三维类器官培养与处理技术用于肌瘤和子宫肌瘤的生成

Summary

该方案概述了一种手工制作含胶蛋白水凝胶的技术，嵌入了从肌组和子宫肌瘤组织中提取的干细胞三维类器官培养物。

Abstract

子宫肌瘤是女性子宫中最常见的良性单克隆妇科肿瘤。为了克服研究这些病理的方法中的常见障碍，我们旨在制定一种策略，利用含胶蛋白水凝胶作为嵌入支架，生成三维肌组和子宫肌瘤干细胞的类器官模型。具体来说，利用了低附着V型底部96孔板中的含胶原水凝胶。该方法通过将正常肌组和子宫肌瘤含肌瘤的子宫肌瘤嵌入胶蛋白水凝胶中，并在合适的干细胞增殖培养基中形成类器官，从而开发出两种干细胞类型的三维类器官。类器官成功地分化、繁殖并自我组织成复杂的结构，形成了一个可持续的系统。该模型的重要性在于理解病理生理和病因机制，同时用于测试预防或治疗子宫肌瘤的新药。

Introduction

子宫肌瘤，或称平滑肌瘤，是子宫最常见的良性肿瘤^1。这些疾病在生育年龄段影响了相当一部分女性，研究显示大约77%的女性在某个阶段经历过。虽然许多女性有肌瘤但无症状，但有相当25%的人会出现异常子宫出血、盆腔疼痛^或不孕等症状。肌瘤的发展和生长受多种因素影响，包括性激素、生长因子、遗传变化及其他生物^机制。

为了研究发病机制和测试药物疗效，已开发出体外和动物模型。二维培养中的细胞被迫在平面上生长，导致其形状变形，行为与三维组织环境中的表现不同。与三维培养相比，二维培养的主要缺点是其无法准确反映组织内的自然细胞环境，无法准确模拟活体中复杂的细胞间和细胞基质相互作用，导致在研究细胞行为和对刺激的反应时可能产生不准确^的结果。此外，UF和肌组细胞在二^维培养中会迅速失去激素反应性5。总体而言，不同的动物模型提供了关于UF病理^{生理的相关}信息。与动物模型相比，三维类器官具有多项优势：简化实验，兼容实时成像，并支持研究^{动物模型中}较少的人类特异性发育和疾病方面 7。另一方面，对更复杂的动....

Protocol

该协议已获得芝加哥大学族裔委员会批准，批准号为IRB#20-1414。根据芝加哥大学组织库的数据，所有采集组织的受试者均获得了知情同意。

类器官的培养1. 3D

1. 培养并^维持前述的分离纯化肌组和UF干细胞（SC），9.
2. 从液氮中获取 SC，并让它们解冻。培养过程的流程图见 图1。
3. 加入5毫升附着因子蛋白，准备预涂瓶。在37°C下孵育至少4小时。 然后丢弃多余的附着因子蛋白。
4. 在预涂75厘米² 瓶中培养SCs，使用10毫升培养基，培养基包括Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）和F12，辅以12%胎牛血清（FBS）。将瓶子置于37°C缺氧培养箱中，氧气浓度为2%，直到达到90%的汇合度，如 图2A所示。
   注意：缺氧在干细胞生长中起重要作用，因为它能促进干细胞的增殖和存活。
5. 达到汇聚点后，使用不含钙和镁的25%胰蛋白酶-0.1% EDTA溶液在HBSS中分离细胞。
   1. 为此，取出细胞培养基。用1倍PBS清洗细胞。向一个25平方厘米的细胞加入1毫升胰蛋白酶，孵育2-3分钟。
   2. 一....

