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方法文章

小细胞外囊泡的分离及其树突状细胞摄取 细粒棘球绦虫

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DOI：

10.3791/67559

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2025年3月28日

 ,  ,  , 
1IIPROSAM, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMdP), 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3IQUIBIM, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMdP)

本文内容

摘要

本文描述了in vitro条件下多房棘球绦虫（Echinococcus granulosus）的培养条件、外泌体（EVs）的分离及其产量的提升。采用动态光散射和透射电子显微镜对外泌体中的小型EVs进行表征。通过共聚焦显微镜和流式细胞术研究了骨髓来源树突状细胞对EVs的摄取及其表型调控作用。

摘要

绦虫分泌的细胞外囊泡对于寄生虫之间以及与宿主组织之间的细胞通讯至关重要。特别是小细胞外囊泡（sEVs）可作为纳米级载体，传递天然抗原，在宿主免疫调节和寄生虫存活中发挥关键作用。本文提供了一种从绦虫幼虫阶段培养物中分离sEVs的逐步实验方案 细粒棘球绦虫 并分析这些物质被从小鼠骨髓获得的树突状细胞的摄取情况，这些细胞在培养一周后成熟，获得黏附能力和抗原呈递能力 体外 培养。本文提供了利用超速离心法生成、纯化和定量小细胞外囊泡（sEVs）的全面信息，并结合动态光散射和透射电子显微镜进行平行分析。此外，还详细阐述了一种实验方案，用于分离和培养小鼠骨髓细胞，并通过Flt3L诱导其分化为树突状细胞。这些树突状细胞可将抗原呈递给初始T细胞，从而调节免疫反应的类型 体内因此，建议采用包括共聚焦显微镜和流式细胞术分析在内的替代性实验方案，以检测先前暴露于寄生虫sEVs的树突状细胞所获得的成熟表型。最后值得注意的是，所述方案可整体或分步应用于开展寄生虫相关研究 体外 培养、分离细胞外囊泡，建立骨髓来源树突状细胞培养物，并利用这些细胞进行摄取实验。

引言

细粒棘球绦虫 是一种人畜共患的寄生性蠕虫，可引起一种称为囊型包虫病的长期感染1在中间宿主（如家畜和人类）中，该寄生虫感染主要影响肝脏和肺脏，其幼虫阶段发育为充满液体的囊泡或含原头节（一种幼虫形态）的中绦期幼虫。与所有绦虫一样，该寄生虫缺乏消化系统和排泄系统，因此进化出了活跃的内吞和外排细胞过程，以调控代谢物的摄取与排出，并释放细胞外囊泡。2,3细胞外囊泡（EVs）是由几乎所有细胞类型分泌的脂质双层包裹的颗粒。特别是小细胞外囊泡（sEVs），定义为直径小于200 nm的EVs，无论其生物发生来源如何4，可作为细胞间免疫介质。这一功能在寄生虫中尤为重要，因为寄生虫依赖宿主免疫调节以确保其存活3通过宿主树突状细胞摄取sEVs实现免疫调控，树突状细胞是唯一能够激活初始T细胞的细胞 体内 并启动适应性免疫反应，导致这些寄生蠕虫的慢性感染。树突状细胞是先天免疫系统的专职抗原呈递细胞，可加工抗原并将抗原肽装载至主要组织相容性复合体I类和II类（MHC I和MHC II），随后将其呈递于细胞膜表面，以特异性激活初始T细胞（CD8+ 和 CD4+ T细胞，分别）5树突状细胞在识别外源性抗原后，通过诱导共刺激分子标记物CD80/CD86和CD40以及MHC-II的表达，促进自身成熟，并从外周组织迁移至次级淋巴器官，进而将抗原呈递给初始T细胞以启动特异性免疫应答。6因此，本实验方案的总体目标是以更贴近实际的方式研究蠕虫寄生虫与宿主之间的相互作用，分析寄生虫成分以sEVs形式进行的包装与递送过程，这些sEVs在到达宿主免疫细胞后，将影响感染的发生以及慢性寄生虫病的进展。

通过研究sEVs来分析蠕虫-宿主界面具有多个优势。首先，扁形动物的外表皮（tegument）是一种双层膜结构，构成了寄生虫与其宿主之间物质交换的主要通道，使得sEVs能够直接由此结构生成或穿透释放7。其次，sEVs富含寄生虫生活史各个阶段的蛋白质抗原，代表了宿主免疫系统在蠕虫感染过程中识别抗原的天然途径8,9。由于sEVs具有生物学来源、易于纯化（无需组织破碎或蛋白质分级分离），并能直接与宿主细胞相互作用，因此可被用于建立体外（in vitro）实验模型，以模拟体内（in vivo）寄生虫-宿主相互作用的条件。最后，sEVs提供了一种可被宿主细胞吞噬或内化的寄生性结构，克服了使用完整寄生虫（尤其是包囊型蠕虫）进行此类实验的不可行性。

