需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞移植生物工程化肺

1.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/67565

⸱

2025年3月28日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic Surgery, Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了利用脱细胞和再细胞化方法构建生物工程小鼠肺脏的技术，同时详细描述了后续的原位肺移植过程。

摘要

肺移植是治疗特发性肺纤维化等终末期肺部疾病患者的关键疗法，但仍面临供体短缺和移植后并发症等挑战。通过将患者特异性细胞整合到脱细胞动物支架中构建的生物工程肺，提供了一种有前景的替代方案。尽管在动物模型中应用生物工程肺已取得进展，其功能和结构仍不够成熟。本方案旨在解决器官生物工程领域的一个关键障碍：缺乏一种经济高效的实验平台。通过采用小鼠模型而非大鼠或猪等较大的动物，研究人员可显著减少每次实验所需的资源，从而加快研究进程。

该方案详细阐述了利用小鼠心肺组织块和人原代细胞进行肺脏生物工程的实验流程，重点包括小鼠心肺组织块的分离策略、脱细胞处理、生物反应器的构建、基于灌注的器官培养以及生物工程化肺脏的原位移植。该适用于小鼠规模的研究平台不仅可降低实验成本，还为优化再细胞化过程中细胞类型与数量的选择、利用组织学和分子生物学方法检测不同细胞类型的效果，以及确保移植后血流灌注的可行性提供了有效框架。该方法具有广泛的应用潜力，可用于研究三维培养条件下的细胞间相互作用、细胞与基质间的相互作用等 离体 癌症建模，从而推动器官生物工程领域的发展。

引言

肺移植已成为治疗终末期肺病患者的决定性疗法1，例如特发性肺纤维化，此类疾病使用药物治疗无法阻止呼吸功能的恶化。每年有更多符合条件的患者加入等待名单；然而，来自已故供体的器官捐献数量一直未能跟上等待移植患者人数的增长2,3。即使接受了肺移植，仍存在多种问题会损害移植肺的功能，包括原发性器官功能障碍、异体反应综合征以及感染，这些因素显著降低了肺移植受者的5年生存率4。

解决当前器官移植问题的多种方案包括利用边缘供体5，供体肺的复苏 离体 肺灌注系统6以及利用基因编辑猪进行的异种移植7这些替代方案可以扩大供体器官的来源，但均无法完全解决供体器官短缺、免疫原性及功能异质性等问题。

尽管距离现实尚远，但将患者特异性细胞整合到去细胞化动物器官支架中的生物工程人工器官，是实体器官移植的一个极具吸引力的潜在来源8。自2010年以来，已有数项开创性研究报道了生物工程肺的潜在应用价值9,10。在这些研究中，通过去污剂对大鼠或猪的肺进行去细胞化处理，然后经气管或肺血管注入动物或人类细胞，在基于灌注的生物反应器中再生肺组织，其中部分肺器官被原位移植到动物胸腔内11,12,13,14,15。然而，生物工程肺的结构与功能仍不成熟，可能原因是生物反应器中培养的细胞数量不足，或细胞间连接整合程度较低。

推动器官生物工程研究进展的一个障碍是缺乏小规模的实验平台。虽然大鼠或猪是该领域常用的实验动物，但每只肺需要>108个肺细胞16，这对学术实验室而言成本极高。如果能将小鼠用于器官生物工程研究，我们将能够显著降低每次实验的成本，并加快研究进程。尽管小鼠肺与人类肺存在解剖学差异17，但哺乳动物肺的基本结构是相似的18。因此，小鼠规模实验的结果可通过按体重比例放大细胞数量，推广应用于更大的动物。

本方案旨在描述利用小鼠心肺组织块和人原代细胞进行肺生物工程的详细实验步骤19。本研究采用了此前已报道且广泛使用的小鼠肺脱细胞方案20,21,22。肺生物工程中的难点在于对脱细胞后毛细血管脉管系统的再细胞化20；因此，本方案将使用人脐静脉内皮细胞。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有实验均遵循东北大学动物实验及相关活动管理条例（15th （第X版），由东北大学出版23本研究已获得东北大学机构动物护理和使用委员会的批准（#2020AcA-041-01）。

