每 3-5 分钟轻轻混匀，以确保染色均匀。
   5. 加入 40 μL 1% BSA 并在 RT 下孵育 10 分钟以停止染色过程。
   6. 用 1 mL PBS 洗涤 sEV，并在 4 °C 下以 100,000 x g 离心 1 小时以去除多余的染料。
      注意： 转子的 k 因子为 103。
   7. 按照步骤 2.7 中描述的方案，将沉淀重悬于 90 μL PBS 中。
2. 用细粒棘球蚴的细胞外囊泡刺激小鼠骨髓来源的树突状细胞
   1. 从培养板孔中收获骨髓来源的树突状细胞 （BMDC） 并将它们转移到 1.5 mL 试管中。
      注：小心处理以避免细胞自发成熟。
   2. 将培养基以 450 x g 离心 5 分钟以沉淀细胞。
      注：保留离心的上清液，以便在随后的流式细胞术分析步骤中重新接种细胞。
   3. 将 BMDC 重悬于步骤 2.10 中 30 μL 未染色的 sEV 中用于流式细胞术分析，或重悬于步骤 5.1.7 中 90 μL 含 PBS 的染色 sEV 中。用于共聚焦显微镜。在 37 °C 下，在 5% CO₂ 的潮湿环境中孵育 30 分钟。每 10 分钟轻轻混合一次样品。
      注意：为确保 BMDC 和 sEV 之间的有效接触，孵育的前 30 分钟应使用 1.5 mL 试管以最小体积进行。
   4. 对于共聚焦显微镜，将细胞转移到放置在 24 孔板中的 Alcian 蓝色处理的玻璃盖玻片（直径 12 mm）上。在 37 °C 下在 5 % CO₂ 的加湿室中再孵育 30 分钟。
      注意：Alcian-blue 处理为盖玻片赋予正电荷，促进 BMDC 带负电荷的质膜的粘附。
      1. 要制备盖玻片，请将它们浸入过滤的 1% 阿尔新蓝 8 GX 染料中，然后在微波炉中加热 1-2 分钟，不要煮沸。将它们在热溶液中孵育 10 分钟，每 2 到 3 分钟旋转一次。
      2. 然后，用去离子蒸馏水清洗盖玻片以去除多余的阿尔新蓝，并在纸巾上擦干。最后，高压灭菌盖玻片并将其储存在无菌条件下直至使用。
   5. 对于流式细胞术分析，将 BMDCs-sEVs 转移回收获它们的同一孔中（参见步骤 5.2.1），加入步骤 5.2.2 中保留的上清液，并在 37 °C 下在 5% CO₂ 的潮湿气氛中孵育 18 小时。
      注：在孔中留下大约 500 μL 的培养基，以防止收集后剩余细胞干燥。
   6. 使用阳性和阴性对照来评估 BMDC 成熟度。用 100 ng/mL 脂多糖 （LPS） 刺激细胞 18 小时作为阳性对照。对于内吞作用的阴性对照，将 BMDC 与 sEVs 在 4 °C 下孵育。此外，包括未刺激的树突状细胞对照。
3. 由骨髓来源的树突状细胞捕获和内化的细 粒棘 球囊泡的细胞外囊泡的共聚焦显微镜检查。
   1. 一旦完成步骤 5.2.4 中描述的孵育期，从盖玻片中吸出并丢弃 PBS。
   2. 通过在盖玻片上加入 100 μL 4% 多聚甲醛 （PFA） 来固定 BMDC，并在室温下孵育 10 分钟。
      注意：确保体积保持盖玻片上的表面张力。
   3. 吸出并丢弃 PFA，然后用 PBS-BSA 2% 洗涤盖玻片 3 次。
   4. 加入 100 μL 含有 1/100 稀释的抗 MHC II 类-FITC 抗体的 PBS，并在黑暗中在 RT 中孵育 1 小时。
   5. 吸出并丢弃抗体溶液，并用 PBS-BSA 2% 洗涤盖玻片 3 次。
   6. 加入 100 μL 50 ng/mL DAPI，在湿室中室温下孵育 30 分钟，以对细胞核进行复染。
   7. 吸出并丢弃染料溶液，并用 PBS-BSA 2 % 洗涤盖玻片 3 次。
   8. 使用弯曲的细尖镊子取下盖玻片，并在纸巾上擦干以去除多余的液体。
   9. 使用由聚乙烯醇和甘油组成的安装介质将盖玻片面朝下安装在载玻片上。在 37 °C 下干燥 2 小时或在 4 °C 下在黑暗中过夜。
   10. 用镊子轻轻按压盖玻片，去除盖玻片和载玻片之间的任何气泡。
   11. 使用 60 倍油浸物镜在共聚焦显微镜下观察安装的样品，激发/发射波长为 FITC 为 485/538 nm，DAPI 为 358/461 nm，PKH26 为 551/567 nm。
4. 通过流式细胞术对细胞外囊泡刺激的骨髓来源的树突状细胞进行表型评价
   1. 在步骤 5.2.5 中描述的孵育期后，通过用移液管上下冲洗培养基数次来收获 BMDC。
   2. 收集含有培养基的 BMDC 并将其放入 1.5 mL 试管中。
   3. 在 4 °C 下以 450 x g 离心 5 分钟以沉淀细胞。
      注：或者，要分析细胞因子分泌，请用移液管除去上清液，将其转移到新的 1.5 mL 试管中，并将它们储存在 -20 °C 以进行进一步的酶联免疫吸附测定 （ELISA） 测试。
   4. 将 BMDC 重悬于 100 μL 含有异硫氰酸荧光素 （FITC）、别藻蓝蛋白 （APC） 或藻红蛋白偶联的 mAb 的 PBS 中，靶向 CD11c、CD40、CD80、CD86、MHC I 类和 MHC II 类，并在 4 °C 下避光孵育 15 分钟。
   5. 用 PBS 洗涤 BMDC，并在 4 °C 下以 450 × g 离心 5 分钟。
   6. 将 BMDC 重悬于 500 μL 的 1% PFA 中以固定它们并储存在 4 °C 直至在流式细胞仪中采集。