考虑到上述优势以及蠕虫病具有高发性和慢性特征，且寄生虫可能通过调控宿主免疫系统作为其生存策略，分离寄生虫来源的细胞外囊泡（EVs）并研究其与树突状细胞的相互作用，为探索这种免疫调节机制提供了有价值的框架10在这方面，已有研究描述了包括线虫和扁形动物门（如吸虫和绦虫）在内的寄生蠕虫来源的细胞外囊泡（EVs）的内化过程 曼氏血吸虫, 肝片形吸虫， 布鲁氏丝虫，以及 E. granulosus，可诱导树突状细胞的成熟与活化9,11,12,13,14,15.

分离寄生蠕虫来源的细胞外囊泡（EVs）不仅有助于研究免疫相互作用，可能推动针对过敏性疾病或自身免疫性疾病的保护性疫苗或免疫治疗剂的开发，还能促进对其他生物学相互作用和功能的探索8,16,17。在此背景下，EVs 作为寄生感染自然史中的重要参与者，可用于研究寄生虫的发育过程及其与特定宿主细胞的相互作用。此外，EVs 还可能作为寄生虫病早期诊断或鉴别诊断的生物标志物，在监测治疗反应以及寄生虫感染的防控与管理中具有潜在应用价值17,18。

此外，如先前研究所证实，E. granulosus 的幼虫阶段对胞质钙离子浓度的变化具有敏感性，而钙离子浓度不仅影响寄生虫的存活能力，还调控外泌体的释放速率19,20。在此背景下，鉴于细胞内钙离子水平的升高可促进细胞外囊泡（EV）的释放，使用如洛哌丁胺等细胞内钙离子增强剂可能成为增加EV数量的关键策略。该方法对于需要大量细胞以获得足够数量EV用于载荷分析和功能研究的细胞体系尤为有意义11,21,22。本实验方案（图1）详细描述了获取纯培养的 E. granulosus 幼虫阶段的方法及其促进小细胞外囊泡（sEV）生成的条件。同时，方案还阐述了这些囊泡的分离与表征流程，以及其被小鼠树突状细胞摄取的过程——这是研究宿主免疫系统调控机制的初始阶段中至关重要的一步。

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方案

所有涉及动物的实验程序均经过马德普拉塔大学精确与自然科学学院动物实验委员会的评估和批准（许可编号：RD544-2020；RD624-625-2021；RD80-2022）。本方案中，小鼠的安乐死操作依据美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理与使用指南》以及国家卫生服务与食品质量局（SENASA）的相关指导原则进行。

