从人外周血淋巴细胞中提取与鉴定微核

摘要

本方案概述了一种利用蔗糖密度梯度离心法从人淋巴细胞中提取和纯化微核的方法。该方法为研究微核的组成与功能提供了实验基础。

摘要

微核（MN）是一种异常的核结构，当细胞（尤其是骨髓或血细胞）因受到辐射等外界损伤导致DNA损伤未修复或有丝分裂错误时，便会形成微核。微核一旦形成，可积极参与多种致癌过程，包括炎症信号传导和染色体遗传重排。微核含有核DNA、组蛋白、核蛋白片段及其他活性蛋白，这些成分与其功能密切相关。研究微核的形成机制及其组成成分，对于理解其在驱动致癌过程中的作用至关重要。提取和纯化微核是实现这些研究目标的关键步骤。然而，由于微核核膜不稳定且易破裂，使得这些操作在技术上具有挑战性。目前仅有少数研究报道使用密度梯度离心法分离微核。本研究总结并简化了微核分离与纯化的流程。通过两步法，利用不同浓度的蔗糖缓冲液对经辐射处理的人外周血淋巴细胞进行微核的分离与纯化。随后验证了所获得微核的完整性和纯度，为研究微核成因及功能的研究人员提供了清晰且实用的实验操作示范。

引言

微核（MN）是一种位于细胞质中的亚细胞结构，包含核DNA、组蛋白和核蛋白片段，并由膜结构包裹^1,2。微核与主细胞核完全分离，通常呈椭圆形或圆形，位于主核附近，其大小范围为主核直径的1/16至1/3。微核的形成主要与无着丝粒染色体片段、染色体错误分离、双着丝粒染色体断裂、染色体不稳定性以及双微体（DBs）的聚集有关³。微核在健康细胞中极少出现，主要由暴露于外源性基因毒素引起，这些基因毒素会导致DNA损伤或有丝分裂错误^4,5。辐射损伤是微核形成的重要因素，随着临床和技术应用的进步，人类接触电离辐射（IR）的情况日益增加^6,7。电离辐射可诱导细胞DNA发生单链断裂（SSBs）和双链断裂（DSBs），进而导致细胞死亡或凋亡^8,9,10。微核是由未修复或错配修复的DSB所导致的染色体片段、整条染色体或染色单体形成的结构，可作为电离辐射所致损伤程度的关键指标^7,11,12。全面了解微核内的组成成分，对于减轻放射治疗的副作用以及减少公众不必要的辐射暴露至关重要^6,13。然而，迄今为止，微核内所含的蛋白质和核酸仍未被充分表征。

人们认为微核（MNs）的形成源于多种类型的DNA损伤。其复制机制和DNA修复能力受损，导致在短时间内出现大量DNA损伤^3,14,15。微核也是染色体不稳定性的重要指标，而染色体不稳定性在癌前细胞中持续存在^{3,14,16,17,18,19}。长期以来，微核一直被用作遗传毒性、肿瘤风险和肿瘤分级的生物标志物^3,20,21。一旦形成，微核可主动驱动多种致癌过程，包括炎症信号传导^22,23和染色体遗传重排^24,25,26。例如，微核通过从细胞质中招募病毒模式识别受体（PRR）环鸟苷酸-单磷酸腺苷合成酶（cGAS）来启动炎症级联反应^4,22,23,27。可能存在于微核中的其他蛋白质还包括外切核酸酶²⁸、转录机制相关蛋白⁴以及翻译辅助因子。目前尚不清楚微核是在形成过程中从细胞质蛋白质库中主动组装出一种独特且有偏向性的蛋白质谱，还是被动地从细胞核和细胞质中获取高丰度的蛋白质。除了cGAS等个别蛋白质外，特定环境在多大程度上影响微核的整体组成仍不明确。目前对整个微核图谱的理解仍然有限，尚无公开可用的数据集供研究探索。因此，迫切需要提取完整且纯化的微核，以进行对其组分的深入和全面分析。

MN中DNA复制延迟的一个原因可能是由于缺乏DNA合成和修复所需的酶和辅因子而引起的复制应激。这种缺乏可能源于MN核膜组装缺陷，导致核孔复合体缺失²⁰。因此，MN无法输入对维持核膜完整性和基因组稳定性至关重要的关键蛋白^2,29,30,31。不完整的MN核膜容易破裂，使得MN的提取极为困难。

目前，微核（MNs）主要通过蔗糖密度梯度离心法提取^27,32,33，并经流式细胞术进行纯化³⁴。本研究对MNs的分离与纯化流程进行了总结与简化。通过分离受辐射人群的外周血淋巴细胞，利用不同浓度的蔗糖缓冲液对MNs进行两次纯化。验证了MNs的完整性与纯度，为研究MNs的成因与功能提供了实用且直观的实验示范。

方案

所有涉及人外周血样本的实验均按照相关指南和规定进行。本研究经中国核工业416医院伦理委员会批准（2020年审[第48号]），并已获得所有参与者的知情同意。排除标准包括患有重大慢性疾病（如肿瘤、痛风或血液系统疾病）的个体，以及职业上接触放射性或致突变物质的个体。本研究采集了一名28岁健康男性10 mL外周血，置于含肝素钠作为抗凝剂的采血管中。样本随后接受辐照 体外 与 ⁶⁰使用γ射线空气动能治疗级标准装置在37 °C条件下进行辐照，辐照剂量设定为4.0 Gy，剂量率为0.6350 Gy/min。辐照后，样品在37 °C孵育2小时，接种至RPMI-1640培养基中，并在37 °C培养60小时。本研究所用试剂与设备的详细信息见于 材料表.

