使用脱细胞小鼠肺和原代人内皮细胞移植生物工程肺

摘要

本文介绍了如何使用脱细胞和再细胞化方法创建生物工程小鼠肺。它还详细介绍了随后的原位肺移植。

摘要

肺移植是特发性肺纤维化等终末期肺病患者的关键治疗方法，但供体短缺和移植后并发症等挑战仍然存在。生物工程肺将患者特异性细胞整合到脱细胞的动物支架中，提供了一种很有前途的替代方案。尽管在动物模型中使用生物工程肺取得了进展，但功能和结构仍不成熟。该协议解决了器官生物工程中的一个关键障碍：需要一个具有成本效益的实验平台。通过使用小鼠模型而不是大鼠或猪等大型动物，研究人员可以显著减少每次实验所需的资源，从而加快研究进度。

该方案概述了使用小鼠心肺阻滞和人类原代细胞进行肺生物工程的详细程序，重点是小鼠心肺阻滞、脱细胞、生物反应器设置、基于灌注的器官培养和生物工程肺原位移植的分离策略。这种小鼠规模的平台不仅降低了实验成本，而且还为优化细胞类型和再细胞化数量、使用组织学和分子学方法测试不同的细胞类型以及确保移植后的血流提供了一个可行的框架。该方法具有广泛的应用潜力，包括研究三维培养条件下的细胞相互作用、细胞-基质相互作用和 离体 癌症建模，从而推动器官生物工程领域的发展。

引言

肺移植一直是终末期肺病¹ 患者（如特发性肺纤维化）的决定性治愈方法，在这些患者中，药物治疗无法有效阻止呼吸功能的恶化。每年都有更多的符合条件的患者进入等候名单;然而，已故捐献者的器官捐献数量一直落后于不断增加的等待患者数量 ^2,3。即使在接受肺移植后，相当多的问题也会降低移植肺的功能，包括原发器官功能障碍、反应性同种异体综合征和感染，从而显着降低肺移植受者的 5 年生存率⁴。

有几种选择可以解决当前器官移植中的问题，包括利用边缘供体⁵（marginal donors）、在离体肺灌注系统中恢复供体肺⁶ （ex vivo lung perfusion system）以及使用基因编辑猪的异种移植⁷ （xenotransplantation）。这些替代方案可以扩大供体器官的池子;然而，没有一种方法可以完全解决供体器官的稀缺性、免疫原性和功能异质性。

这与现实相去甚远，但将患者特异性细胞整合到脱细胞动物器官支架中的生物工程人工器官是实体器官移植的一个迷人的潜在来源⁸。自 2010 年以来，已经报道了几项证明生物工程肺潜在用途的开创性研究 ^9,10。在这些研究中，大鼠或猪的肺被去污剂脱细胞，从气管或肺血管系统注射动物或人类细胞，以在基于灌注的生物反应器中再生肺组织，其中一些被原位移植到动物胸腔中^{11、12、13、14、15}.然而，生物工程肺的功能和结构还为时过早，这可能是因为在生物反应器中培养的细胞数量不足或细胞间连接整合较少。

推进器官生物工程研究的一个障碍是缺乏小规模的实验平台。虽然大鼠或猪是该领域常用的动物，但它们每个肺需要 >10⁸ 个肺细胞¹⁶，这对学术实验室来说成本很高。如果小鼠可用于器官生物工程研究，我们可以大大降低每次实验的成本并加快研究计划。尽管小鼠肺和人肺之间存在解剖学差异¹⁷，但哺乳动物肺的基本结构相似¹⁸。因此，小鼠规模的实验结果可以应用于更大的动物，只需根据体型将数字相乘即可。

该协议旨在描述使用小鼠心肺阻滞和人原代细胞进行肺生物工程的详细实验程序¹⁹。我们在这项研究中采用了先前报道和广泛使用的小鼠肺脱细胞方案 20,21,22。肺生物工程的挑战部分是脱细胞毛细血管系统的再细胞化²⁰;因此，本方案将使用人脐带静脉内皮细胞。

方案

所有实验均遵循东北大学出版的东北大学动物实验和相关活动规定（^{第 15 版）23}。这项研究得到了东北大学机构动物护理和使用委员会 （#2020AcA-041-01） 的批准。

