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方法文章

三维子宫肌层和子宫肌瘤类器官培养及处理技术

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DOI：

10.3791/67568

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2026年4月30日

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, University of Chicago, 2Cancer Biology Department, National Cancer Institute, Cairo University, 3Clinical Pharmacy Department, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 4Department of Medical Sciences, Khalifa University

本文内容

摘要

本方案概述了一种手动操作的技术，用于制备含有胶原蛋白的水凝胶，并将子宫肌层和子宫肌瘤组织来源的干细胞三维类器官培养物包埋其中。

摘要

子宫肌瘤是女性子宫中最常见的良性单克隆妇科肿瘤。为了克服研究这些病理学问题时常用方法所面临的普遍障碍，我们旨在设计一种策略，利用含胶原蛋白的水凝胶作为包埋支架，建立子宫肌层和子宫肌瘤干细胞的三维类器官模型。具体而言，该方法采用含胶原蛋白的水凝胶，并在低吸附V型底96孔板中进行培养。该技术通过将正常子宫肌层和含子宫肌瘤的子宫肌层来源的两种干细胞类型包埋于含胶原蛋白的水凝胶中，并在适宜的干细胞增殖培养基中形成类器官，从而成功实现了三维类器官的发育。这些类器官能够成功分化、增殖并自组织形成复杂的结构，构建出可持续培养的体系。该模型的重要性在于有助于深入理解子宫肌瘤的病理生理机制和病因发生机制，同时也可用于测试预防或治疗子宫肌瘤的新药物。

引言

子宫肌瘤，或称平滑肌瘤，是子宫最常见的良性肿瘤1。在育龄期女性中，有相当一部分人会受到该病影响，研究表明约77%的女性在一生中会经历子宫肌瘤。尽管许多女性患有肌瘤而无症状，但仍有高达25%的患者会出现异常子宫出血、盆腔疼痛或不孕等症状2。肌瘤的发生与生长受多种因素影响，包括性激素、生长因子、遗传改变以及其他生物学机制3。

为了研究发病机制并测试药物疗效， 体外 并已开发出动物模型。在二维培养中，细胞被迫在平坦的表面上生长，导致其形态发生扭曲，并改变其行为，与在三维组织环境中的行为不同。相较于三维培养，二维培养的主要缺点是无法良好地模拟组织内细胞的天然环境，难以准确再现生物体内复杂的细胞-细胞及细胞-基质相互作用，从而在研究细胞行为及对刺激的反应时可能导致结果不准确4此外，UF细胞和肌层细胞在二维培养中会迅速失去对激素的响应能力。5总体而言，不同的动物模型为子宫内膜异位症的病理生理学提供了相关的信息6与动物模型相比，3D类器官具有多项优势：可简化实验操作，兼容实时成像，并能够研究在动物模型中未能充分体现的人类特异性发育与疾病特征7另一方面，使用更为复杂的动物（如灵长类动物）进行实验，除了费用高昂外，在伦理上也极难获得支持83D类器官模型相较于2D细胞培养能更真实地模拟 体内 组织结构，同时相比动物模型更具可控性、高效性和成本效益。因此，开发能够准确模拟细胞自然生长及病变组织复杂性的更有效的替代模型至关重要。