1. 脱细胞材料的准备

  1. 脱细胞溶液的制备（1 L 可高压灭菌玻璃瓶中的 1,000 mL 规格）
    1. 无菌去离子水：将1,000 mL蒸馏水或去离子水加入1 L可高压灭菌的玻璃瓶中，在121 °C下高压灭菌20 min。
    2. Triton X-100：在1 L可高压灭菌的玻璃瓶中，将1 mL Triton X-100加入1,000 mL无菌去离子水中。（可选）加入10 mL青霉素-链霉素溶液（终浓度为500 units/mL青霉素和500 µg/mL链霉素）。
      注意：请勿进行高压灭菌。
    3. 脱氧胆酸钠：将20 g脱氧胆酸钠粉末加入1 L可高压灭菌玻璃瓶中的1,000 mL无菌去离子水中。盖紧瓶盖并翻转瓶子以溶解粉末。（可选）加入10 mL青霉素-链霉素溶液。
      注意：请勿进行高压灭菌。
    4. 1 M NaCl：将58.44 g NaCl加入1,000 mL去离子水或蒸馏水中，置于1 L可高压灭菌玻璃瓶中。在121 °C条件下高压灭菌20分钟。
    5. DNase I 储存液：用A型培养基稀释至10 mg/mL浓度。
      1. 溶液A：配制5 mM CaCl2 （5 mg 的 CaCl₂）2 在9 mL无菌去离子水中进行1:10稀释。
    6. DNase I 工作液：将 33 µL DNase I 储存液加入 10 mL 介质 B 中。
      1. 培养基B：配制10倍浓度的培养基B（155 mg MgSO₄）4 + 220 mg 的 CaCl2 在100 mL无菌去离子水中）并用无菌去离子水按1:10稀释。
  2. 肺动脉（PA）和气管导管的制备（无菌操作）
    1. 将PA导管（大鼠颈静脉导管）剪成约15 mm的长度。
    2. 将导管上的管套移至导管末端。
    3. 将导管连接器插入肺动脉导管，并将其连接至注射器。已准备好的肺动脉导管如图所示。 图1A.
    4. 将PA导管保存在70%乙醇中，直至使用。
    5. 将20 G静脉导管截成约15 mm长度，用于制备气管导管。
  3. 小鼠心脏-肺组织块采集手术
    1. 安乐死一只雄性小鼠（C57BL/6，体重 > 28 g）用过量的二氧化碳或异氟烷处死。
    2. 将小鼠仰卧位固定于手术台上，并固定四肢。用70%乙醇喷洒胸部和腹部表面进行消毒。
    3. 沿中线用不锈钢剪刀从腹部开口至颈部，用剪刀剪开胸骨。将膈肌从胸壁上切除，剪开腹侧胸壁以充分暴露胸腔，并移除胸腺。用4-0丝线结扎下腔静脉和右上腔静脉，以防止在步骤1.3.5中PBS反流，从而增强肺血管内血液的冲洗效果。
    4. 用不锈钢剪刀剪断腹主动脉以进行引流。若腹主动脉难以辨认，可一并剪断下腔静脉和腹主动脉。
    5. 用5 mL无菌注射器连接27 G针头，穿刺右心室壁，从右心室注入3 mL无菌PBS。
    6. 使用Dumont镊子，以4-0丝线将主肺动脉打结。
      注意：主肺动脉和升主动脉可一并套环。
    7. 用弹簧剪在肺动脉瓣下方剪开右心室壁，形成一个2 mm的窗口。
    8. 通过窗口插入肺动脉导管，并固定先前打结的4-0丝线（图1B).
      注意：操作过程中避免触碰肺动脉（PA），以免损伤肺动脉壁。主肺动脉与升主动脉可一并结扎并固定。
    9. 使用5 mL无菌注射器通过肺动脉导管缓慢注入2 mL PBS。注入过程中应确保双肺轻微膨胀。
    10. 用气管导管插管气管，并用4-0丝线缝合固定图1C).
    11. 通过气管导管，使用一支5 mL无菌空注射器缓慢注入2 mL空气，保持10秒。确保肺部无空气泄漏。
    12. 取出心脏和肺 整块用Dumont镊子夹住气管，并在气管插管就位的情况下，切断颈段食管，并将其从椎体上分离。切断双侧锁骨下静脉和动脉。最后，在膈肌水平切断食管和下腔静脉。
      注意：切勿用任何器械接触肺表面。轻微接触也可能导致漏气。
  4. 小鼠肺组织脱细胞（3天操作流程）
    注意：第1.4节中的所有操作均应在洁净的生物安全柜中进行。
    1. 第1天
      1. 将切除的心肺组织块转移至直径10 cm的塑料培养皿中，并在4 °C下用无菌去离子水孵育1小时。
      2. 通过气管导管用5 mL无菌注射器注入2 mL无菌去离子水，重复3次；再通过肺动脉导管注入2 mL无菌水。每次注射后暂停片刻，待液体随肺组织回缩而流出图1C).
        注意：以大约 0.5 mL/s 的速度注射水。
      3. 向气管导管注入 2 mL 0.1% Triton X-100 溶液，同时向肺动脉导管注入 2 mL 该溶液。
      4. 将心肺组织块置于培养皿中，加入Triton X-100溶液，于4 °C静置孵育过夜。
    2. 第2天
      1. 按照步骤1.4.1.2所述，用无菌去离子水从肺组织中去除Triton X-100溶液。
      2. 向气管导管中注入2 mL 2%脱氧胆酸钠溶液，同时向肺动脉导管中注入2 mL该溶液。在4 °C条件下于脱氧胆酸钠溶液中孵育24 h。
    3. 第3天
      1. 按照步骤1.4.1.2所述，用无菌去离子水从肺组织中去除脱氧胆酸钠溶液。
      2. 向气管导管中注入2 mL 1 M NaCl溶液，向肺动脉导管中注入2 mL 1 M NaCl溶液。在室温下用NaCl溶液孵育1小时。
      3. 按照步骤1.4.1.2所述，用无菌去离子水从NaCl溶液中去除。
      4. 向气管导管内注入 2 mL DNAse I 工作液，向肺动脉导管内注入 2 mL DNAse I 工作液。室温下在 DNAse 工作液中孵育 1 小时。
      5. 按照步骤1.4.1.2所述方法，用无菌PBS代替DNase溶液从肺组织中去除。脱细胞处理后，确认肺组织边缘呈白色且透明。
        注意：随着脱细胞过程的进行，肺组织会变得更加脆弱。请始终小心操作心肺组织块，避免触碰肺表面。脱细胞完成后，心肺组织块可在含抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）中于4 °C保存，最长可达3周。

