小鼠间歇性暴食摄入模型

摘要

通过间歇性给予小鼠M&M's（一种由脂肪和糖组成的高适口性食物）建立了暴食模型。与持续获得或未获得该食物的小鼠相比，间歇性获得这种高脂高糖食物的小鼠表现出类似应激的行为、摄取更多热量，并且更偏好该食物而非标准饲料。

摘要

全球每八人中就有一人受到肥胖影响。过度进食，尤其是高热量食物，在肥胖中起着重要作用。暴食症（BED）是一种由生物、心理和社会因素共同导致的复杂疾病。其特征是在短时间内大量摄入高热量食物，且常与焦虑和强烈的食物渴求相关。

本文介绍了一种利用持续性和间歇性接触新型高适口性食物（HPF）——M 的实验方案&M's —— 开发一种用于研究暴食障碍（binge eating disorder, BED）的小鼠模型。所选用的高脂高糖食物（HPF）因其高脂肪和高糖含量，且具有极强的适口性，是研究暴食行为的理想食物来源，尤其适用于探究强迫性进食行为。采用C57BL/6小鼠，我们提供持续性或间歇性接触M&M's，同时允许自由获取标准饲料和水。到第8天^th 天，间歇性摄食组小鼠表现出明显的暴食行为，该行为持续至第26天^th 这些小鼠每日摄入的热量也显著更多——主要来自甜食——高于持续获取组和对照组小鼠。持续性获取与间歇性获取之间的对比凸显了进食时间安排在促进可口食物过度摄入中的关键作用。

此外，行为评估显示，间歇性接触高偏好食物（HPF）会引发类似焦虑的行为，凸显了进食模式对进食行为和情绪状态的心理影响。通过结合这两种不同的喂养范式，本研究为高偏好食物的可获得性如何加剧暴食倾向提供了有价值的见解。该模型为研究暴食行为及其代谢后果提供了一种更贴近现实的方法，并强调了在生物医学研究中建立标准化模型的重要性。我们的研究结果揭示了暴食症（BED）背后的生理与神经机制，可能为开发针对暴食症和肥胖的有效治疗干预措施奠定基础。

引言

根据世界卫生组织的数据¹，全球每八人中就有一人患有肥胖症。尽管进食是一种生理必需，但无生理需求情况下的过度进食被认为是与超重和肥胖相关的因素之一²。众所周知，人类更偏好高热量的美味食物（如脂肪和糖类），而非更健康的食物³。

从复杂性科学的角度来看，进食障碍特别是暴食症（binge eating disorder, BED），是一种由多种生物、心理和社会因素相互作用而产生的复杂现象，其表现出诸如周期性暴食模式、复杂的代偿行为以及功能失调的人际关系等涌现性行为⁴。根据《精神障碍诊断与统计手册》第五版⁵（DSM-V）的定义，BED 的特征是在约2小时内短时间内大量摄入高热量食物。此外，BED 还常伴随焦虑和强烈食物渴求等行为共病现象^6,7。这类疾病的复杂性要求建立更优的实验模型，以捕捉这些因素之间的相互作用，从而更全面地理解暴食行为及其与肥胖之间的关联。

在基础研究中，用于模拟暴食样行为的最常用模型主要是大鼠。这些模型通常采用限时且间歇性地提供高脂或高糖食物的方法，以诱导暴食样行为^8,9,10。另一种方法是每8天一次，在短时间内（2小时）提供适口性良好的食物，称为周期性模型，所用食物为包含脂肪和糖混合物的高度适口性食物（HPF）糊剂¹¹。还有一种方法是不可预测地提供HPF饼干¹²_。 在小鼠模型中，暴食样行为通常也采用相同的周期性模型进行研究¹³。另一项小鼠研究则通过限制性接触蔗糖来诱导暴食样行为¹⁴。