本研究旨在建立一种利用含胶原蛋白的水凝胶通过手动操作进行子宫肌层和子宫肌瘤干细胞三维培养类器官的实验方法，并重点阐述该方法的主要优势与局限性。

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方案

该方案已获得芝加哥大学伦理委员会批准，批准编号为 IRB#20-1414。根据芝加哥大学组织库的记录，已从所有提供组织样本的受试者处获得知情同意。

1. 类器官的三维培养

  1. 按照先前所述方法培养和维持分离纯化的子宫肌层和子宫肌瘤干细胞（SC）9。
  2. 从液氮中取出干细胞，使其自然解冻。培养流程图见图1。
  3. 加入5 mL黏附因子蛋白以制备预包被培养瓶。在37 °C下孵育至少4小时，随后弃去多余的黏附因子蛋白。
  4. 将干细胞接种于预包被的75 cm2培养瓶中，加入10 mL培养基，该培养基由DMEM/F12（Dulbecco改良Eagle培养基与F12混合）组成，并添加12%胎牛血清（FBS）。将培养瓶置于37 °C、含2%氧气浓度的低氧培养箱中孵育，直至细胞融合度达到90%，如图2A所示。
    注意：低氧环境对干细胞生长具有重要作用，可促进干细胞的增殖与存活。
  5. 当细胞达到融合状态时，使用不含钙和镁的HBSS中的0.25%胰蛋白酶-0.1% EDTA溶液消化细胞使其脱离。
    1. 操作时，先移除细胞培养基，用1×PBS洗涤细胞，向一个25 cm²培养瓶中加入1 mL胰蛋白酶溶液，孵育2–3分钟。
    2. 当细胞开始脱落时，加入含血清的培养基以终止胰酶反应。将细胞悬液吸至15 mL离心管中，在室温下以500 x g离心5分钟。
    3. 小心弃去上清液，保留细胞沉淀。
  6. 将细胞沉淀重悬于1 mL无血清干细胞增殖培养基中，通过轻柔吹打分散任何细胞团块。
  7. 使用血细胞计数板进行细胞定量。
    1. 取100 µL细胞悬液与10 µL 0.4%台盼蓝溶液混合。
    2. 短暂涡旋混匀，吸取10 µL台盼蓝-细胞混合液，加入血细胞计数板的计数室中（位于计数室凹槽与盖玻片之间），如图2B所示。
    3. 计数1–4号方格内的细胞，使用以下公式计算细胞浓度：
      细胞数/mL = （所计细胞总数 / 所计方格数）× 稀释倍数 × 10,000
      样品总细胞数 = 细胞数/mL × 样品总体积
  8. 将约10,000个细胞与2 µL含胶原的水凝胶及98 µL无血清干细胞增殖培养基混合，最终每孔体积为100 µL5，用于V型底96孔板。
  9. 将100 µL细胞混合液加入低吸附V型底96孔板的每一孔中，在室温下以100 x g离心5分钟。
  10. 将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育30分钟。
  11. 向每孔中额外加入100 µL不含含胶原水凝胶的无血清干细胞增殖培养基，为类器官生长提供所需营养。
  12. 为补偿培养基蒸发，在发生明显蒸发（罕见情况）时，向每孔补充10–20 µL无血清干细胞增殖培养基。
  13. 培养7天以完成类器官的充分生长，见图2C–H。每周更换两次无血清干细胞增殖培养基（轻柔吸除旧培养基后加入新鲜培养基），可将干细胞来源类器官的培养时间延长至21天。

2. 冷冻切片

  1. 从96孔板中收集细胞至1.5 mL微量离心管中。
  2. 用于冷冻切片时，用磷酸盐缓冲液（PBS；1×）洗涤类器官2次。向类器官中加入500 µL PBS，离心后弃去上清液。
  3. 用500 µL的4%多聚甲醛（PFA）在4 °C固定类器官60分钟，然后再次用1× PBS洗涤。
  4. 将类器官重悬于100 µL的2%甲基蓝溶液中染色20分钟。用1× PBS洗涤后，再将类器官悬浮于500 µL的30%蔗糖溶液中，4 °C过夜进行冷冻保护。
  5. 次日，通过离心去除蔗糖溶液。将类器官包埋于最佳切割温度化合物（OCT）中，并在−80 °C迅速冷冻。
  6. 使用冷冻切片机对包埋在OCT中的类器官进行切片，最佳切片厚度为10 µm，立即将切片转移至载玻片上，每张载玻片放置一片。
  7. 将载玻片保存在4 °C，直至按照以下方法进行免疫荧光染色。
  8. 用100 µL的1× PBS洗涤载玻片3次。然后在室温下加入100 µL含0.1% Triton的PBS（1×）处理15分钟。
  9. 用含5% BSA的1× PBS封闭类器官60分钟，随后加入Sox-2一抗（稀释比1:500）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）一抗（终浓度1 µg/mL），4 °C孵育过夜。
  10. 用100 µL的1× PBS洗涤类器官3次，然后避光孵育Alexa Fluor标记的荧光二抗（稀释比1:1000）1小时。
  11. 用100 µL的1× PBS洗涤2次，随后用含DAPI（1 ng/mL）的抗荧光淬灭封片剂封片。
  12. 使用20倍物镜的荧光显微镜采集图像。参见图3A，并使用生物成像分析软件对图像进行分析。