1. Echinococcus 幼虫阶段培养

注意：所有操作均需在无菌条件下进行。

  1. E. granulosus 原头蚴获取
    1. 使用21 G针头和10 mL注射器从感染牛的肺或肝中抽取部分包虫囊液，以降低囊肿张力（图2A).
      注意：感染的肺和肝来自屠宰场常规屠宰的牛。器官必须在4℃下保存 °C并在宰杀后24小时内进行处理。
    2. 用剪刀打开包囊，使用镊子将包囊中的角质层和生发层取出。将这些组织连同残留的囊液一起置于无菌培养皿中图2B，C).
      注意：此时建议在倒置显微镜下观察培养皿，以评估原头蚴和生发囊的质量。应避免合并来自原头蚴塌陷比例超过50%的包囊的生物材料，塌陷的原头蚴表现为体部收缩、颜色较深，顶突紊乱并伴有钩脱落。
    3. 用含抗生素（100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤各层 μg/mL 青霉素，100 μg/mL 链霉素，100 μg/mL 链霉素 100 μg/mL）以去除原头蚴。
      注意：所有洗涤步骤均使用添加了抗生素的 PBS 进行。
    4. 使用巴斯德吸管将原头蚴悬液转移至无菌玻璃Khan管中。
    5. 用含补充剂的 PBS 在 4 °C 下洗涤原头节 °用巴斯德吸管去除死亡的寄生虫。剧烈重悬沉淀，以破坏包囊，促进原头节释放。让原头节在离心管底部静置1–2分钟，然后弃去含有死亡原头节的上清液。
      注意：由于密度不同，活的原头蚴沉降速度比死的寄生虫更快。
    6. 重复洗涤过程，直至所有死亡和漂浮的原头蚴均被去除。
      注意：当所有死亡寄生虫以相同速率沉降时，即可将其去除。
    7. 使用台盼蓝排斥法测定原头节的活力。
      1. 用移液器重悬洗涤后的原头节，取一滴置于载玻片上。加入一滴0.1 mg/mL的亚甲蓝溶液，盖上盖玻片。静置2–3分钟，在显微镜下观察。
      2. 统计活的（未染色）和死的（蓝色染色）原头节总数，并计算可存活原头节的百分比（图2D 以及插图）。
        注意：建立培养前，原头蚴的活力应约为98%。染色时间不应超过10分钟，因为时间过长可能导致活体寄生虫被染色。
  2. E. granulosus 原头蚴获取
    1. 通过腹腔注射感染雌性CF1小鼠（体重25 g）以建立实验性继发性包虫病 ± 5 克，含 1500 个原头节（相当于 10 μL 的 protocolex 沉淀物）重悬于 0.5 mL 添加物 PBS 中（图2E).
      注意：建议将原头蚴置于添加抗生素的 PBS 中，在 4 °C 条件下保存 °在感染前，于 C 条件下培养 24 小时，或在培养体系中培养 3–5 天。
    2. 原头蚴在感染后4-6个月内发育为中绦期图2F）。在此期间，将动物饲养在受控的实验室条件下（温度 20 ± 1 °C，12小时光照/黑暗循环，提供水和食物 随意)。囊泡发育完成后，使用氯胺酮-赛拉嗪（50 mg/kg/小鼠-5 mg/kg/小鼠）对小鼠进行麻醉，并通过颈椎脱位处死。
    3. 用70%酒精清洁小鼠腹面，手术剪开腹腔，使用剪刀和镊子取出发育完全的原头蚴。
    4. 将原头蚴团块转移至无菌培养皿中。
      注意：原头蚴团块由多个被结缔组织包裹的内部囊泡组成。
    5. 使用镊子小心去除覆盖在原头蚴上的结缔组织，必要时将包囊从原头蚴团块中分离出来。
      注意：此步骤可确保寄生虫不含宿主组织。
    6. 用添加补剂的 PBS 在 4 °C 下洗涤获得的原头蚴 °C (图2G).