2. 人类原代细胞的培养

  1. 将内皮细胞生长培养基-2（EGM2）与含有胎牛血清（终浓度 2%）、氢化可的松（终浓度 0.2 µg/mL）、人碱性成纤维细胞生长因子（终浓度 4 ng/mL）、血管内皮生长因子（终浓度 2 ng/mL）、R3-胰岛素样生长因子-1（终浓度 5 ng/mL）、抗坏血酸（终浓度 75 µg/mL）、人表皮生长因子（终浓度 10 ng/mL）、庆大霉素/两性霉素-1000（终浓度：庆大霉素 30 µg/mL，两性霉素 15 ng/mL）以及肝素（终浓度 1 ng/mL）的Bullet Kit混合。
  2. 在 37 °C 水浴中解冻冻存管中的 2 × 106 个人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。
  3. 将细胞与 EGM2 混合于 15 mL 圆锥形离心管中，在 500 × g 条件下离心 5 分钟。
  4. 计数细胞，并以适当的细胞密度进行传代培养（推荐密度为 2.0 × 104 个细胞/cm2）。起始使用 6 孔板培养，随后转移至 T75 培养瓶。
  5. 持续传代细胞，直至获得所需数量的细胞。
    注意：若使用 HUVECs 实现肺血管系统的完全覆盖，需要 3 × 107 个 HUVECs19。