1. 脱细胞材料的制备

1. 脱细胞溶液的制备（1,000 mL 规格，1 L 可高温高压灭菌玻璃瓶）
   1. 无菌去离子 （DI） 水：将 1,000 mL 蒸馏水或 DI 水加入 1 L 可高温高压灭菌的玻璃瓶中。在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
   2. Triton X-100：将 1 mL Triton X-100 加入 1,000 mL 无菌去离子水中，装在 1 L 可高压灭菌玻璃瓶中。（可选）加入 10 mL 青霉素和链霉素溶液（终浓度，500 单位/mL 青霉素和 500 μg/mL 链霉素）。
      注意：不要高压灭菌。
   3. 脱氧胆酸钠：将 20 g 脱氧胆酸钠粉末加入 1,000 mL 无菌去离子水中，装在 1 L 可高压灭菌玻璃瓶中。盖上盖子并翻转瓶子以溶解粉末。（可选）加入 10 mL 青霉素和链霉素溶液。
      注意：不要高压灭菌。
   4. 1 M NaCl：在 1 L 可高温高压灭菌玻璃瓶中，将 58.44 g NaCl 加入 1,000 mL 蒸馏水或去离子水中。在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。
   5. DNase I 储备液：在培养基 A 中以 10 mg/mL 浓度稀释。
      1. 培养基 A：制备 5 mM CaCl₂ （在 9 mL 无菌去离子水中加入 5 mg CaCl₂ ）并用无菌去离子水以 1：10 稀释。
   6. DNase I 工作溶液：将 33 μL DNase I 储备液添加到 10 mL 培养基 B 中。
      1. 培养基 B：制备 10x 培养基 B（在 100 mL 无菌去离子水中加入 155 mg MgSO₄ + 220 mg CaCl₂ ）并用无菌去离子水以 1：10 稀释。
2. 准备肺动脉 （PA） 和气管导管（无菌手术）
   1. 将 PA 导管（大鼠颈静脉导管）剪成约 15 毫米的长度。
   2. 将项圈移至导管的末端。
   3. 将导管连接器插入 PA 导管并将其连接到注射器。准备好的 PA 导管如图 1A 所示。
   4. 将 PA 导管储存在 70% 乙醇中直至使用。
   5. 以大约 15 毫米的长度切割 20 G 静脉注射导管。这用于气管导管。
3. 用于采集心肺阻滞的小鼠手术
   1. 用过量的二氧化碳或异氟醚对雄性小鼠 （C57BL/6，体重 > 28 g） 实施安乐死。
   2. 将鼠标仰卧在手术台上并固定四肢。通过在胸部和腹部表面喷洒 70% 乙醇进行消毒。
   3. 用不锈钢剪刀打开到颈部的正中线的腹腔，然后用剪刀劈开胸骨。从胸壁切除隔膜，切开腹侧胸壁以完全暴露胸腔，并切除胸腺。用 4-0 丝连接下腔静脉和右上腔静脉，以防止步骤 1.3.5 中 PBS 反流，从而增强肺血管系统中血液的冲洗。
   4. 用不锈钢剪刀剪断腹主动脉引流。如果腹主动脉无法辨别，则完全切开下腔静脉和腹主动脉。
   5. 通过穿刺右心室壁，用带有 27 G 针头的 5 mL 无菌注射器从右心室注射 3 mL 无菌 PBS。
   6. 使用 Dumont 镊子用 4-0 丝绸环绕主 PA。
      注意：主 PA 和升主动脉可以环在一起。
   7. 用弹簧剪刀剪开右心室壁，在 PA 瓣膜下方打开一个 2 mm 的窗口。
   8. 将 PA 导管插入窗口并固定先前循环的 4-0 丝绸（图 1B）。
      注意： 在此过程中避免触摸 PA，这可能会损坏 PA 壁。主 PA 和升主动脉可以结扎并固定在一起。
   9. 用 5 mL 无菌注射器通过 PA 导管缓慢注入 2 mL PBS。确保在注射 PBS 时双肺略微扩张。
   10. 用气管导管插管气管，并用 4-0 丝缝线系紧（图 1C）。
   11. 用空的 5 mL 无菌注射器通过气管导管缓慢注入 2 mL 空气并保持 10 秒。确保肺部没有空气泄漏。
   12. 整块取出心脏 和肺。用 Dumont 镊子抓住气管，并在里面插上气管导管，切开颈食管，然后从椎骨上解剖。切开双侧锁骨下静脉和动脉。最后，在隔膜水平切开食道和下腔静脉。
       注意： 请勿用任何器械触摸肺表面。任何轻微的触摸都可能导致漏气。
4. 小鼠肺脱细胞（3 天程序）
   注意：第 1.4 节中的所有程序都应在干净的生物安全柜中进行。
   1. 第 1 天
      1. 将切除的心肺块转移到直径为 10 厘米的塑料培养皿中，并将心肺块在无菌去离子水中于 4 °C 孵育 1 小时。
      2. 使用 2 mL 无菌注射器通过 3 次气管导管注入 2 mL 无菌去离子水，通过 PA 导管注入 2 mL 无菌水 5 mL。每次注射后暂停，让液体随着肺的回缩而流出（图 1C）。
         注：以大约 0.5 mL/s 的速度注入水。
      3. 将 2 mL 的 0.1% Triton X-100 溶液注入气管导管中，将 2 mL 注入 PA 导管中。
      4. 将心肺块放入培养皿中，并在 Triton X-100 溶液中于 4 °C 静态孵育过夜。
   2. 第 2 天
      1. 如步骤 1.4.1.2 所述，用无菌去离子水从肺部去除 Triton X-100 溶液。
      2. 将 2 mL 2% 脱氧胆酸钠溶液注入气管导管，将 2 mL 注入 PA 导管。在 4 °C 下在脱氧胆酸盐溶液中孵育 24 小时。
   3. 第 3 天
      1. 如步骤 1.4.1.2 所述，用无菌去离子水从肺部去除脱氧胆酸钠溶液。
      2. 将 2 mL 的 1 M NaCl 溶液注入气管导管中，将 2 mL 注入 PA 导管中。在 RT 下在 NaCl 溶液中孵育 1 小时。
      3. 如步骤 1.4.1.2 所述，用无菌去离子水从 NaCl 溶液中取出。
      4. 将 2 mL DNAse I 工作溶液注入气管导管中，将 2 mL 注入 PA 导管中。在 RT 下在 DNase 工作溶液中孵育 1 小时。
      5. 如步骤 1.4.1.2 中所述，从肺部去除 DNase 溶液，但使用无菌 PBS。确认脱细胞程序后肺的边缘是白色和透明的。
         注意：随着脱细胞过程的进行，肺变得更加脆弱。始终小心处理心肺阻滞，避免接触肺表面。脱细胞后，心肺块可以在 4 °C 的 PBS/抗生素中储存长达 3 周。