1. 微核和细胞核的制备

1. 向外周血细胞培养基中加入细胞松弛素B，使其终浓度为10 µg/mL。在37 °C下孵育45分钟。
   注意：细胞松弛素B是一种肌动蛋白聚合抑制剂，可在细胞裂解前有效促进微核与细胞核的分离³⁵。
2. 在4 °C下，以200 × g离心血液细胞5分钟。
3. 用10 mL预先在4 °C冷却的0.01 M PBS重悬血液细胞。

2. 分离 淋巴细胞

1. 向一个50 mL锥形管中加入15 mL人淋巴细胞分离液。小心地将悬浮的外周血细胞叠加在分离液上方。
2. 在4 °C条件下，以400 × g离心30分钟。
   注意：离心后，管中的血液细胞会自上而下分为四层：第一层为血浆层（血小板），第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明的分离液层，第四层为红细胞层。
3. 小心地将第二层（淋巴细胞）转移至另一离心管中。加入相当于所转移细胞体积三倍的PBS（0.01 M），充分混匀后，在4 °C条件下以200 × g离心10分钟。用移液器弃去上清液。

3. 裂解 淋巴细胞

1. 将收集在锥形管中的细胞沉淀置于冰上。
2. 加入 6 mL 冷裂解缓冲液（表 1，补充文件 1），并用裂解缓冲液重悬细胞沉淀。
   注意：裂解缓冲液应在使用前立即添加 表 2（补充文件 1）中列出的组分。
3. 将细胞裂解物转移至玻璃匀浆器中。
4. 轻轻使用松散研磨头，通过上下移动匀浆器 10 次，手动匀浆样品。
5. 将匀浆后的细胞裂解物转移回 50 mL 锥形管中。
   注意：所有操作步骤均应轻柔进行，并始终保持样品处于冰上。

4. 运动神经元的初始分离 通过 蔗糖密度梯度

1. 将5 mL细胞裂解液与等体积的1.8 M蔗糖缓冲液（表3，补充文件1）混合，使裂解液与蔗糖缓冲液的比例为1:1。
   注意：1.8 M蔗糖缓冲液应在使用前立即添加表4（补充文件1）中列出的成分。
2. 制备蔗糖密度梯度：将15 mL的1.6 M蔗糖缓冲液（表5，补充文件1）加入50 mL锥形管底部。然后缓慢地将20 mL的1.8 M蔗糖缓冲液（表3，补充文件1）加至1.6 M蔗糖缓冲液上方。
   注意：1.6 M和1.8 M蔗糖缓冲液均应在使用前立即分别添加表4（补充文件1）中所列成分。添加蔗糖缓冲液时，将移液器吸头紧贴锥形管内壁上部，缓慢移液。
3. 将10 mL的[裂解液:1.8 M蔗糖缓冲液=1:1]混合液缓慢移加至双层蔗糖密度梯度上方。
   注意：逐层添加时应缓慢操作，以确保中间的1.8 M缓冲液层不与下方的1.6 M缓冲液层混合，同时上层的裂解细胞与1.8 M蔗糖缓冲液1:1混合液不与中间的1.8 M缓冲液层混合。
4. 将离心管置于水平转子离心机中，在4 °C条件下以1000 × g 离心20分钟。
   注意：离心后液体将分为三层：上层约含3 mL细胞碎片，中层约含3 mL微核（MNs），下层约含39 mL细胞核。
5. 移除靠近液面的上层约3 mL液体，并从中层收集约3 mL未纯化的微核，用于后续的第二次蔗糖密度梯度分离。

5. MNs 的二次纯化 通过 蔗糖密度梯度

1. 制备蔗糖密度梯度：
   1. 将 3 mL 的 1.8 M 蔗糖缓冲液（表 3，补充文件 1）加入到 15 mL 圆锥形离心管底部。
   2. 将 3 mL 的 1.5 M 蔗糖缓冲液（表 6，补充文件 1）缓慢加至 1.8 M 蔗糖缓冲液上方。
   3. 最后，将 3 mL 的 1.4 M 蔗糖缓冲液（表 7，补充文件 1）缓慢加至 1.5 M 蔗糖缓冲液上方。
      注意：将移液器吸头紧贴离心管内壁上部，缓慢加入溶液。
2. 从第二个蔗糖密度梯度中缓慢吸取中间层的 3 mL 溶液，加至三层蔗糖密度梯度的上层。
   注意：逐层添加时应缓慢操作，避免各层混合。
3. 将离心管置于水平转子离心机中，在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 20 分钟。
   注意：离心后，上层将含有 1–4 mL 纯化的微核（MN），下层主要含有约 8 mL 的细胞核。
4. 保留上层 1–4 mL 的纯化微核，用于后续实验。