3. 类器官整体免疫荧光染色

  1. 将类器官从培养基（步骤 1.11）转移至微量离心管中，用 500 µL 的 1× PBS 洗涤 2 次。
  2. 用 500 µL 的 4% 多聚甲醛在室温下固定类器官 60 分钟。弃去多聚甲醛溶液，再用 500 µL 的 PBS 洗涤 3 次。
  3. 用 0.5 mL 封闭缓冲液在 4 °C 下对固定后的类器官进行透化处理，过夜。
  4. 次日，移除封闭缓冲液，加入 300–500 µL 的一抗溶液，包括胶原蛋白 III（COL3A1）（稀释比例 1:500）和芳香烃受体（AHR）（稀释比例 1:1000），在 4 °C 下孵育过夜。
  5. 用 500 µL 的 1× PBS 洗涤类器官 3 次，然后在避光条件下，加入二抗（594 标记的山羊抗兔 IgG 和 488 标记的山羊抗小鼠 IgG），在 4 °C 下孵育过夜。
  6. 用 500 µL 的 1× PBS 洗涤类器官 3 次，随后在室温下用含 5 µg/mL 的 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的 1× PBS 溶液（每样本 300–500 µL）孵育 20 分钟。
  7. 用 500 µL 的 1× PBS 洗涤类器官 3 次，然后在共聚焦显微镜下成像（图 3B）。

4. 类器官解离

  1. 用滤膜除菌的激活溶液重悬100 mg木瓜蛋白酶，配制成250 U/mL的储存浓度，于37 °C孵育30分钟以激活酶活性
    注意：可在2 - 8 °C保存最多2周。
  2. 使用汉克斯平衡盐溶液（HBSS）配制解离溶液（使用前立即配制），其中含30 U/mL木瓜蛋白酶和125 U/mL DNase I。
  3. 将类器官（步骤1.11）转移至24孔板中，并加入500 µL解离溶液。
  4. 将样品置于37 °C、转速为90 rpm的摇床上孵育30–60分钟。
  5. 在室温下间歇吹打5–6次，使用1 mL移液器获得主要由单细胞组成的悬液。
  6. 将细胞悬液加入含有蛋白酶抑制剂溶液（1 mL，10 mg/mL）的15 mL离心管中，以300 × g离心5分钟以沉淀细胞，弃去上清液。
  7. 用适当的缓冲液重悬细胞，所得单细胞悬液如图2I所示。

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结果

早在接种后的第一天，干细胞（SCs）便开始自我聚集，形成类器官，如图所示。我们确定最佳接种密度为10,000个干细胞（SCs），在此密度下，干细胞在特定培养系统中能够稳定形成类器官。该系统采用含胶原蛋白的水凝胶作为包埋干细胞的细胞外基质（ECM）支架，并在超低吸附96孔板中使用干细胞增殖培养基培养7天图2C-G。在此条件下，细胞在第一天即开始自我组织，逐渐发育为类器官结构。在7天的培养过程中，这些结构表现出指数级增长 图2H。此外，还对α-SMA（绿色，上图）和Sox-2（红色，下图）进行了免疫染色9,10。代表性图像显示了干细胞在类器官中分化为不同类型细胞的情况图3A。

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讨论

类器官是类似于微型器官的三维结构，由来自干细胞或组织样本的自组织细胞构成11。源自患者组织的干细胞类器官因其能够精确模拟子宫肌瘤的生理特征和疾病状态，在生物医学研究和临床应用中具有革命性的潜力12。本研究旨在通过建立一种源自正常个体及患有子宫肌瘤患者的人类干细胞的类器官培养系统，来填补这一领域的空白。

使用含胶原蛋白的水凝胶时，关键在于始终将其置于冰上（4 °C）保存，直至与培养基混合。在室温下，它们会迅速固化成凝胶状态，从而无法用于细胞培养应用；此步骤被认为是涉及含胶原蛋白水凝胶的任何实验方案中最关键的一步。

该团队于2022年通过将新培养的UF类器官与先前已建立的UF球状体进行比较，首次报道了UF类器官5，而此前的球状体是利用原代细胞或永生化细胞培养而成13,14。...