2. 人原代细胞的培养

1. 混合内皮细胞生长培养基-2 （EGM2） 和含有胎牛血清（终浓度，2%）、氢化可的松（终浓度，0.2 μg/mL）、人碱性成纤维细胞生长因子（终浓度，4 ng/mL）、血管内皮生长因子 （2 ng/mL）、R3-胰岛素样生长因子-1（终浓度，5 ng/mL）、抗坏血酸（终浓度，75 μg/mL）、人表皮生长因子（终浓度，） 10 ng/mL）、庆大霉素/两性霉素-1000（终浓度，庆大霉素：30 μg/mL，两性霉素：15 ng/mL）和肝素（终浓度，1 ng/mL）。
2. 在 37 °C 的水浴中解冻冷冻小瓶中的 2 ×^{10 6} 人脐带静脉内皮细胞 （HUVEC）。
3. 在 15 mL 锥形管中将细胞与 EGM2 混合，并以 500 × g 离心 5 分钟。
4. 对细胞进行计数，并以适当的细胞密度（推荐 2.0 x 10⁴ 个细胞/cm² ）进行传代培养。从 6 孔板开始，然后转移到 T75 培养瓶中。
5. 传代细胞，直到获得所需数量的细胞。
   注意：要使用 HUVEC 完全覆盖肺血管，需要 3 × 10⁷ 个 HUVEC¹⁹。