3. 生物反应器设置与灌注式器官培养

  1. 器官腔室和细胞储液罐的制备
    1. 使用打孔器在硅胶塞上打孔，如图2A所示。孔的直径分别为5 mm（i、ii和iii）以及7 mm（iv和v）。图2A中的每个孔编号（i-v）对应于图2B中的孔编号。
    2. 按照图2B所示，将泵管穿过硅胶塞。
    3. 使用打孔器在开顶螺口盖的硅胶隔垫上打一个5 mm的孔。将一段L/S 14铂固化管插入该孔中（图2B、C）。
    4. 将上述材料（包括带管路的硅胶塞、玻璃罐体、带管路的GL-45螺口盖、250 mL可高压灭菌玻璃瓶，以及带鲁尔接头的L/S 14管路（图3A中的管路B和管路C））在121 °C条件下高压灭菌20分钟。选择合适的鲁尔接头，确保管路B和C形成回路。
      注：玻璃罐体用作器官腔室，250 mL玻璃瓶用作细胞储液罐。
  2. 基于灌注的生物反应器回路组装
    注：以下操作应在洁净工作台中进行。
    1. 向玻璃罐体中加入70 mL培养基，然后将硅胶塞盖在玻璃罐体上。
    2. 使用三通旋塞，按照图3A所述，组装硅胶塞、玻璃罐体、带管路的GL-45螺口盖、250 mL可高压灭菌玻璃瓶，以及带鲁尔接头的L/S 14管路。将一根20 G针头插入GL-45螺口盖的硅胶隔垫中。
    3. 使用连接至旋塞i）和iii）的10 mL注射器，向管路A、B和C中填充培养基（填充1 m管路约需3–5 mL培养基）。通过三通旋塞反复进行培养基的注入与抽出，确保管路内无气泡。
    4. 通过连接至管路C的鲁尔接头，将去细胞化心肺组织块的肺动脉导管连接。避免导管或管路中产生气泡。
    5. 收获HUVECs，并以0.5–1 × 106 cells/mL的密度重悬于EGM2培养基中。将步骤2.5中获得的细胞悬液加入细胞储液罐。
      注：建议在步骤3.2.4和3.2.5之间制备细胞悬液。在细胞储液罐中放入搅拌子。
  3. 重力驱动的内皮细胞灌注
    1. 将含有HUVECs的细胞储液罐置于磁力搅拌器上。确保细胞储液罐底部高于器官腔室30 cm（图2D和图3A）。
    2. 开启磁力搅拌器，转速约为120 rpm。
    3. 打开旋塞i）和ii），使细胞悬液通过管路A、管路C和肺动脉导管注入去细胞化支架中。
      注：当以1 × 106 cells/mL的密度注入3 × 107个细胞时，细胞悬液体积应为30 mL。典型的灌注速率为1–2 mL/min。
    4. 完成细胞悬液的全部注入后，将管路A从旋塞ii）上拆下。
      注：此步骤可进行细胞计数，以测定去细胞化支架中的细胞滞留率。典型的细胞滞留率为80–90%，与注入细胞数量无关19。
      ​去细胞化肺支架的质量严格决定了细胞滞留率。任何来自去细胞化肺的泄漏（例如主肺动脉或肺表面）都会导致细胞滞留率降低。使用连接至灌注式生物反应器中任一旋塞的无菌注射器注入2–3 mL培养基，确认无明显泄漏，并观察到去细胞化肺在注入培养基时轻微膨胀。
  4. 灌注器官培养
    1. 将器官腔室放入CO2培养箱中。
    2. 将管路B固定在连接脉动泵的泵头上。
    3. 关闭CO2培养箱的玻璃门。确保管路正确穿过玻璃门与橡胶密封圈之间（图3B）。
    4. 在37 °C下孵育去细胞化支架3小时，使注入的内皮细胞在支架中沉降。
      注：确保在步骤3.4.1至3.4.4之间脉动泵始终处于关闭状态。
    5. 以6 rpm的速率启动泵，使用L/S 14管路可实现2 mL/min的培养基灌注。观察去细胞化肺在灌注过程中轻微膨胀。
    6. 关闭培养箱门（图3C）。
    7. 通过旋塞iii）更换培养基。每2或3天更换一半培养基。
      1. 停止泵运转，将50 mL无菌注射器连接至旋塞iii），从腔室中抽出50 mL培养基。
      2. 用50 mL预热的培养基填充另一支50 mL无菌注射器，并通过旋塞iii）将培养基转移至腔室中。正确切换旋塞后，重新启动脉动泵。
    8. 在至少2天的灌注器官培养后，收获再细胞化的心肺组织块。
      注：在本研究中，使用3 × 107个HUVECs进行2天的灌注培养，已足以实现去细胞化肺支架的均匀再血管化。当使用少于3 × 107个HUVECs时，可能需要更长的孵育时间以提高再细胞化效率。