图 1 显示了一个流程图，总结了维持细粒棘球蚴幼虫阶段纯培养物、sEV 的分离和表征以及它们被小鼠树突状细胞摄取的主要步骤。为了实现细粒棘球蚴原头节和多头球蚴的高 sEV 产量，采用了先前在实验室开发的体外培养方法，以最大限度地提高所研究寄生虫的存活和代谢稳态（图 2）。

图 1：获得 细粒棘球菌 sEV 和 BMDC 的实验程序概述。 示意图描述了本协议中从获取和培养寄生虫材料 （STEP 1）、分离 （STEP 2） 和表征寄生虫 EV （STEP 3） 到 BMDC 的产生 （STEP 4） 及其与 细粒棘球菌 sEVs 的相互作用 （STEP 5）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：获取细粒棘球绦虫原头球菌和后棘球蚴的样本和体外培养。（A） 穿刺牛肺包虫囊肿以提取包虫液。（B） 打开的包虫囊肿，其膜暴露在外。（C） 包虫膜及其透明液，带有育雏囊和游离原头节，称为“包虫沙”。插图：育雏囊，里面有原脊节，形态完好。（D） 去除死亡原头骨后重要原头骨的光学显微镜检查。棒 200 μm。插图：原头骨的亚甲蓝染色显示活的原头骨（半透明）和死亡的原头骨（染色为蓝色，用红色箭头表示）。（E） 将原头节接种到 CF-1 小鼠的腹膜腔中。（F） 接种原头骨 7 个月后，腹腔内的多棘蚴发育。（G） 从小鼠中分离并用 PBS 洗涤到培养皿中的囊肿。（H，I）使用 M199 培养基在 Leighton 管中对中棘球蚴和原头骨进行体外维持。（J，K）细粒棘球蚴的后棘球蚴和原头节的光学显微镜检查。条形表示 50 μm。请单击此处查看此图的较大版本。

从 E. granulosus 幼虫阶段纯化的 EV 的特征如图 3 所示。按照当前方案分离的 EV 主要是直径范围为 50 至 200 nm 的 sEV，由 DLS（图 3A）确定并由 MET（图 3B）确认。TEM 分析还显示，sEVs 表现出外泌体样囊泡的典型杯状形态（图 3B）。此外，TEM 证实，亚致死浓度的洛哌丁胺可以作为 EV 释放增强剂，与对照相比，洛哌丁胺处理样品中 sEV 的比例增加。同样，蛋白质浓度测量进一步支持了从洛双丁胺处理的寄生虫中获得的更高丰度的 sEV（11 ± 1.5 μg/μL 与对照组的 6 ± 1 μg/μL 相比， 图 3C）。