3. 生物反应器设置和灌注器官培养

1. 器官室和细胞储液器的制备
   1. 使用软木钻孔器在硅塞上开孔，如图 2A 所示。孔尺寸为 5 mm（i、ii 和 iii）和 7 mm（iv 和 v）。 图 2A 中的每个孔号 （i-v） 对应于 图 2B 中的孔号。
   2. 如图 2B 所示，将泵管插入硅塞。
   3. 使用软木钻孔器在开口螺帽的硅隔膜上切一个 5 毫米的孔。将 L/S 14 铂固化管插入孔中（图 2B、C）。
   4. 将上述材料高压灭菌，包括带管子的硅塞、玻璃罐、带管子的 GL-45 螺帽、250 mL 可高压灭菌玻璃瓶和带诱饵配件的 L/S 14 管（ 图 3A 中的管 B 和管 C）在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟。 选择合适的诱饵配件，以确保管道 B 和 C 形成一个环。
      注：玻璃罐用于器官室，250 mL 玻璃瓶用于细胞储液槽。
2. 基于灌流的生物反应器回路的组装
   注意：应在干净的工作台上执行以下程序。
   1. 向玻璃罐中加入 70 mL 培养基，然后将硅塞放在玻璃罐顶部。
   2. 如图 3A 所述，使用三通旋塞组装一个硅塞、一个玻璃罐、一个带管子的 GL-45 螺帽、一个 250 mL 可高压灭菌的玻璃瓶和一个带有诱饵接头的 L/S 14 管子。将 20 G 针头插入 GL-45 螺帽的硅隔膜中。
   3. 用连接到旋塞阀 i） 和 iii） 的 10 mL 注射器填充管道 A、B 和 C 中的介质（填充 1 m 管道需要 ~3-5 mL 的介质）。使用 10 mL 注射器通过三通旋塞阀重复培养基注射和抽出，以确保管道内没有气泡。
   4. 通过连接到管道 C 的诱饵接头连接脱细胞心肺阻滞的 PA 导管。避免导管或管道中出现气泡。
   5. 在 EGM2 中以 0.5-1 × 10⁶ 个细胞/mL 的密度收获和重悬 HUVEC。将步骤 2.5 中的细胞悬液添加到细胞储液槽中。
      注意：细胞悬液最好在步骤 3.2.4 和 3.2.5 之间制备。在细胞储液槽中放入搅拌棒。
3. 重力驱动注射内皮细胞
   1. 将含有 HUVEC 的细胞储液槽放在磁力搅拌器上。确保细胞储液器的底部高于器官腔 30 cm（图 2D 和 图 3A）。
   2. 以大约 120 rpm 的速度打开磁力搅拌器。
   3. 打开旋塞阀 i） 和 ii），以便可以通过管 A、管 C 和 PA 导管将细胞悬液注射到脱细胞支架中。
      注：当以 1 × 10⁶ 个细胞/mL 的细胞密度注射 3 ×^{10 7} 个细胞时，细胞悬液的体积应为 30 mL。典型的进样速率为 1-2 mL/min。
   4. 完全注射细胞悬液后，从旋塞阀 ii） 上分离管 A。
      注：可以在此步骤中进行细胞计数，以测量脱细胞支架中的细胞保留率。典型的细胞保留率为 80-90%，与注射的细胞数量无关¹⁹。
      脱细胞肺支架的质量严格决定了细胞保留率。脱细胞肺的任何渗漏（例如，从主 PA、肺表面）都会导致较低的细胞滞留率。通过用连接到基于灌注的生物反应器中的一个旋塞阀的无菌注射器注射 2-3 mL 培养基，确保脱细胞肺没有明显的泄漏，并确认脱细胞肺在注射培养基时略微膨胀。
4. 灌注器官培养
   1. 将器官室置于 CO₂ 培养箱中。
   2. 将管道 B 固定到连接到脉动泵的泵头上。
   3. 关闭 CO₂ 培养箱的玻璃门。确保管道正确放置在玻璃门和橡胶密封件之间（图 3B）。
   4. 将脱细胞的支架在 37 °C 下孵育 3 小时，以使注射的内皮细胞在支架中沉淀。
      注意： 确保在步骤 3.4.1 和 3.4.4 之间脉动泵始终处于关闭状态。
   5. 以 6 rpm 的速率启动泵，使用 L/S 14 管路产生 2 mL/min 的培养基灌注。观察脱细胞的肺随着培养基灌注而略微扩张。
   6. 关闭培养箱门（图 3C）。
   7. 通过旋塞阀 iii） 执行介质更换。每 2 或 3 天更换一半的介质。
      1. 停止泵驱动装置，将 50 mL 无菌注射器连接到旋塞阀 iii），然后从腔室中取出 50 mL 培养基。
      2. 在另一个 50 mL 无菌注射器中加入 50 mL 预热的培养基，并通过旋塞阀 iii） 将培养基转移到腔室中。适当切换旋塞阀，然后启动脉动泵。
   8. 在灌注器官培养至少 2 天后收获再细胞化的心肺阻滞。
      注意：在我们的研究中，2 天的灌注培养足以使用 3 × 10⁷ 个 HUVEC 均匀地血运重建脱细胞的肺支架。当使用少于 3 × 10 个⁷ 个 HUVEC 时，可能需要更长的孵育时间以提高再细胞化的效率。