  3. E. granulosus 原头蚴和中绦期的培养
    1. 按如下步骤配制培养基：加入100 μg/mL 青霉素，100 μg/mL 链霉素，100 μg/mL 庆大霉素，4 mg/mL 葡萄糖，50 mM Hepes 缓冲液（pH 7.5），并用 Medium 199 补足至所需终体积，轻轻颠倒混匀。
    2. 将5 mL制备好的培养基转移至每根利顿管中（图2H–I).
    3. 将寄生虫加入培养基中，并在37℃下孵育 °在不更换培养基的情况下于15℃培养5天。将Leighton试管置于15℃培养° 倾斜以确保生物材料在平面上均匀分布。这可使寄生虫与培养基充分接触，同时避免其与橡胶塞接触。
      注意：加入9,000–10,000个原头节或50个中绦期幼虫（直径范围为5 mm至15 mm，每管分配10个包囊）。
    4. 可选地，加入20 μM 洛哌丁胺（一种亚致死浓度）溶于二甲基亚砜中，作用于寄生虫培养基 16–24 小时，以提高细胞质钙水平，并增强棘球蚴幼虫阶段的细胞外囊泡释放 E. granulosus.
      注意：由于细胞内钙离子浓度升高可增强细胞外囊泡（EV）的产生，因此使用影响钙稳态的化合物处理寄生虫将增加EV的释放。

2. 细胞外囊泡纯化

  1. 从每个利顿管中收集寄生虫培养基，并转移至15 mL锥形管中。
    注意：培养基可在首次离心前于4 °C保存24小时，对囊泡的浓度或粒径分布影响较小。原头节可用PBS缓冲液洗涤三次，收集后分装于1.5 mL离心管中，并于-20 °C保存。
  2. 在4 °C下以300 × g离心10分钟，使用移液器将上清液转移至新的15 mL锥形管中。
    注意：此步骤用于去除死亡的原头节。每次离心后，确保沉淀上方至少保留0.5 cm的上清液，以避免污染。
  3. 将上清液在4 °C下以2,000 × g离心10分钟，再用移液器转移至新的1.5 mL离心管中。
    注意：此步骤用于去除较大的细胞碎片。
  4. 在4 °C下以10,000 × g离心30分钟，以去除较小的细胞碎片。
  5. 用移液器将上清液转移至适合超速离心转子的离心管中。在将离心管放入超速离心转子前，用记号笔标记每根管的一侧，并将标记面朝上放入转子中。
    注意：标记可作为超速离心后定位沉淀的位置参考。离心管需填充至四分之三满，并精确配平；必要时可加入PBS。若上清液体积超过单管容量，可将样品分装至多根离心管中，后续在重悬时合并。
  6. 在4 °C下以100,000 × g离心1小时，迅速倾倒上清液。将离心管倒置静置1分钟。此时沉淀可能不可见。
    注意：所用转子的k因子为103。
  7. 用至少3 mL PBS洗涤沉淀，以去除污染性蛋白。通过反复吹打，从管壁上部至底部在所有管壁表面重悬沉淀，重点在标记侧（预期沉淀所在位置）进行操作。
    注意：如适用，可将来自相同上清液的重悬沉淀合并至同一离心管中。
  8. 在4 °C下以100,000 × g离心1小时，迅速倾倒上清液，将离心管倒置静置1分钟。
    注意：所用转子的k因子为103。
  9. 按照步骤2.7所述方法，用30 µL PBS重悬沉淀。
    注意：此时建议测定重悬沉淀中的总蛋白浓度，以估算分泌的小细胞外囊泡（sEVs）的量。可通过微体积分光光度计测定280 nm处的吸光度来确定蛋白浓度。
  10. 将样品转移至1.5 mL离心管中，并于-80 °C冷冻保存细胞外囊泡。
    注意：为保持囊泡完整性以用于后续实验，应尽快冷冻重悬的沉淀，并避免反复冻融循环。