4. 生物工程肺的原位移植

  1. 药物制备
    1. 使用临床级生理盐水配制MMB复合麻醉剂，混合咪达唑仑（终浓度4 mg/kg）、美托咪定（终浓度0.75 mg/kg）和酒石酸布托啡诺（终浓度5 mg/kg）。
    2. 通过将肝素与临床级生理盐水混合，配制终浓度为1000 U/mL的肝素溶液。
    3. 将头孢唑林钠与临床级生理盐水混合配制（单次剂量，30 mg/kg）。
  2. 手术操作步骤
    1. 袖带的制备
      1. 用细砂纸轻轻打磨三种类型的套管针，以利于血管保持袖状结构。
      2. 使用#11手术刀，从20 G聚四氟乙烯（Teflon）套管针上截取一段长度为1 mm的支气管套管。在切割套管针前，用#11手术刀的刀背在套管针上压出凹痕，以便结扎10-0尼龙线。
      3. 使用22 G特氟龙套管制备长度为0.8 mm的肺静脉（PV）套管，使用24 G特氟龙套管制备长度为0.6 mm的肺动脉（PA）套管。
        注意：此步骤可在实验当天之前完成。
    2. 将袖带连接至生物工程肺
      1. 将心肺组织块置于用冷生理盐水浸湿的无菌纱布上，其下垫一块干燥洁净的纱布，并将培养皿放入装有洁净冰块的泡沫盒中。
        注意：放置干燥纱布可防止心肺组织块意外冻结。
      2. 放置动脉瘤夹以固定气管和纱布（图 4A). 将一小块纱布放在心脏上，同时覆盖右肺。在左肺上另放一块纱布。用湿润的纱布调整牵拉，尽可能清晰地暴露左肺门。
      3. 使用直头或弯头显微镊，根据个人偏好小心分离肺门结构（图4B从肺韧带开始，沿迷走神经进行解剖。在肺静脉下方切开脏层胸膜，将降主动脉和迷走神经一同从左侧肺门后方向头侧移动。
      4. 从肺动脉干解剖分离左主肺动脉，直至左肺边缘图4C然后，在肺动脉干水平切开肺动脉，以获得足够的长度。
      5. 从左心房左侧切至左肺边缘处的左肺静脉图 4D在左心房水平离断左侧肺静脉，以获得足够的长度。
      6. 使用稳定夹将PA套管悬置于肺动脉（PA）上方，并将肺动脉插入套管内（​图4E）。将肺动脉（PA）折叠至套管上，暴露内皮表面，用10-0尼龙线在套管周围固定图4F）。以相同方式将套管放置在门静脉（PV）上（图4G，H).
      7. 在隆突水平离断左支气管。以相同方式将套囊放置于支气管上。图 4I).
    3. 受体小鼠操作步骤
      1. 用 MMB 混合物经腹腔注射（27 G 针头）麻醉受体小鼠，并在显微镜下插入 20 G 聚氨酯血管导管进行气管插管。将受体小鼠置于可调节温度的电热垫上，呈右侧卧位，并将血管导管连接至呼吸机。呼吸机参数设置如下： 氧流量 2 L/min，呼吸频率 120 次/分，潮气量 0.5 mL用70%乙醇对胸壁进行消毒，并皮下注射头孢唑林混合液。
      2. 用剪刀切开皮肤。使用电灼器切割皮下组织和肌肉。通过第3肋间切口打开胸腔rd 肋间隙并放置胸腔拉钩。
        注意：尽管开胸切口需足够大以方便植入，但切勿损伤胸廓内动脉，以免引起大出血。
      3. 用棉签和大型弹簧剪解剖肺韧带。将弯形动脉剥离器置于受体左肺，以便轻松牵拉肺组织。使用角形显微镊解剖左肺门周围的纵隔胸膜。
        注意：胸膜解剖的基础与人体肺组织的解剖性肺切除相似。
      4. 使用弯头显微镊从纵隔向左肺边缘仔细分离肺动脉与支气管图 5A以类似方式从肺静脉分离支气管。
        注意：当在先前操作步骤（4.2.3.3）中已解剖胸膜时，解剖可更易进行。
      5. 在肺动脉根部放置一个10-0丝线滑结以阻断（图5B）。在肺静脉（PV）和支气管根部放置一枚细长角度的动脉瘤夹（图5C).
      6. 用10-0尼龙线环绕支气管、肺动脉和肺静脉，暂不打结，留待后续步骤中固定套管。
      7. 使用微弹簧剪在受体左肺边缘处切开肺动脉（PA）、支气管和肺静脉（PV）图5D）。使用直显微镊子轻轻扩张肺动脉（PA）和肺静脉（PV）。用1 mL注射器和24 G套管针，以生理盐水冲洗肺动脉和肺静脉中的血液。
        注意：肺动脉、支气管和肺静脉的切口约为管壁周长的三分之一。直型显微镊子操作轻柔，适用于扩张。
      8. 将覆盖有湿润纱布的生物工程肺置于受体左肺上方（图5E尽可能靠近受体的纵隔。
      9. 将供体肺动脉套管插入受体肺动脉（图5F).
        注意：供体肺动脉会受到一定程度的牵拉。如果肺动脉切口大小合适，供体袖套便不易脱落。将生物工程肺移近纵隔也有助于防止供体袖套移位。
      10. 用10-0尼龙线将袖带固定图 5G）。以类似方式，插入并固定供体支气管（图5H）以及PV套管（图5I，J).
      11. 移除细角度动脉瘤夹（图5L观察到血液逆流超过PV袖带后，移除肺动脉上的丝线结扎，以恢复向前血流至生物工程肺。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