4. 生物工程肺的原位移植

1. 药物制备
   1. 通过将咪达唑仑（终浓度，4 mg/kg）、美托咪定（终浓度，0.75 mg/kg）和酒石酸布托啡诺（终浓度，5 mg/kg）与临床级生理盐水混合来制备 MMB 联合麻醉剂。
   2. 通过将肝素溶液与临床级生理盐水（终浓度，1000 U/mL）混合来制备肝素溶液。
   3. 通过将头孢唑啉钠与临床级生理盐水（一剂，30 mg/kg）混合来制备头孢唑啉钠。
2. 手术
   1. 袖口的准备
      1. 用细砂纸轻轻擦拭三种类型的血管导管，以促进血管保持套囊状态。
      2. 使用 #11 手术刀从 20 G 特氟龙血管导管中准备 1 毫米长的支气管袖带。在切割血管导管之前，使用 #11 手术刀的背面在血管导管上做一个凹痕，以系住 10-0 尼龙。
      3. 准备 22 G 特氟龙血管导管 0.8 mm 的肺静脉 （PV） 袖带和 24 G 0.6 mm 长的特氟龙血管导管的 PA 袖带。
         注意：这种准备可以在实验前完成。
   2. 将袖囊连接到生物工程肺上
      1. 将心肺阻滞放在一块蘸有冷盐水的无菌纱布上，在其下方放置另一块干燥、干净的纱布，然后将培养皿放入装满干净冰块的聚苯乙烯泡沫塑料盒中。
         注意：放置干燥的纱布可防止心肺阻滞意外冻结。
      2. 放置动脉瘤夹以固定气管和纱布（图 4A）。在心脏上放一小块纱布，也覆盖右肺。在左肺上放置另一块纱布。用湿润的纱布调整这种回缩，以尽可能清楚地露出左肺门。
      3. 根据喜好，使用直或倾斜的微型镊子小心地将肺门结构彼此解剖（图 4B）。开始沿着迷走神经从肺韧带解剖。切开 PV 下的脏层胸膜，并将降主动脉和迷走神经一起通过左肺门后部移动到颅侧。
      4. 解剖从肺干到左肺最边缘的左主 PA（图 4C）。然后，在肺干水平划分 PA 以获得足够的长度。
      5. 从左心房的左侧到左肺的最边缘解剖左 PV（图 4D）。在左心房的水平上划分左侧 PV 以获得足够的长度。
      6. 使用稳定夹将 PA 袖带悬挂在 PA 正上方，然后将 PA 插入袖带内（图 4E）。将 PA 折叠在袖带上），露出内皮表面。用 10-0 尼龙扎带固定在袖口周围（图 4F）。以相同的方式将袖带放在 PV 上（图 4G，H）。
      7. 在隆突水平处将左侧支气管分开。以相同的方式将袖带放在支气管上（图 4I）。
   3. 接收鼠标的过程
      1. 用 MMB ip 和 27 G 针头的混合物麻醉受体小鼠，并通过在显微镜下插入 20 G 聚氨酯血管导管进行插管。将受体小鼠放在右侧卧位的可调节温度的电加热器上，并将血管加热器连接到呼吸器。将呼吸机设置设置如下： 氧气 2 L/min，呼吸频率 120 bpm，潮气量 0.5 mL。用 70% 乙醇对胸壁消毒，并皮下注射头孢唑啉混合物。
      2. 用剪刀切开皮肤。用烧灼器切开皮下组织和肌肉。通过^第 3 肋间隙打开胸部并放置胸部牵开器。
         注意：虽然开胸手术需要足够大才能植入，但不要伤害乳内动脉，这可能会导致大量出血。
      3. 用棉签和大弹簧剪刀解剖肺韧带。将弯曲的动脉清洁剂放在受者的左肺上，以便于回缩肺。用倾斜的微型镊子解剖左肺门周围的纵隔胸膜。
         注意：解剖胸膜的基础类似于人类的解剖肺切除术。
      4. 使用从纵隔到左肺最边缘的弯曲微型镊子从支气管中解剖 PA（图 5A）。以类似的方式从 PV 中解剖支气管。
         注意：在前一次作中解剖胸膜时（步骤 4.2.3.3），可以轻松进行解剖。
      5. 在 PA 的底部放置一个 10-0 真丝的活结以封闭（图 5B）。在 PV 和支气管的底部放置一个细长的斜角动脉瘤夹（图 5C）。
      6. 将 10-0 尼龙绕在支气管、PA 和 PV 周围，在以下步骤中松开以固定袖口。
      7. 使用微弹簧剪刀在受者左肺边缘切开受者的 PA、支气管和 PV（图 5D）。使用直的微型镊子轻轻扩张 PA 和 PV。使用 1 mL 注射器和 24 G 血管导管用生理盐水去除 PA 和 PV 中的血液。
         注意：PA、支气管和 PV 的切口大约是三分之一。直的微型镊子很温和，适合扩张。
      8. 将覆盖着湿纱布的生物工程肺放在受体左肺的顶部（图 5E），尽可能靠近受体的纵隔。
      9. 将供体 PA 袖带插入受体 PA（图 5F）。
         注意：供体 PA 会有一些拉伸。如果 PA 切口大小合适，供体的袖带不太可能移位。将生物工程肺靠近纵隔也可以防止供体的袖带移位。
      10. 用 10-0 尼龙扎带固定在袖口周围（图 5G）。以类似的方式，插入并固定供体支气管（图 5H）和 PV 袖带（图 5I、J）。
      11. 取下细角动脉瘤夹（图 5L）。观察血液回流到 PV 袖带之外，并取下 PA 上的丝带，以恢复顺行血流向生物工程肺。