尽管关于大鼠暴食样行为的研究已十分广泛，但适用于小鼠的暴食模型仍然有限。本研究旨在提出一种使用M&M's（下文简称为"HPF"）作为高热量食物（HPF）的小鼠暴食样进食模型，该模型依据Fazzino及其同事提出的HPF营养标准¹⁵。此外，我们还旨在评估HPF在持续或间歇性呈现条件下所表现出的奖赏特性。在本研究中，我们试图在小鼠模型中观察到与人类暴食障碍特定DSM-V诊断标准的相似性：在短时间内（2小时内）摄入大量食物、进食量明显超过正常水平、在已处于饱腹状态下仍大量进食，以及每周至少发生两次暴食发作。

实验室小鼠模型在生物医学研究中是一种不可或缺的工具，尤其在研究人类疾病方面具有重要意义，因为小鼠与人类共享99%的基因¹⁶。使用小鼠模型还有助于深入理解转录组信息，并针对与多种疾病相关的细胞功能及神经环路中的治疗靶点进行调控¹⁷。

因此，本研究提出一种对M&M's（一种由脂肪和糖制成的高脂肪食物）进行持续性和间歇性摄取的动物模型，以在不剥夺标准饲料或饮水的条件下，观察C57BL/6小鼠中类似暴食的行为。该模型在生物医学研究中具有创新性和必要性，为研究这些复杂问题提供了更优的方法。标准化动物模型对于获得可重复且可比较的结果至关重要，这是推动转化研究以及开发针对暴食障碍（BED）和肥胖症的有效治疗干预措施的基础。本文所述方法将拓展未来研究中对类似暴食行为的探索范围，有助于测试多种药物作为BED潜在治疗靶点的可能性。在小鼠中建立更贴近现实且标准化的模型，将有助于更深入理解进食障碍及其代谢后果背后的复杂机制，从而为BED的治疗和预防提供新的替代方案。

方案

所有实验均按照墨西哥实验室动物生产和使用技术规范官方标准（NOM-062-ZOO-1999）进行，并完全遵守墨西哥国立自治大学（UNAM）实验动物护理与使用内部委员会（CICUAL）制定的指导方针。

1. 动物

1. 按照本方案，将27只1月龄、体重16-20 g的C57BLC/6雄性小鼠单独饲养在笼中，并置于环境条件受控的环境中：12小时光照-12小时黑暗循环（06:00开灯，18:00关灯），温度维持在21 ± 22 °C，相对湿度维持在70 ± 10%。
   注：本研究仅使用雄性小鼠，以消除雌性激素在暴食型摄入期间的影响。然而，在另一项研究¹⁸中，我们将相同模型应用于雌性小鼠，发现暴食摄入量无显著差异。

2. 习惯化

1. 为30日龄的小鼠提供 随意摄取 可自由获取标准饲料和水。将它们分别置于单独的笼子中，以便于测量饮水量和摄食量。
2. 为所有小鼠提供富含环境刺激的饲养条件，包括纸筒，并以木屑作为垫料。
3. 每24小时测量一次体重、食物摄入量和饮水量，持续7天。

3. 暴食模型

1. 在适应期的第7天，将实验动物（N=27）随机分配至以下三个组别之一。
2. 让所有受试动物在2小时内（16:00至18:00）自由接触高适口性食物（HPF）（每100 g营养成分：480 kcal热量、19 g脂肪、70 g碳水化合物、5.1 g蛋白质、0.13 g盐），以减少其对HPF的陌生恐惧。
3. 持续维持各组指定的喂养条件，共26天。
   1. 普通饲料组（CG）n = 9：提供标准饲料和水的自由摄取（ad libitum）。
   2. 持续摄入组（CoG）n = 9：提供标准饲料、HPF和水的自由摄取（ad libitum）。
   3. 间歇摄入组（IG）n = 9：提供标准饲料和水的自由摄取（ad libitum），但仅在特定日期（第1、3、5、8、10、12、15、17、19、22、24和26天）的2小时内（16:00至18:00）提供HPF。
4. 从第1次实验开始至第26次实验期间，每天在16:00和18:00两次测量所有受试动物的体重、标准饲料摄入量、适口性食物摄入量以及饮水量。

