利用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞移植生物工程化肺

摘要

本文介绍了利用脱细胞和再细胞化方法构建生物工程小鼠肺脏的技术，同时详细描述了后续的原位肺移植过程。

摘要

肺移植是治疗特发性肺纤维化等终末期肺部疾病患者的关键疗法，但仍面临供体短缺和移植后并发症等挑战。通过将患者特异性细胞整合到脱细胞动物支架中构建的生物工程肺，提供了一种有前景的替代方案。尽管在动物模型中应用生物工程肺已取得进展，其功能和结构仍不够成熟。本方案旨在解决器官生物工程领域的一个关键障碍：缺乏一种经济高效的实验平台。通过采用小鼠模型而非大鼠或猪等较大的动物，研究人员可显著减少每次实验所需的资源，从而加快研究进程。

该方案详细阐述了利用小鼠心肺组织块和人原代细胞进行肺脏生物工程的实验流程，重点包括小鼠心肺组织块的分离策略、脱细胞处理、生物反应器的构建、基于灌注的器官培养以及生物工程化肺脏的原位移植。该适用于小鼠规模的研究平台不仅可降低实验成本，还为优化再细胞化过程中细胞类型与数量的选择、利用组织学和分子生物学方法检测不同细胞类型的效果，以及确保移植后血流灌注的可行性提供了有效框架。该方法具有广泛的应用潜力，可用于研究三维培养条件下的细胞间相互作用、细胞与基质间的相互作用等 离体 癌症建模，从而推动器官生物工程领域的发展。

引言

肺移植已成为治疗终末期肺病患者的决定性疗法¹，例如特发性肺纤维化，此类疾病使用药物治疗无法阻止呼吸功能的恶化。每年有更多符合条件的患者加入等待名单；然而，来自已故供体的器官捐献数量一直未能跟上等待移植患者人数的增长^2,3。即使接受了肺移植，仍存在多种问题会损害移植肺的功能，包括原发性器官功能障碍、异体反应综合征以及感染，这些因素显著降低了肺移植受者的5年生存率⁴。

解决当前器官移植问题的多种方案包括利用边缘供体⁵，供体肺的复苏 离体 肺灌注系统⁶以及利用基因编辑猪进行的异种移植⁷这些替代方案可以扩大供体器官的来源，但均无法完全解决供体器官短缺、免疫原性及功能异质性等问题。

尽管距离现实尚远，但将患者特异性细胞整合到去细胞化动物器官支架中的生物工程人工器官，是实体器官移植的一个极具吸引力的潜在来源⁸。自2010年以来，已有数项开创性研究报道了生物工程肺的潜在应用价值⁹

方案

所有实验均遵循东北大学动物实验及相关活动管理条例（15^th （第X版），由东北大学出版²³本研究已获得东北大学机构动物护理和使用委员会的批准（#2020AcA-041-01）。

1. 脱细胞材料的准备

1. 脱细胞溶液的制备（1 L 可高压灭菌玻璃瓶中的 1,000 mL 规格）
   1. 无菌去离子水：将1,000 mL蒸馏水或去离子水加入1 L可高压灭菌的玻璃瓶中，在121 °C下高压灭菌20 min。
   2. Triton X-100：在1 L可高压灭菌的玻璃瓶中，将1 mL Triton X-100加入1,000 mL无菌去离子水中。（可选）加入10 mL青霉素-链霉素溶液（终浓度为500 units/mL青霉素和500 µg/mL链霉素）。
      注意：请勿进行高压灭菌。
   3. 脱氧胆酸钠：将20 g脱氧胆酸钠粉末加入1 L可高压灭菌玻璃瓶中的1,000 mL无菌去离子水中。盖紧瓶盖并翻转瓶子以溶解粉末。（可选）加入10 mL青霉素-链霉素溶液。
      注意：请勿进行高压灭菌。
   4. 1 M NaCl：将58.44 g NaCl加入1,000 mL去离子水或蒸馏水中，置于1 L可高压灭菌玻璃瓶中。在121 °C条件下高压灭菌20分钟。
   5. DNase....

结果

按照脱细胞化方案处理后，小鼠肺组织在外观上呈现白色且半透明（图6A）。组织学观察显示，细胞成分应被完全去除，但肺泡结构仍保持完整（图6B、C）。使用3 × 10⁷个HUVECs并通过为期2天的灌注式生物反应器培养对小鼠肺进行再细胞化后，HUVECs在肺组织中呈均匀分布（图7A）。HUVECs迁移至外周肺泡区域，形成毛细血管网络（图7B）。生物工程肺原位移植并恢复血流灌注后，可在生物工程肺内均匀观察到含有红细胞的血流（图8A、B）。

讨论

器官生物工程是一项要求极高的事业。昂贵的筛选过程一直阻碍着该领域研究与开发的周期。通过使用小鼠作为实验平台，与先前使用的大鼠平台相比，显著减少了所需的空间、细胞和培养基用量。尽管目前尚未实现对气体交换、血管阻力或肺顺应性等详细物理参数的测量，但小鼠肺模型能够加快研究进程，因为它支持实验方案的快速迭代，并可用于测试细胞活力、细胞整合能力以及支架相互作用。小鼠繁殖迅速，且拥有大量基因修饰品系可供选择，为在活体条件下研究多种基因和细胞修饰提供了灵活性。这种快速验证假设并优化实验方案的能力，有助于加深我们对成功实现肺组织生物工程所必需的最佳细胞环境和培养技术的理解。通过在小鼠模型中不断完善技术，研究人员可以建立可扩展的方法和流程，进而推广至更大的动物模型，并最终应用于人类。