按照脱细胞化方案处理后，小鼠肺组织在外观上呈现白色且半透明（图6A）。组织学观察显示，细胞成分应被完全去除，但肺泡结构仍保持完整（图6B、C）。使用3 × 107个HUVECs并通过为期2天的灌注式生物反应器培养对小鼠肺进行再细胞化后，HUVECs在肺组织中呈均匀分布（图7A）。HUVECs迁移至外周肺泡区域，形成毛细血管网络（图7B）。生物工程肺原位移植并恢复血流灌注后，可在生物工程肺内均匀观察到含有红细胞的血流（图8A、B）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

器官生物工程是一项要求极高的事业。昂贵的筛选过程一直阻碍着该领域研究与开发的周期。通过使用小鼠作为实验平台，与先前使用的大鼠平台相比，显著减少了所需的空间、细胞和培养基用量。尽管目前尚未实现对气体交换、血管阻力或肺顺应性等详细物理参数的测量，但小鼠肺模型能够加快研究进程，因为它支持实验方案的快速迭代，并可用于测试细胞活力、细胞整合能力以及支架相互作用。小鼠繁殖迅速，且拥有大量基因修饰品系可供选择，为在活体条件下研究多种基因和细胞修饰提供了灵活性。这种快速验证假设并优化实验方案的能力，有助于加深我们对成功实现肺组织生物工程所必需的最佳细胞环境和培养技术的理解。通过在小鼠模型中不断完善技术，研究人员可以建立可扩展的方法和流程，进而推广至更大的动物模型，并最终应用于人类。

该操作的关键步骤是肺动脉导管的插入与固定。只有使用带尖端套环的小直径导管（<3 Fr）才能实现肺动脉导管的固定。由于肺组织较为脆弱，手术过程中必须格外谨慎。任何金属器械均不得接触肺表面，否则将导致严重的漏气。必要时可使用棉签轻柔移动肺组织。作者认为，研究人员在使用10至15只小鼠进行训练后，即可熟练掌握插管操作...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者对本文稿无任何利益冲突。