6. 运动神经元的鉴定

1. 取未纯化的微核溶液（步骤4获得）和纯化的微核溶液（步骤5获得），在载玻片上制备细胞涂片。
2. 加入4%多聚甲醛溶液，在室温（RT）固定样品15分钟。
3. 用PBS（0.01 M）洗涤载玻片两次，每次3分钟。
4. 加入0.1% Triton X-100，在室温（RT）透化细胞5分钟。
5. 用5% BSA在室温（RT）封闭细胞30分钟。
6. 加入抗γ-H2AX一抗（用5% BSA稀释，1:200），在室温（RT）孵育1小时。
7. 用PBS（0.01 M）洗涤载玻片两次，每次5分钟。
8. 加入二抗（用5% BSA稀释，1:500），在室温（RT）避光孵育1小时。
9. 加入DAPI染色液，在室温（RT）孵育15分钟。
10. 用PBS（0.01 M）洗涤载玻片两次，每次3分钟。
11. 在载玻片上滴加封片液进行封片。
12. 在荧光显微镜下观察荧光（放大倍数：400×，自动对焦，自动曝光），并使用细胞计数板计数微核。
    注意：4%多聚甲醛、0.1% Triton X-100和5% BSA均用PBS（0.01 M）稀释。γ-H2AX（Gamma H2AX）是组蛋白H2AX蛋白的磷酸化形式，由DNA损伤诱导产生。在细胞核中，组蛋白H2AX的磷酸化集中在特定区域，因此抗γ-H2AX荧光可能呈现斑点状。在微核中，组蛋白H2AX的磷酸化分布更广泛，导致整体荧光更强且斑点清晰³⁶。DAPI是一种可强烈结合DNA的荧光染料，常用于荧光显微镜检测。由于微核含有断裂的DNA和组蛋白片段，因此可被抗γ-H2AX荧光抗体和DAPI染色。荧光信号可反映微核的数量、大小和完整性，有助于将其与主核区分开来，并评估纯化效果³²。

结果

辐射暴露后，将人外周血在RPMI-1640培养基中孵育60 h，然后加入细胞松弛素B以制备微核（MN）。使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，随后用特制的细胞裂解液进行裂解，并在玻璃匀浆器中轻柔匀浆。将匀浆液与1.8 M蔗糖缓冲液按1:1比例混合。经第一次蔗糖密度梯度离心后获得未纯化的微核，经第二次蔗糖密度梯度离心后获得纯化的微核（图1）。

经过第一次蔗糖密度梯度离心后，将未纯化的微核制备成细胞涂片，并进行抗γ-H2AX和DAPI荧光染色。结果显示未纯化的微核大小差异较大，可见一些较大的微核（图2A）。经过第二次蔗糖密度梯度离心后，将纯化的微核制备成细胞涂片，并进行抗γ-H2AX和DAPI荧光染色。结果表明，纯化后的微核体积较小，微核之间的大小差异不明显，且未观察到大的细胞核（图2B）。基于10 mL外周血，可获得10万至20万个微核。

讨论

在此方法中，采用经辐照的人类外周血淋巴细胞用于微核（MNs）的分离与纯化。许多先前的研究已报道了细胞裂解及微核初步分离的详细步骤。^4,32,33,34细胞裂解液通常包含0.1% NP-40，可破坏细胞膜而对核膜影响较小，从而保持细胞核及微核的完整性。值得注意的是，裂解液中的其他组分也具有缓冲作用。^4,32,33,34由于组装不完全，MN膜容易破裂^2,29,3...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆锥形离心管	Thermo	339650
4% 多聚甲醛溶液	Beyotime	P0099
50 mL 圆锥形离心管	Thermo	339652
Anti-γ-H2AX 抗体	Bioss	bsm-52163R
牛血清白蛋白	Beyotime	ST023
氯化钙	Biosharp	BS249
细胞松弛素 B	Macklin	14930-96-2
DAPI 染色液	Bioss	S0001
二硫苏糖醇 (DTT)	Coolaber	CD4941
EDTA	Biosharp	BS107	乙二胺四乙酸
荧光显微镜	Nikon	Ti2-U
匀浆器	Ybscience	YB101103-1(20 mL)
水平控温离心机	Thermo	Sorvall ST1R plus	刹车速度设定为 "5"
人淋巴细胞分离液	Beyotime	C0025
醋酸镁	Macklin	M833330
NP-40	Coolaber	SL9320	10% 溶液
磷酸盐缓冲液(PBS)	HyClone	SH30256.01B
蛋白酶抑制剂	Coolaber	SL1086	混合物 (100×)
二抗	Bioss	Bs-0295G	山羊抗兔 IgG H&L/FITC
亚精胺	Coolaber	CS10431
精胺	Coolaber	CS10441
蔗糖	Coolaber	CS10581
Tris-HCl	Biosharp	BS157
Triton X-100	Beyotime	P0096