图 3：从 E. granulosus 幼虫阶段纯化的细胞外囊泡的表征。 （A） 动态光散射 （DLS） 图描述了来自对照 （Co） 和洛哌丁胺 （Lp） 处理的原头节 （PTS） 的分离 EV 的大小分布。（B） 从对照 （a） 或洛哌丁胺处理的 PTS （d） 中纯化的负染色 EV 的透射电子显微镜 （TEM） 照片。比例尺表示 50 nm。箭头状表示丰富的外泌体样囊泡，具有典型的杯状结构。（b-c） 和 （e-f） 分别对应于 （a） 和 （d） 中框区的扩增。 （C） 来自 7 种独立分析的超速离心沉淀的蛋白质浓度。数据以 SD ±平均值表示。星号表示显著差异 （Kruskal-Wallis 与 Dunn 后测，p < 0.05）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4 通过观察骨髓细胞从初始培养建立到完全分化的数量和形态变化，说明了 BMDC 生成的过程。第 0 天，造血细胞在补充有 300 ng/mL Flt3L 的完全培养基中以 1×10 6 个细胞/mL 的密度生长，Flt3L 是一种细胞因子和生长因子，可激活造血祖细胞增殖并分化为树突状细胞形态。在第 1-2 天，细胞仍然很小且形状呈圆形，没有明显的形态变化，尽管它们的数量有所增加。在第 3-5 天之间，发生了活跃的细胞骨架重塑，导致异质、细长的形状，细胞质延伸（树突）增加。此时，培养物包含具有明显细胞质延伸的贴壁细胞、树突状细胞分化过程中发生形态变化的非贴壁细胞，以及对细胞因子诱导仍然无反应的球形非贴壁细胞（图 4）。第 6-7 天后，80%-90% 的培养物主要由稳态和完全分化的 BMDC 组成。这些细胞呈星状，具有广泛的细胞质过程，针对抗原捕获和呈递进行了优化。第 7 天，收获 BMDC 以分析其表型并进行功能测定。

图 4：使用常规倒置光学显微镜监测 FTL3L 骨髓来源的树突状细胞分化。 （A） 从补充有 flt3L 的完全培养基和细胞培养物中纯化造血前体的示意图 B- 在不同时间点获得的骨髓细胞培养物图像。插图是每个图像中方框区域的放大区域。（B） 第 0 天：最近从骨髓中纯化的造血细胞的图像。据观察，尽管群体是异质的，但大多数是具有圆形形态和小尺寸的细胞。第 1-5 天：培养图像显示由于 FLT3 信号通路激活诱导的活性增殖而导致的细胞数量增加和形态变化。细胞形态从圆形转变为细长，细胞质延伸（树突）逐渐增加。当细胞粘附在培养板的孔上时，这些变化最为明显。第 6-7 天：图像显示稳态下完全分化的 BMDC，其特征是形状不规则，细胞核突出，有许多细小的分支突起，细胞质是高度颗粒状的，囊泡参与抗原呈递和免疫反应。条形代表 10 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

由于树突状细胞是诱导免疫反应激活和定向的重要介质，因此对这些细胞进行功能分析以揭示 sEV 在宿主-寄生虫相互作用中的潜在作用至关重要。此处介绍的方案证实，BMDC 在 37 °C 下孵育 1 小时后捕获寄生虫 sEV。有趣的是，sEVs 似乎位于内体-溶酶体区室中，预先形成的 MHCII 分子在观察到它们共定位时储存在那里（图 5）。

此外，不含 EV 的染料刺激的 BMDC 作为阴性对照被纳入，以验证标记特异性。仅观察到非特异性细胞外荧光和 3%-4% 的具有弥漫染料信号的细胞，而暴露于染色 sEV 的阳性标记细胞中超过 40%。

图 5：BMDC 的 免疫荧光共聚焦显微镜 显示标记的 sEV 的有效摄取和将 MHC II 类募集到内体。 （A） 第 5.3 项中描述的方案的示意图，显示了 BMDC 中 PKH26 标记的 sEVs 刺激。（B） 共聚焦图像显示 PKH26 刺激的 BMDC 的阴性对照，不存在 sEV（红色，PKH26）和（蓝色 DAPI）。在没有 sEVs 的情况下，没有观察到来自细胞内染料的荧光信号。（C） 共聚焦图像的单独通道显示用染色的 sEV 刺激的 BMDC：微分干涉对比显微镜 （DIC）、DAPI（蓝色，细胞核）、PKH26（红色，sEV）和 FITC（绿色，MHC II 类）。比例尺代表 10 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

作者声明他们没有利益冲突。