结果

按照脱细胞方案，小鼠肺明显呈白色和半透明（图 6A）。应完全去除细胞成分，但在组织学观察中肺泡结构保持完整（图 6B，C）。使用 3 × 10⁷ 个 HUVEC 和 2 天基于灌注的生物反应器培养的再细胞化小鼠肺显示 HUVEC 的均匀分布（图 7A）。HUVEC 迁移到外周肺泡区域，形成毛细血管网络（图 7B）。在生物工程肺的原位移植和再灌注后，在生物工程肺中均匀观察到含有红细胞的血流（图 8A，B）。

讨论

器官生物工程是一项要求很高的事业。昂贵的筛选过程一直阻碍着该领域的研发周期。通过使用小鼠作为实验平台，与以前使用的大鼠平台相比，空间、细胞和培养基显着减少。尽管尚未实现测量详细的物理参数，例如气体交换、血管阻力或肺顺应性，但小鼠肺模型可以加快研究时间表，因为它能够快速迭代实验方案并测试细胞活力、整合和支架相互作用。小鼠繁殖迅速，并且有多种转基因菌株，为体内研究各种遗传和细胞修饰提供了灵活性。这种快速测试假设和优化方案的能力有助于促进我们对成功肺生物工程所需的最佳细胞环境和培养技术的理解。通过改进小鼠模型中的技术，研究人员可以建立可扩展的方法和方案，这些方法和方案稍后可以转化为更大的动物模型，并最终转化为人类应用。