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披露

作者声明不存在竞争利益。美国国立卫生研究院提供了艾曼·阿尔亨迪（Ayman Al-Hendy）博士的相关报告。艾曼·阿尔亨迪博士报告了与Myovant Sciences Ltd.和辉瑞公司（Pfizer）的关系，包括咨询或顾问关系。此外，艾曼·阿尔亨迪博士是INOFFA公司的创始人。

致谢

作者谨此感谢芝加哥大学的 Erin Sullivan 和 Julian Romano 在本视频制作过程中提供的帮助。作者谨此感谢 Somayeh Vafaei、Tao Bai、Winston E. Thompson 和 Qiwei Yang 在技术稳定化方面提供的协助。感谢芝加哥大学综合光学显微镜核心设施。本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 RO1 ES028615、RO1 HD094378、U54 MD007602、RO1 HD087417、RO1 HD106285（AAH）以及子宫内膜异位症与子宫疾病学会（SUED）研究基金（MA）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
双光子共聚焦显微镜 Leica , USA
琼脂糖 IVWR Corporation, USA97062-248
Akura 96 球体微孔板 InSpheroCS-09-004-03低吸附V型底板
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG Life Technologies, CA, USA(A11029)(1:1000)
Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG Life Technologies, CA, USA(A11037)(1:1000)
抗-Ahr [RPT] GeneTex , 中国台湾(GTX227700a)(1:1000)
抗α-平滑肌肌动蛋白抗体 Abcam, MA, USA(ab7817)1 µg/mL
抗III型胶原抗体 Abcam, MA, USA(ab7778)(1:500)
抗SOX1抗体 Abcam, MA, USAab242125(1:500)
贴壁因子 Gibco, USAS-006-100
封闭缓冲液 DakoX09095% 马血清 + 0.5% 吐温X-100 溶于1X PBS
冷冻切片机Fisher Scientific, Waltham, MAMicrom HM 550
DAPI (4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)Thermo Scientific, Germany622481 mg/mL
DNase IThermo-Scientific, LithuaniaEN0521
杜尔贝科改良伊格尔培养基 DMEM 和 F12’’ Gibco, USA21041-025
胎牛血清 Omega Scientific ,  Waltham, MANC0471611
Matrigel（含胶原的水凝胶）Corning, Corning, NY356237
MesenCult-ACF Plus 培养基（无血清干细胞增殖培养基 ）Stemcell Technologies, Vancouver, Canada5446
OCT包埋剂（最佳切割温度化合物）Sakura, USA4583
Olympus BX41 显微镜 Olympus America, Center Valley, PA
卵黏蛋白蛋白酶抑制剂溶液 Worthington Biochemical Corporation, USALK003182
木瓜蛋白酶 Worthington Biochemical Corporation, USALK003176活化溶液（1.1 mM EDTA，0.067 mM 巯基乙醇，5.5 mM L-半胱氨酸盐酸盐）
PBS（磷酸盐缓冲液）Gibco, USA70011pH 7.4
4% PFA（多聚甲醛）Invitrogen, USAFB002
QupathBankhead, P. 等. QuPath：用于数字病理图像分析的开源软件。 Scientific Reports (2017)。https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5生物成像分析软件
延时显微镜
组织培养瓶Fisher Scientific, Waltham, MAFB012937
胰蛋白酶 Gibco, USAA12859-010.25% 胰蛋白酶和 0.1% EDTA 溶于不含钙或镁的 HBSS 
含DAPI的VECTASHIELD抗荧光淬灭封片剂Vector Laboratories, CA, USA# UX-93952-241 ng/mL

参考文献

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