3. 分离囊泡的表征

  1. 使用动态光散射（DLS）测定细胞外囊泡的大小
    ​注意：动态光散射是一种可靠且灵敏的方法，可用于评估复杂流体中纳米颗粒的尺寸（基于流体动力学半径，Rh）和形状，不受颗粒类型限制。DLS 和 zeta 电位测量使用波长为 633 nm 的 He-Ne 单色激光束进行。若无法在取样当天完成分析，样品可在储存前置于预过滤缓冲液中冷冻。
    1. 将样品解冻，并在测量前保持在冰上。
      注意：冷冻样本可能影响sEVs的颗粒分布和完整性。因此，应避免冻融循环，因其可能导致LS信号下降，峰值降低。
    2. 使用0.2 μm滤膜过滤用于DLS的水相样品 µm 孔径滤器
      注意：在光散射（LS）实验中，必须过滤所有溶液、缓冲液和水样，以去除可能干扰测量的大颗粒和灰尘。
    3. 将样品用预过滤的 PBS 稀释 1:10 至 1:50。
    4. 每次测量前轻轻倒置混匀样品，以防止沉淀；因为样品处理时间较长时，光散射强度可能会降低。
    5. 将1 mL样品加入洁净的比色皿中，将无磨砂面朝左置于仪器的激光路径中。关闭盖子，平衡2–3分钟后测定样品。
    6. 以水动力学半径（Rh）为单位测量粒径，然后进行zeta电位测定。记录单一散射角下的测量值θ = 90° 至 150°) 在 25 °C ± 1 °C.
    7. 点击 控制面板 以检查读数并 绦虫分泌的细胞外囊泡对于寄生虫之间以及与宿主组织之间的细胞通讯至关重要。特别是小细胞外囊泡（sEVs）作为纳米级载体，可转移天然抗原，在宿主免疫调节和寄生虫存活中发挥关键作用。本文提供了一项逐步操作方案，用于从细粒棘球绦虫幼虫阶段的培养物中分离sEVs，并分析这些sEVs被来源于小鼠骨髓的树突状细胞摄取的情况。这些树突状细胞在体外培养一周后成熟，获得黏附能力和抗原呈递功能。本文提供了利用超速离心法结合动态光散射和透射电子显微镜平行分析，以生成、纯化和定量sEVs的全面信息。此外，还详细描述了分离和培养小鼠骨髓细胞，并利用Flt3L诱导其分化为树突状细胞的实验方案。这些树突状细胞能够将抗原呈递给初始T细胞，从而在体内调节免疫反应类型。因此，本文提出了包括共聚焦显微镜和流式细胞术分析在内的替代性实验方案，以检测先前暴露于寄生虫sEVs的树突状细胞所获得的成熟表型。最后值得注意的是，所述方案可整体或分步应用于寄生虫的体外培养、细胞外囊泡的分离、骨髓来源树突状细胞培养物的建立以及这些细胞的摄取实验。 数据采集。
      注意：根据测得的sEVs的平均Rh值及其尺寸分布，应观察到一个介于30 nm至200 nm之间的峰（图3水力学半径（Rh）低于15 nm的峰归因于悬浮液中的核酸和蛋白质。通常，粒径分布基于平均水力学半径计算得出，但也可报告Z均粒径（样品中颗粒的平均粒径）、多分散指数（PDI，用于确定样品粒径的异质性）以及散射光强度的角度依赖性。
  2. 通过透射电子显微镜（TEM）测定结构与粒径
    注意：采用标准方案对sEVs进行负染透射电子显微镜分析，以评估其大小、结构和纯度，该方案包括固定、脱水、树脂包埋和整体染色sEV样本的对比染色步骤。
    1. 解冻步骤2.10中获得的浓缩sEV样品，并置于冰上保存。
    2. 在1.5 mL离心管中固定sEVs。小心加入5–10 µ2.5% 戊二醛的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7）中，定容至约 5 L µsEV 样品沉淀的 L（所需的 sEV 浓度 ≈ 1 × 108–1 × 109 mL-1）并在 4 ℃ 下孵育 2 小时 °C.
      注意：sEVs 可在 4 °C 下保存长达 1 周 °在0.1 M二甲胂酸钠缓冲液中于4 °C下保存，以便进一步处理。因此，若需送外进行透射电镜分析，应将固定后的sEV样品置于1.5 mL离心管中，冷藏运输。
    3. 加入5 µ将重悬后的沉淀物取 L 加到 300 目 Formvar-碳支持膜铜网上。每个样本准备两到三个铜网。
    4. 在干燥环境中静置吸附20分钟，然后用滤纸从载网上去除多余的样品。
    5. 加入100 µ将 PBS 液滴加到膜片上。用洁净的镊子将载网（吸附样品的一面朝下）转移至 PBS 液滴中进行洗涤。
    6. 干燥吸附样品的对侧，确保在后续所有步骤中，载网的样品侧不会干燥。
      注意：所有后续步骤中，将试剂滴加到平放的载膜上，并使用镊子将载网转移至液滴中。
    7. 将载网转移至50 µ1% 戊二醛溶液 5 分钟
    8. 用100洗涤网格 µ加入1滴蒸馏水，静置3分钟。重复九次，共洗涤十次。
    9. 将样品载网与50对比 µ1% (w/v) 醋酸铀酰溶液，pH 7，染色1分钟
    10. 对比并将载网嵌入100的混合液中 µL 的 4% 醋酸铀和 900 µ2% 甲基纤维素 L
    11. 将载网在铜环上静置干燥5–10分钟，随后在80–100 kV电压下，以0.2 nm分辨率和100,000倍放大倍数使用电子显微镜观察。
    12. 将载网置于干燥储存盒中长期保存。