该操作的关键步骤是肺动脉导管的插入与固定。只有使用带尖端套环的小直径导管（<3 Fr）才能实现肺动脉导管的固定。由于肺组织较为脆弱，手术过程中必须格外谨慎。任何金属器械均不得接触肺表面，否则将导致严重的漏气。必要时可使用棉签轻柔移动肺组织。作者认为，研究人员在使用10至15只小鼠进行训练后，即可熟练掌握插管操作.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脱细胞化
27 G x 1/2 英寸 BD PrecisionGlide 针头	BD	305109	或同等规格的 27 G 注射针头
BD Insyte 静脉导管 20 GA X 1.8 8 英寸	BD	381237	或同等规格的 20 G 静脉导管
丝线缝合线（4-0）	Nesco	GA04SB	或同等产品
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
大鼠颈静脉导管，PU 2Fr 10 cm	Instech	C20PU-MJV1301	推荐用于体重 30 g 及以下的小鼠。
大鼠颈静脉导管，PU 3Fr 10 cm	Instech	C30PU-RJV1307	推荐用于体重超过 30 g 的小鼠。
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
PinPort 注射器	Instech	PNP3M
PinPorts，22 G	Instech	PNP3F22-50	适配 C30PU-RJV1307
PinPorts，25 G	Instech	PNP3F25-50	适配 C20PU-MJV1301
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750
无菌注射器，5 mL	通用
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5
细胞培养
EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
HUVEC – 人脐静脉内皮细胞	Lonza	C2519A
基于灌注的生物反应器
20 G 针头	通用
三通旋塞阀	通用
打孔器	通用		打孔尺寸：6–10 mm
EasyLoad III 泵头	Cole-Parmer	243934
玻璃罐	Hario	SCN-200T	内径：80 mm
加热磁力搅拌器	通用
鲁尔接头，PVDF 材质，用于软管	Nordson Medical	2-9965-01	雌性接头，适配内径 1.5 mm 的管路（L/S 14）
鲁尔接头，PVDF 材质，用于软管	Nordson Medical	2-9964-01	雄性接头，适配内径 1.5 mm 的管路（L/S 14）
鲁尔接头，PVDF 材质，用于软管	Nordson Medical	2-9965-03	雌性接头，适配内径 3 mm 的管路（L/S 16）
鲁尔接头，PVDF 材质，用于软管	Nordson Medical	2-9964-03	雄性接头，适配内径 3 mm 的管路（L/S 16）
磁力搅拌子	通用
Masterflex L/S 数字精密模块化驱动器，带远程 I/O 和台式控制器	Cole-Parmer	07557-00
Masterflex L/S 精密泵管，PharMed BPT 材质，L/S 16	Cole-Parmer	06508-16
Masterflex L/S 精密泵管，铂金固化硅胶材质，L/S 14	Cole-Parmer	96410-14
Millex-GP 注射式滤器单元，0.22 µm，聚醚砜材质，33 mm，伽马射线灭菌	Millipore	SLGPR33RS
Pyrex 250 mL 玻璃瓶，GL-45 螺口盖	Corning	1395-250
GL45 开口顶 PBT 螺口盖用硅胶垫片	Corning	1395-455S
硅胶光密封塞	IMG	07763-18	上端直径：87 mm，下端直径：75 mm
无菌注射器，10 mL，50 mL	通用
小鼠手术（心脏-肺组织块分离 | 肺移植）
10-0 尼龙结扎线	Kono Seisakusho	N/A
10-0 丝线结扎线	Kono Seisakusho	N/A
4-0 丝线结扎线	Kono Seisakusho	N/A
动脉夹，45 mm 弯型，带槽	Natsume Seisakusyo	C-17-45
BD Insyte 静脉导管 24GA	BD	381512	或同等规格的 24G 静脉导管
Bulldog 血管钳，45 mm 弯型	Natsume Seisakusyo	M2
酒石酸布托啡诺	Meiji Seika Pharma	N/A
头孢唑林钠	Otsuka Pharmaceutical	N/A
Dumont 镊子 #5/45	Fine Science Tools	1251-35
精细弹簧剪，Vannas 型	Fine Science Tools	15403-08	45° 尖端，0.01 x 0.06 mm
Gemini 电凝仪套装	Harvard Apparatus	RS-300
Halsted-Mosquito 止血钳，弯头，125 mm	Bioresearch Center	16181670
Hegar 持针器，150 mm	B Braun/Aesculap	BM065R
肝素溶液	Mochida Seiyaku	N/A
美托咪定	Nippon Zenyaku Kogyo	N/A
直头微型镊子	B Braun/Aesculap	BD33R
咪达唑仑	Sandoz	N/A
小动物呼吸机	Harvard Apparatus	Model 687™
生理盐水，临床级	Otsuka Pharmaceutical	N/A
培养皿，60 x 15 mm	BD	351007
Safelet Cath PU 20 号聚氨酯导管	Nipro	09-031
Sakaki 不锈钢剪刀，弯型，14 cm	Bioresearch Center	64152034
手术刀柄	Bioresearch Center	16101040
小型动物牵开系统	Fine Science Tools	18200-20
备用刀片，手术刀 #11	Muranaka Medical Instruments	567-001-03
弹簧剪，15 cm	Bioresearch Center	PRI13-3736
体视显微镜	Leica Microsystems	M525	建议使用带柔性臂系统的临床级手术显微镜。
Sugita 钛合金动脉瘤夹，弯型细窄，No.98	Mizuho Medical	17-001-98
Sugita 钛合金夹施加器，110 mm	Mizuho Medical	17-013-53
可调温电热保温装置	通用
超细棉签	通用
血管与支气管袖套
细砂纸	通用
Venula 20 号特氟龙血管导管	Top	1160
Venula 22 号特氟龙血管导管	Top	1161
Venula 24 号特氟龙血管导管	Top	1124