4. 特殊说明

1. 将标准饲料放置在笼架上，高脂饲料（HPF）放置在小型塑料容器中。每次实验时，将这些容器随机放置在笼子的四个角落（左后、右后、右前、左前）。
2. 每周一、周三和周五补充水（280–300 mL）和标准饲料（10–15 g）。
3. 对照组（CoG）每天更换高脂饲料（4–4.5 g）。干预组（IG）在每周一、周三和周五的16:00 h放置高脂饲料（4–4.5 g）。高脂饲料按颜色随机分配（棕色、蓝色、红色、橙色、绿色和黄色），未观察到小鼠对任何颜色有偏好。
4. 适应期第7天，在16:00 h给予对照组（CoG）小鼠高脂饲料。测量所有动物的标准饲料摄入量、体重和饮水量。

5. 数据分析

1. 进行24小时摄入量测定时，记录前一天16:00和当天16:00的数值。例如，要评估第2天的摄入量，需用第2天的标准饲料、HPF、水和体重数值减去第1天对应参数的数值。
2. 进行2小时摄入量测定时，记录同一天16:00和18:00的数值。例如，用18:00的标准饲料、HPF、水和体重数值减去16:00对应参数的数值。
3. 每天在两个时间点（16:00和18:00）收集所有数据，输入电子表格，并进行千卡（kcal）计算。
   1. 计算千卡值时，根据每种食物的能量值，通过比例将消耗的标准饲料和HPF克数换算为千卡（例如，标准饲料：3.02 kcal/g；HPF：4.80 kcal/g）。
4. 使用选定的软件对数据进行分析和绘图。
   1. 进行统计分析时，采用Kruskal-Wallis检验和Mann-Whitney U 检验。

6. 开放旷场实验

注意：根据 Kraeuter 及同事¹⁹所描述的方案，进行了一项为期22天、每天14:00小时的开放场实验。该方案包括将动物放置在一个黑色丙烯酸板箱的中央。实验区域的地面为白色，网格为黑色。动物行为通过视频追踪系统进行记录和量化。该系统记录了动物在实验区域中心或周边区域所移动的距离、速度以及停留时间。

1. 测试房间和旷场装置的准备
   1. 旷场实验区域使用一个由黑色非多孔塑料制成的方形箱，尺寸为 60 cm（长）× 60 cm（宽）× 20 cm（高）。
   2. 每次使用前后，用 70%（体积比）乙醇清洁装置，以去除气味线索。
   3. 将摄像机置于装置正上方，以获得最佳探索视野。
   4. 为尽量减少动物应激，保持环境温度和湿度与常规饲养条件一致。若小鼠从一个饲养房间转移至另一房间进行实验，应在实验前每天在新房间内适应至少 1 小时。
2. 进行旷场实验
   1. 从笼中取出单只小鼠时，轻轻抓住其尾部，将其放置于旷场迷宫的中央。启动视频追踪软件的自动开始功能，该功能可检测操作者并在操作者离开摄像机视野后立即开始记录。
   2. 让小鼠在迷宫中自由活动 5 分钟。在此期间，追踪软件将记录其运动轨迹。
   3. 试验结束后，将动物从实验区域移出并放回其原饲养笼中。
   4. 清洁迷宫前，先目视计数小鼠排泄的粪便颗粒，并记录数据以供后续分析。
   5. 清除所有粪便颗粒，并擦除尿液痕迹。用 70% 乙醇喷洒装置的底部和侧壁，然后用干净的纸巾擦拭，待乙醇完全挥发干燥。
   6. 完成所有动物测试后，返回动物房，彻底清洁实验区域，并整理所有使用过的材料。
3. 数据分析
   注意：视频追踪软件可提取多种数据，例如动物的平均速度、移动距离以及在装置中心区和边缘区所花费的时间。
   1. 选择动物在装置中心区和边缘区的移动距离及停留时间。
   2. 将数据从追踪软件导出至电子表格或其他合适格式，以便进行进一步的统计分析。
   3. 使用选定的分析软件对数据进行处理和分析。