4. 骨髓来源树突状细胞的制备

注意：本实验应使用年轻小鼠进行，因其具有活跃的造血系统，表现出旺盛的增殖和分化能力。相比之下，年老小鼠的造血功能下降，干细胞储备减少，微环境相互作用发生改变，且记忆细胞库更为发达，这在长期免疫、应对病原体以及与年龄相关的免疫衰老等变化中起关键作用。

  1. 根据机构伦理准则对一只5–8周龄的雌性CF-1小鼠实施安乐死，尽量减少动物痛苦。
  2. 在将小鼠放入组织培养超净台前，用乙醇喷洒其体表。
    注意：以下所有步骤均须在无菌条件下进行。
  3. 将小鼠仰卧固定于解剖板上。使用镊子和解剖剪，在尿道上方做一个垂直的“T”形切口，并横向延伸至下肢顶端，注意不要刺破腹膜或任何器官，尤其是肠道。
  4. 用镊子沿后肢两侧分离皮肤，暴露腿部骨骼和组织。用手从脚踝向腹部方向推剥，将每条腿的皮肤拉至对侧，使双侧腿部完全去皮。
    注意：将小鼠尸体丢弃至病原体残留物专用袋中。
  5. 使用剪刀和镊子小心取出股骨和胫骨，避免折断。用镊子夹住每根骨头的末端，剪断肌腱以去除骨骼周围的肌肉筋膜，再用纸巾彻底清除残留的肌肉组织。
  6. 每取出一根骨头，立即放入含有2 mL完全培养基的无菌50 mL离心管中，该培养基由RPMI培养基添加5%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素和10 µg/mL庆大霉素配制而成，用于去除碎片。随后吸除并弃去培养基，再用70%乙醇洗涤骨头两次，每次5分钟。
  7. 将骨头转移至无菌培养皿中。
  8. 使用锋利的解剖剪剪去两端骨骺，以暴露骨髓腔。
  9. 使用连接20 mL注射器的25 G针头，向四根骨头中分别注入完全培养基，将骨髓细胞冲洗至无菌培养皿中。随着骨髓被冲出，骨头将逐渐变得透明。
    注意：20 mL完全培养基足以从两根股骨和两根胫骨中充分洗脱骨髓细胞。
  10. 通过移液轻轻吹打混匀含有骨髓细胞的培养基，以去除骨连接组织和细胞团块。随后将悬液转移至无菌50 mL锥形离心管中，并通过无菌70 µm聚丙烯细胞滤网过滤，以去除结缔组织和骨碎片。
  11. 在4 °C条件下以450 x g离心7分钟。小心吸除并弃去上清液，确保沉淀物仍附着在管壁上。
  12. 室温（RT）孵育1分钟，然后用500 µL红细胞（RBC）裂解缓冲液重悬细胞。加入3 mL完全培养基以中和裂解反应。
  13. 在4 °C条件下以450 x g离心7分钟。弃去上清液，将沉淀用5 mL完全培养基重悬。
  14. 将细胞悬液通过无菌70 μm聚丙烯细胞滤网，滤入无菌50 mL锥形离心管中，以去除溶血后产生的细胞聚集体。
  15. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
  16. 向培养基中加入300 ng/mL重组小鼠Fms样酪氨酸激酶3配体（Flt3L）。
  17. 以1 × 106 个细胞/mL的浓度将细胞接种于多孔板中。
  18. 在37 °C、含5% CO2的湿润环境中孵育7天。
    注意：细胞分化和生长期间避免震荡，以防发生自发性成熟。
  19. 第3天时，从每个孔中移除1 mL培养基（避免扰动细胞），并补充1 mL预热的新鲜完全培养基，其中添加150 ng/mL重组小鼠Flt3L。