致谢

本研究获得了科学研究费补助金（KAKENHI）(C) #20K09174、#23K08308，促进国际共同研究基金（培育国际共同研究（B））#22KK0132（TS），日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金 21K08877（TW），Leave a Nest 公司池田理香奖（FT），以及 JSPS 研究生奖学金 #21J21515（FT）的资助。我们非常感谢东北大学医学研究科生物医学研究核心的技术人员上田舞子女士在组织学观察方面的大量工作。同时，我们也感谢东北大学综合研究机构（IDAC）研究仪器中心的吉田由美女士和梶浩二先生在图像处理方面提供的技术支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
脱细胞化
27 G x 1/2 英寸 BD PrecisionGlide 针头BD305109或同等规格的 27 G 注射针头
BD Insyte 静脉导管 20 GA X 1.8 8 英寸BD381237或同等规格的 20 G 静脉导管
丝线缝合线（4-0）NescoGA04SB或同等产品
CaCl2Sigma-AldrichC5670
大鼠颈静脉导管，PU 2Fr 10 cmInstechC20PU-MJV1301推荐用于体重 30 g 及以下的小鼠。
大鼠颈静脉导管，PU 3Fr 10 cmInstechC30PU-RJV1307推荐用于体重超过 30 g 的小鼠。
DNase ISigma-AldrichDN25
MgSO4Sigma-AldrichM7506
NaClSigma-AldrichS3014
PinPort 注射器InstechPNP3M
PinPorts，22 GInstechPNP3F22-50适配 C30PU-RJV1307
PinPorts，25 GInstechPNP3F25-50适配 C20PU-MJV1301
脱氧胆酸钠Sigma-AldrichD6750
无菌注射器，5 mL通用
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5
细胞培养
EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKitLonzaCC-3162
HUVEC – 人脐静脉内皮细胞LonzaC2519A
基于灌注的生物反应器
20 G 针头通用
三通旋塞阀通用
打孔器通用打孔尺寸：6–10 mm
EasyLoad III 泵头Cole-Parmer243934
玻璃罐HarioSCN-200T内径：80 mm
加热磁力搅拌器通用
鲁尔接头，PVDF 材质，用于软管Nordson Medical2-9965-01雌性接头，适配内径 1.5 mm 的管路（L/S 14）
鲁尔接头，PVDF 材质，用于软管Nordson Medical2-9964-01雄性接头，适配内径 1.5 mm 的管路（L/S 14）
鲁尔接头，PVDF 材质，用于软管Nordson Medical2-9965-03雌性接头，适配内径 3 mm 的管路（L/S 16）
鲁尔接头，PVDF 材质，用于软管Nordson Medical2-9964-03雄性接头，适配内径 3 mm 的管路（L/S 16）
磁力搅拌子通用
Masterflex L/S 数字精密模块化驱动器，带远程 I/O 和台式控制器Cole-Parmer07557-00
Masterflex L/S 精密泵管，PharMed BPT 材质，L/S 16Cole-Parmer06508-16
Masterflex L/S 精密泵管，铂金固化硅胶材质，L/S 14Cole-Parmer96410-14
Millex-GP 注射式滤器单元，0.22 µm，聚醚砜材质，33 mm，伽马射线灭菌MilliporeSLGPR33RS
Pyrex 250 mL 玻璃瓶，GL-45 螺口盖Corning1395-250
GL45 开口顶 PBT 螺口盖用硅胶垫片Corning1395-455S
硅胶光密封塞IMG07763-18上端直径：87 mm，下端直径：75 mm
无菌注射器，10 mL，50 mL通用
小鼠手术（心脏-肺组织块分离 | 肺移植）
10-0 尼龙结扎线Kono SeisakushoN/A
10-0 丝线结扎线Kono SeisakushoN/A
4-0 丝线结扎线Kono SeisakushoN/A
动脉夹，45 mm 弯型，带槽Natsume SeisakusyoC-17-45
BD Insyte 静脉导管 24GABD381512或同等规格的 24G 静脉导管
Bulldog 血管钳，45 mm 弯型Natsume SeisakusyoM2
酒石酸布托啡诺 Meiji Seika PharmaN/A
头孢唑林钠Otsuka PharmaceuticalN/A
Dumont 镊子 #5/45Fine Science Tools1251-35
精细弹簧剪，Vannas 型Fine Science Tools15403-0845° 尖端，0.01 x 0.06 mm
Gemini 电凝仪套装Harvard ApparatusRS-300
Halsted-Mosquito 止血钳，弯头，125 mmBioresearch Center16181670
Hegar 持针器，150 mmB Braun/AesculapBM065R
肝素溶液Mochida SeiyakuN/A
美托咪定Nippon Zenyaku KogyoN/A
直头微型镊子B Braun/AesculapBD33R
咪达唑仑SandozN/A
小动物呼吸机Harvard ApparatusModel 687™
生理盐水，临床级Otsuka PharmaceuticalN/A
培养皿，60 x 15 mmBD351007
Safelet Cath PU 20 号聚氨酯导管Nipro09-031
Sakaki 不锈钢剪刀，弯型，14 cmBioresearch Center64152034
手术刀柄Bioresearch Center16101040
小型动物牵开系统Fine Science Tools18200-20
备用刀片，手术刀 #11Muranaka Medical Instruments567-001-03
弹簧剪，15 cmBioresearch CenterPRI13-3736
体视显微镜Leica MicrosystemsM525建议使用带柔性臂系统的临床级手术显微镜。
Sugita 钛合金动脉瘤夹，弯型细窄，No.98Mizuho Medical17-001-98
Sugita 钛合金夹施加器，110 mmMizuho Medical17-013-53
可调温电热保温装置通用
超细棉签通用
血管与支气管袖套
细砂纸通用
Venula 20 号特氟龙血管导管Top1160
Venula 22 号特氟龙血管导管Top1161
Venula 24 号特氟龙血管导管Top1124