结果

通过使用高热量食物（HPF），我们成功在C57BL/6小鼠中建立了暴食模型。到第8天，暴食行为（在2小时内摄入大量食物）已稳定建立，并持续至第26天（图1A）。在间歇性进食阶段，间歇性进食组（IG）的总千卡摄入量（来自标准饲料和HPF）显著高于对照组（CG）和对照组对照组（CoG）（图1A，### p < 0.0001，*** p < 0.0001，** p < 0.001，Kruskal-Wallis检验）。CG组与CoG组之间的总千卡摄入量无显著差异（图1A，ns，p > 0.5，Kruskal-Wallis检验）。在测试日（第22、24和26天），IG组的千卡摄入量显著高于CG组和CoG组（图1B，### p < 0.0001，*** p < 0.0001，** p < 0.001，Kruskal-Wallis检验）；CG组与CoG组之间无显著差异（

讨论

我们以 Corwin 于 2006 年提出的暴食模型为基础，制定了本实验方案。然而，本研究对对照组（CoG⁸）中可口食物提供时间这一变量进行了修改。原方案中可口食物仅提供 2 小时，而我们改为对 CoG 组自由提供（ad libitum）可口食物，以更好地模拟现实中人们可全天 24 小时获取任何食物的情况。此外，我们选用 M&M's 作为高热量食物（HPF），因其同时含有脂肪和糖分，而不同于其他暴食模型通常单独使用脂肪或糖分^8,20,21,22。最后，我们将该暴食模型在 C57BLC/6 小鼠中进行了标准化，而 Corwin 之前仅在大鼠中完成了该模型的标准化。

间歇性呈现高脂食物（HPF）可能模拟不可预测的HPF暴露，从而导致HPF摄入量增加，这...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ANY-maze 视频追踪软件	斯托尔廷公司	4.73 版本
C270 高清网络摄像头	罗技	C270 HD	无需使用特定的录像设备；任何具有满意图像质量和分辨率的网络摄像头或摄像机均可满足要求。
Ambiderm 手套（黑色）	Ambiderm	7.50222×10¹²
GraphPad Prism 9	GraphPad
实验室啮齿类动物饲料 5001	LabDiet	1320	https://di.facmed.unam.mx/comisiones/Composici%C3%B3n%20del%20alimento%20Laboratory%20Rodent%20Diet%205001.pdf
M&Ms 43.8克（棕色包装）	M&M´s		每100克营养成分：480千卡，19克脂肪，70克碳水化合物，5.1克蛋白质，0.13克盐；配料： 糖、可可液块、脱脂奶粉 牛奶 粉末，可可脂 乳糖，淀粉， 牛奶 脂肪、棕榈油、葡萄糖浆、乳木果油、稳定剂（阿拉伯胶）、糊精、上光剂（蜂蜡、巴西棕榈蜡）、着色剂（E100、胭脂红、E132、E133、E150a、E150c、E150d、E153、E160a、E160e、E162、E163、E170）、甜菜浓缩汁、乳化剂（大豆） 卵磷脂（E445）、盐、食用香料、棕榈仁油、抗氧化剂（E306）。（可能含有： 花生、榛子、杏仁）。牛奶巧克力所含乳固体不得少于14%。 牛奶巧克力除可可脂外还含有植物脂肪。
开放场迷宫
聚丙烯小鼠笼	Orchid Scientific	SMP 01
啮齿类动物饮水装置	Sunnypet	SP-3656
Uline Balanza-220 克 × 0.01 克	unike.mx	H-9884
UniMask4	Uniseal
塑料瓶	unike.mx	S-14487
卫生床，动物用锯末	BIOINVERT	无编号	10 kg