5. 骨髓来源树突状细胞与细粒棘球绦虫来源细胞外囊泡的相互作用 E. granulosus

  1. 细胞外囊泡膜染色
    1. 解冻步骤 2.10 中储存的小细胞外囊泡（sEVs），并保持在冰上。
    2. 将 10 μL 纯化的 sEVs 重悬于 10 μL 标记稀释液（Diluent C）中。
    3. 加入 20 μL 的 2x PKH26 染料溶液，使终浓度达到 2 μM。使用移液器轻轻混匀，并在 37˚ C 黑暗条件下孵育 35 分钟。
      注意：2x PKH26 染料溶液（4 μM）必须在染色前立即配制，方法是将 0.5 μL PKH26 乙醇染料溶液加入 125 μL Diluent C 中。
    4. 孵育期间每 3–5 分钟轻轻混匀一次，以确保染色均匀。
    5. 加入 40 μL 1% BSA，在室温下孵育 10 分钟以终止染色反应。
    6. 用 1 mL PBS 洗涤 sEVs，并在 4 °C 条件下以 100,000 x g 离心 1 小时，以去除过量染料。
      注意：转子的 k 因子为 103。
    7. 按照步骤 2.7 所述方案，将沉淀重悬于 90 µL PBS 中。
  2. 用细粒棘球绦虫（E. granulosus）的细胞外囊泡刺激小鼠骨髓来源树突状细胞
    1. 从培养板孔中收集骨髓来源树突状细胞（BMDCs），并转移至 1.5 mL 离心管中。
      注意：操作需轻柔，避免细胞自发成熟。
    2. 在 450 x g 条件下离心 5 分钟，使细胞沉淀。
      注意：保留离心后的上清液，用于后续流式细胞术分析步骤中的细胞重铺。
    3. 将 BMDCs 重悬于 30 µL 未染色的 sEVs（来自步骤 2.10）中用于流式细胞术分析，或重悬于 90 µL 含染色 sEVs 的 PBS 中（来自步骤 5.1.7）用于共聚焦显微镜观察。在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中孵育 30 分钟。每 10 分钟轻轻混匀一次。
      注意：为确保 BMDCs 与 sEVs 有效接触，前 30 分钟的孵育应在最小体积中进行，使用 1.5 mL 离心管。
    4. 对于共聚焦显微镜观察，将细胞转移至置于 24 孔板中的经阿利新蓝处理的玻璃盖玻片（直径 12 mm）上。在 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中继续孵育 30 分钟。
      注意：阿利新蓝处理使盖玻片带正电荷，有助于带负电荷的 BMDCs 细胞膜黏附。
      1. 制备盖玻片时，将其浸入过滤后的 1% 阿利新蓝 8 GX 染料中，并用微波加热 1–2 分钟（勿沸腾）。在热溶液中孵育 10 分钟，每 2 至 3 分钟轻轻摇晃一次。
      2. 随后用去离子蒸馏水清洗盖玻片以去除多余的阿利新蓝，并在纸巾上干燥。最后对盖玻片进行高压灭菌，并在无菌条件下保存至使用。
    5. 对于流式细胞术分析，将 BMDCs-sEVs 混合物重新转移回原收集孔中（见步骤 5.2.1），加入步骤 5.2.2 中保留的上清液，并在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中孵育 18 小时。
      注意：收集细胞后，孔中应保留约 500 µL 培养基，以防止残留细胞干燥。
    6. 使用阳性和阴性对照评估 BMDCs 的成熟情况。以 100 ng/mL 脂多糖（LPS）刺激 18 小时作为阳性对照。为设置内吞作用的阴性对照，将 BMDCs 与 sEVs 在 4 ˚C 条件下孵育。同时设置未刺激的树突状细胞对照组。
  3. 共聚焦显微镜观察骨髓来源树突状细胞摄取和内化细粒棘球绦虫（E. granulosus）来源细胞外囊泡
    1. 完成步骤 5.2.4 所述孵育后，吸除并弃去盖玻片上的 PBS。
    2. 在盖玻片上加入 100 µL 4% 多聚甲醛（PFA）固定 BMDCs，在室温下孵育 10 分钟。
      注意：确保液体体积足以在盖玻片表面维持表面张力。
    3. 吸除并弃去 PFA，然后用 PBS-BSA 2% 溶液清洗盖玻片三次。
    4. 加入含抗 MHC II 类分子-FITC 抗体（1:100 稀释）的 PBS 溶液 100 µL，在室温黑暗条件下孵育 1 小时。
    5. 吸除并弃去抗体溶液，用 PBS-BSA 2% 溶液清洗盖玻片三次。
    6. 加入 100 µL 50 ng/mL DAPI，在湿盒中室温孵育 30 分钟，用于细胞核复染。
    7. 吸除并弃去染料溶液，用 PBS-BSA 2% 溶液清洗盖玻片三次。
    8. 使用弯头精细镊子取下盖玻片，并在纸巾上轻轻干燥以去除多余液体。
    9. 将盖玻片面向下置于载玻片上，使用由聚乙烯醇和甘油组成的封片剂封片。在 37 °C 干燥 2 小时，或在 4 °C 黑暗条件下过夜干燥。
    10. 用镊子轻轻按压盖玻片，去除盖玻片与载玻片之间的气泡。
    11. 使用共聚焦显微镜观察封片样本，采用 60x 油镜，FITC 的激发/发射波长为 485/538 nm，DAPI 为 358/461 nm，PKH26 为 551/567 nm。
  4. 通过流式细胞术对细胞外囊泡刺激的骨髓来源树突状细胞进行表型评估
    1. 完成步骤 5.2.5 所述孵育后，用移液器反复吹打培养基，收集 BMDCs。
    2. 收集含 BMDCs 的培养基，转移至 1.5 mL 离心管中。
    3. 在 4 °C 条件下以 450 x g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
      注意：如需分析细胞因子分泌，可选择性地用移液器吸出上清液，转移至新的 1.5 mL 离心管中，并于 -20 °C 保存，用于后续酶联免疫吸附试验（ELISA）检测。
    4. 将 BMDCs 重悬于 100 µL PBS 中，其中含有针对 CD11c、CD40、CD80、CD86、MHC I 类分子和 MHC II 类分子的荧光素异硫氰酸酯（FITC）、别藻蓝蛋白（APC）或藻红蛋白偶联的单克隆抗体，在 4 °C 黑暗条件下孵育 15 分钟。
    5. 用 PBS 洗涤 BMDCs，并在 4 °C 条件下以 450 × g 离心 5 分钟。
    6. 将 BMDCs 重悬于 500 μL 1% PFA 中以固定细胞，并在 4 °C 保存至流式细胞仪检测。