参考文献

  1. van der Mark, S. C., Hoek, R. A. S., Hellemons, M. E. Developments in lung transplantation over the past decade. Eur Respir Rev. 29 (157), 190132(2020).
  2. Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung. Am J Transplant. 24 (2S1), S394-S456 (2024).
  3. Hoffman, T. W. Waiting list dynamics and lung transplantation outcomes after introduction of the lung allocation score in the Netherlands. Transplant Direct. 7 (10), e760(2021).
  4. Wilk, A. R., Edwards, L. B., Edwards, E. B. The effect of augmenting OPTN data with external death data on calculating patient survival rates after organ transplantation. Transplantation. 101 (4), 836-843 (2017).
  5. Neizer, H., Singh, G. B., Gupta, S., Singh, S. K. Addressing donor-organ shortages using extended criteria in lung transplantation. Ann Cardiothorac Surg. 9 (1), 49-50 (2020).
  6. Oliveira, P., Yamanashi, K., Wang, A., Cypel, M. Establishment of an ex vivo lung perfusion rat model for translational insights in lung transplantation. J Vis Exp. (199), e65981(2023).
  7. Anand, R. P. Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation. Nature. 622 (7982), 393-401 (2023).
  8. Shakir, S., Hackett, T. L., Mostaco-Guidolin, L. B. Bioengineering lungs: An overview of current methods, requirements, and challenges for constructing scaffolds. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1011800(2022).
  9. Ott, H. C. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16 (8), 927-933 (2010).
  10. Petersen, T. H. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
  11. Leiby, K. L. Rational engineering of lung alveolar epithelium. NPJ Regen Med. 8 (1), 22(2023).
  12. Kitano, K., et al. Orthotopic transplantation of human bioartificial lung grafts in a porcine model: A feasibility study. Semin Thorac Cardiovasc Surg. 34 (2), 752-759 (2022).
  13. Ohata, K., Ott, H. C. Human-scale lung regeneration based on decellularized matrix scaffolds as a biologic platform. Surg Today. 50 (7), 633-643 (2020).
  14. Ren, X. Engineering pulmonary vasculature in decellularized rat and human lungs. Nat Biotech. 33 (10), 1097-1102 (2015).
  15. Doi, R. Transplantation of bioengineered rat lungs recellularized with endothelial and adipose-derived stromal cells. Sci Rep. 7 (1), 8447(2017).
  16. Stone, K. C., Mercer, R. R., Gehr, P., Stockstill, B., Crapo, J. D. Allometric relationships of cell numbers and size in the mammalian lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 6 (2), 235-243 (1992).
  17. Basil, M. C., Morrisey, E. E. Lung regeneration: a tale of mice and men. Semin Cell Dev Biol. 100, 88-100 (2020).
  18. Hsia, C. C., Hyde, D. M., Weibel, E. R. Lung structure and the intrinsic challenges of gas exchange. Compr Physiol. 6 (2), 827-895 (2016).
  19. Tomiyama, F., et al. Orthotopic transplantation of the bioengineered lung using a mouse-scale perfusion-based bioreactor and human primary endothelial cells. Sci Rep. 14 (1), 7040(2024).
  20. Stoian, A., Adil, A., Biniazan, F., Haykal, S. Two decades of advances and limitations in organ recellularization. Curr Issues Mol Biol. 46 (8), 9179-9214 (2024).
  21. Crabbe, A. Recellularization of decellularized lung scaffolds is enhanced by dynamic suspension culture. PLoS One. 10 (5), e0126846(2015).
  22. Daly, A. B. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 1-16 (2012).
  23. Regulations for Animal Experiments and Related Activities. , Tohoku University. at https://www.clag.med.tohoku.ac.jp/clar/en/ (2024).
  24. Sokocevic, D., et al. The effect of age and emphysematous and fibrotic injury on the re-cellularization of de-cellularized lungs. Biomaterials. 34 (13), 3256-3269 (2013).
  25. Ren, X., et al. Ex vivo non-invasive assessment of cell viability and proliferation in bio-engineered whole organ constructs. Biomaterials. 52, 103-112 (2015).
  26. Watanabe, T. Mesenchymal stem cells attenuate ischemia-reperfusion injury after prolonged cold ischemia in a mouse model of lung transplantation: a preliminary study. Surg Today. 47 (4), 425-431 (2017).
  27. Watanabe, T., et al. Donor IL-17 receptor A regulates LPS-potentiated acute and chronic murine lung allograft rejection. JCI Insight. 8 (21), e158002(2023).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

肺生物工程器官移植器官灌注培养生物反应器装置心肺组织块再细胞化方案组织学分析毛细血管网络形成
利用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞移植生物工程化肺
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。