手术的关键步骤是插入和固定 PA 导管。PA 导管的固定只能通过使用尖端带有套圈的小直径导管 （<3 Fr） 来实现。由于肺部的脆弱性，手术应完全谨慎进行。金属器械不得接触肺表面;否则，肺部将出现严重渗漏。必要时使用棉签作肺部。作者假设研究人员在使用 10-15 只小鼠进行训练后可能会有效地执行插管程序。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脱细胞
27 克 x 1/2 英寸BD PrecisionGlide 针头	BD	305109	或同等产品 27 G 注射针
BD Insyte 静脉注射导管 20 GA X 1.8 8IN	BD	381237	或同等产品 20 G 静脉注射导管
刀片丝缝合线 （4-0）	Nesco	GA04SB	或同等产品
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
大鼠颈静脉导管，PU 2Fr 10 cm	Instech	C20PU-MJV1301	推荐用于体重 30 克及以下的小鼠。
大鼠颈静脉导管，PU 3Fr 10 cm	Instech	C30PU-RJV1307	推荐用于体重超过 30 克的小鼠。
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
PinPort 喷油器	Instech	PNP3M
PinPorts，22 G	Instech	PNP3F22-50	适合 C30PU-RJV1307
PinPorts，25 G	Instech	PNP3F25-50	适合 C20PU-MJV1301
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750
无菌注射器，5 mL	通用
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5
细胞培养
EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
HUVEC –人脐静脉内皮细胞	Lonza	C2519A
灌注生物反应器
20 G 针头	通用
3 通旋塞阀	通用
木蛀虫	通用		镗孔尺寸，6-10 毫米
EasyLoad III 泵头	Cole-Parmer	243934
玻璃罐	Hario	SCN-200T	内径：80 毫米
加热磁力搅拌器	通用
饵接头，PVDF，适用于软管	诺信医疗	2-9965-01	母头，适合内径为 1.5 毫米 （L/S 14） 的管子诱
饵接头，PVDF，适用于软管	诺信医疗	2-9964-01	公头，适合内径为 1.5 毫米 （L/S 14） 的管子诱
饵接头，PVDF，用于软管	诺信医疗	2-9965-03	母头，适合内径为 3 毫米 （L/S 16） 的管子诱
饵接头，PVDF，用于软管诺	信医疗	2-9964-03	公头，适合内径为 3 毫米 （L/S 16） 的管子磁
力搅拌棒	通用
Masterflex L/S 数字精密模块化驱动器，带远程 I/O 和台式控制器	Cole-Parmer	07557-00
Masterflex L/S 精密泵管，PharMed BPT，L/S 16	Cole-Parmer	06508-16
Masterflex L/S Pricision 泵管，铂金固化硅胶，L/S 14	Cole-Parmer	96410-14
Millex-GP 注射器过滤装置，0.22 &m，聚醚砜，33 mm，γ 灭菌	Millipore	SLGPR33RS
Pyrex 250 mL 草瓶，GL-45 螺旋盖	Corning	1395-250
GL45 开顶 PBT 螺旋盖的硅隔垫	Corning	1395-455S
硅胶灯塞	IMG	07763-18	上径：87 mm，下径：75 mm
无菌注射器，10 mL，50 mL	通用
小鼠手术（心肺阻滞的分离 |肺移植）
10-0 尼龙扎带	Kono Seisakusho	N/A
10-0 丝绸扎带	Kono Seisakusho	N/A
4-0 丝扎带	Kono Seisakusho	N/A
动脉夹，45 毫米弯曲，带凹槽	Natsume Seisakusyo	C-17-45
BD Insyte IV 导管 24GA	BD	381512	或等效 24G 静脉输液导管
Bulldog 血管钳 45mm 弯曲	Natsume seisakusyo	M2
酒石酸布托啡诺	治精化制药	N/A
头孢唑啉钠	大冢制药	N/A
杜蒙镊子 #5/45	Fine Science Tools	1251-35
Fine vannas 式弹簧剪	Fine Science Tools	15403-08	45 度尖端，0.01 x 0.06 mm
Gemini 烧灼套件	佛仪器	RS-300
Halsted-Mosquito 夹弯头，125 mm	生物研究中心	16181670
Hegar 持针器，150 mm	B Braun/Aesculap	BM065R
肝素溶液	持田清药	N/A
Medetomidine	Nippon Zenyaku Kogyo	N/A
微型镊子	B Braun/Aesculap	BD33R
咪达唑仑	山德士	N/A
小鼠呼吸机	哈佛	687 型™
生理盐水，临床级	冢制药	N/A
培养皿，60 x 15 毫米	BD	351007
Safelet 导管 PU 20 号聚氨酯导管	Nipro	09-031
榊不锈钢剪刀弯曲 14 厘米	生物研究中心	64152034
手术刀架	生物研究中心	16101040
小动物回缩系统	Fine Science Tools	18200-20
备用刀片手术刀 #11	Muranaka Medical Instruments	567-001-03
弹簧剪刀，15 厘米	生物研究中心	PRI13-3736
立体显微镜	徕卡显微系统	M525	最好是带有柔性臂系统的临床级手术显微镜。
杉田钛动脉瘤夹弧形纤细，No.98	瑞穗医疗	17-001-98
杉田钛夹应用器，110 毫米	穗医疗	17-013-53
温度可调电加热器	通用
细棉签	通用
和支气管袖带
精细砂纸	通用
小静脉 20 号特氟龙血管导管	顶部	1160
小静脉 22 号特氟龙血管导管	顶部	1161
小静脉 24 号特氟龙血管导管	顶部	1124