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结果

总结维持纯培养物主要步骤的流程图 E. granulosus 幼虫阶段、sEVs 的分离与表征及其被小鼠树突状细胞摄取的过程如图所示 图1. 为实现高产量的小细胞外囊泡（sEV）制备 E. granulosus 原头蚴和中绦期幼虫，一种 体外 采用实验室先前建立的培养方法，以最大限度地提高所研究寄生虫的存活率和代谢稳态图2).

细粒棘球绦虫囊泡分离与分析；示意图展示了流式细胞术和共聚焦显微镜操作步骤。
图1：获取实验样品的实验流程概述 E. granulo...

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讨论

培养寄生虫、分离寄生虫来源的小细胞外囊泡（sEVs）、从骨髓分化树突状细胞以及分析这些细胞对sEVs摄取的实验流程如图1所示。本方案旨在详细描述各个实验步骤，这些步骤可整体或独立实施，并强调确保方法成功实施的关键注意事项。对来源于完整寄生虫生物体的细胞外囊泡（EVs）群体进行分析，对于研究寄生虫与宿主之间的相互关系具有重要意义，本实验方案正是在此背景下制定的。

寄生虫病的新见解一直受到以下困难的阻碍： 体外 培养这些寄生虫中的一些种类。由于寄生性蠕虫在人工条件下无法完成其整个生命周期，因此它们只能以完整生物体的形式在培养中存活。因此，本方案提出的研究蠕虫-宿主相互作用界面的方法是：分别独立培养每种寄生形态（成虫及不同幼虫阶段），以富集和分离小细胞外囊泡（sEVs），随后将这些sEVs与宿主靶器官细胞或免疫系统细胞共孵育，使其分别被细胞内化或吞噬。此外，建立用于分离细胞外囊泡（EVs）的蠕虫培养体系的关键步骤是严格筛选活体寄生虫作为起始材料 体外 培养并尽量缩短孵育时间，以减少寄生虫死亡和...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢阿根廷国家科学技术研究委员会电子显微镜服务中心的Cecilia Gutiérrez Ayesta学士（Lic.）以及阿根廷拉普拉塔国立大学INIFTA研究所的Leonardo Sechi学士（Lic.）和Eliana Maza学士（Lic.），分别为透射电子显微镜和动态光散射实验提供了技术协助。我们还感谢阿根廷INBIOTEC-CONICET-FIBA的Graciela Salerno博士（Dra.）、Corina Berón博士（Dra.）和Gonzalo Caló博士（Dr.）提供超速离心机的使用支持。作者衷心感谢阿根廷马德普拉塔SENASA的Kelly学士（Lic.）和阿根廷马德普拉塔国立大学国家科学技术研究委员会的H. Núñez García学士（Lic.）在小鼠福利评估方面的合作，同时感谢兽医J. Reyno、兽医S. Gonzalez和兽医L. Netti在寄生虫材料获取方面的贡献。本研究工作（包括实验、试剂和设备费用）由阿根廷国家科学技术促进局（ANPCyT）资助的PICT 2020 No. 1651项目支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 离心管HensoN14059
24孔板 JetBiofilCAP011024聚苯乙烯，平底，无菌
6孔板  Henso Medical Co. Ltd.N14221平底，聚苯乙烯材质，无菌
70 mm 聚丙烯细胞筛Biologix集团有限公司15-1070无菌的
阿尔新蓝 8 GX 染料 Santa Cruzsc-214517B
自动 CO2 培养箱NuarireUN-5100E/G DH
牛血清白蛋白维纳实验室1443151
CD11c 单克隆抗体-PECy5   100 µgeBioscience15-0114-82克隆（N418）
CD40 单克隆抗体-FITC 100 µgeBioscience11-0402-82克隆（HM40-3）
CD80 单克隆抗体-APC 100 µgeBioscience17-0801-82克隆（16-10A-1）
CD86单克隆抗体-FITC  100 µgeBioscience11-0862-82克隆（GL-1）
离心赛默飞世尔科技IEC CL31R 多速
共聚焦显微镜尼康尼康共聚焦显微镜 C1
15 mL 圆锥形管，直径 17 x 120 mmCitotest4610-1865
DAPISigma107K4034
D-葡萄糖默克1.78343
二甲基亚砜 Anedra6646
胎牛血清 500 mLSigma-Aldrich  12352207
流式细胞仪系统BD 生物科学BD FACSCanto™ II
折叠毛细管Zeta电位池 马尔文帕纳科DTS1070
硫酸庆大霉素盐SigmaG1264
戊二醛溶液Fluka49630
HepesGibco11344041
皮下  21 G × 1 针头"25/8Weigao无菌的
皮下  25 G × 5/8 英寸针头"Weigao无菌的
倒置显微镜 LeicaDMIL LED 荧光 
氯胺酮霍利迪
脂多糖  5 mgInvitrogentlrl-rslps来自革兰氏阴性菌大肠杆菌K12的脂多糖。TLR2/4激动剂
盐酸洛哌丁胺Sigma-Aldrich5.08162
Medium 199 Gibco11150059
亚甲蓝Anedra6337
MHC I类分子（H2kb）单克隆抗体-PE 100 µgeBioscience12-5958-82克隆（AF6-88.5.5.3）
MHC II类分子（IA/IE）单克隆抗体-FITC  100 µgeBioscience11-5321-82克隆（M5/114.15.2）
显微镜OlympusCX31
小鼠重组鼠源 Flt3LPrepoTech250-31L-10UG
Nanodrop赛默飞世尔科技ND-One
多聚甲醛Agar ScientificR1018
青霉素G钠盐SigmaP3032-10MU
PKH26Sigma-AldrichMINI26
磷酸二氢钾Timper磷酸盐缓冲盐水（PBS）
红细胞裂解缓冲液 100 mL罗氏11814389001
RPMI 培养基  1640 1x 500 mLSigma-Aldrich (Gibco)11875093
二甲胂酸钠  Sigma-AldrichC0250
氯化钠Anedra7647-14-5磷酸盐缓冲盐水（PBS）
磷酸氢二钠（无水）p. a.生物包1639.07磷酸盐缓冲盐水（PBS）
硫酸链霉素盐SigmaS9137
10 mL 注射器不来梅无菌的
厚壁聚碳酸酯管贝克曼库尔特13 × 55 毫米，标称容量 4 毫升
透射电子显微镜JeolJEOL JSM 100CX II
超速离心机贝克曼Optima LE-80k 90 Ti 转子
赛拉嗪里士满
Zetasizer Nano Malvern Nano ZSizer-ZEN3600进行动态光散射和Zeta电位测量

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