Results

早在播种后第一天，S-C就开始自我聚集，形成如图所示的类器官。我们确定最佳播种密度为10,000个SCs，在特定培养系统中培养时能持续形成类器官。该系统使用含胶原水凝胶作为ECM支架，在超低附着的96孔板（图2C-G）中放置嵌入干细胞和干细胞增殖培养基，持续7天。在此环境中，细胞在第一天自我组织，进化为类器官结构。在7天内，这些结构呈指数增长（见图2H）。此外，对α-SMA（绿色顶部）和Sox-2（红色底部）进行了免疫染色^9,10。代表性图像展示了SCs在类器官中分化为不同细胞类型的过程（见图3A）。

Discussion

类器官是三维结构，形似微型器官，由来自干细胞或组织样本的自组织细胞组成¹¹。患者组织来源的干细胞类器官因其卓越地准确复制UF生理^{和疾病的能力}，有潜力彻底改变生物医学研究和临床应用。本研究试图通过引入一种从正常和UF患者中人类SCs衍生的类器官培养系统来弥合这一差距。

使用含胶原水凝胶的关键是始终将其冰放在冰上（4°C），直到与培养基混合。在室温下，它们会迅速凝固成凝胶，无法用于细胞培养;这被认为是任何涉及含胶蛋白水凝胶的方案中最关键的步骤。

该团队于2022年通过与此前培养的UF球体^13,14进行了比较，引入了首批UF类器官。这些类器官是从干细胞培养的，可以分化成两种不同类型的细胞，而球状体则是从原.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
二光子共焦点 显微镜	徕卡，美国
琼脂糖一世	美国VWR公司	97062-248
Akura 96球状微板及nbsp;	英斯波罗	CS-09-004-03	低附着V型底板
Alexa Fluor 488 山羊抗鼠 IgG	美国加利福尼亚州生命科技公司	（A11029）	(1:1000)
Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG	美国加利福尼亚州生命科技公司	（A11037）	(1:1000)
反阿尔 [RPT]	GeneTex，台湾	（GTX227700a）	(1:1000)
抗α平滑肌肌动蛋白抗体	美国马萨诸塞州阿布卡姆	（AB7817）	1 & micro;克/毫升
抗胶原蛋白III抗体	美国马萨诸塞州阿布卡姆	（AB7778）	(1:500)
抗氧化氧素1抗体及nbsp;	美国马萨诸塞州阿布卡姆	ab242125	(1:500)
依附因子	Gibco，美国	S-006-100
阻塞缓冲区	达科	X0909	5% 马用血清 + 0.5% 特里顿 X-100 在1X 中;PBS
低温箱	费舍尔科学公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆	微米HM 550
DAPI（4′，6-二酰胺-2-苯吲哲）	德国热力科学	62248	1 mg/mL
DNase I	立陶宛热科学公司	EN0521
杜尔贝科改装版鹰中等DMEM和nbsp;F12	Gibco，美国	21041-025
胎儿牛血清	欧米茄科学，nbsp;马萨诸塞州沃尔瑟姆	NC0471611
Matrigel（含胶原水凝胶）	科宁，科宁，纽约州	356237
MesenCult-ACF Plus培养基（无血清干细胞增殖培养基	加拿大温哥华Stemcell Technologies公司	5446
OCT复合材料（最佳切割温度化合物）	美国樱花	4583
奥林巴斯BX41显微镜	奥林巴斯美洲，宾夕法尼亚州中心谷
卵黏质蛋白酶抑制剂溶液及nbsp;	沃辛顿生物化学公司，美国	LK003182
Papain	沃辛顿生物化学公司，美国	LK003176	活化溶液（1.1 mM EDTA，0.067 mM 巰基乙醇，5.5 mM L-半氨酸盐酸）
PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）	Gibco，美国	70011	pH 7.4
PFA（对甲醛） 4%	Invitrogen，美国	FB002
夸帕特	Bankhead， P. 等人  QuPath：开源数字病理图像分析软件。nbsp;科学报告 (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	生物影像分析软件
延时显微镜
组织培养瓶	费舍尔科学公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆	FB012937
胰蛋白酶	Gibco，美国	A12859-01	HBSS中不含钙或镁的0.25%胰蛋白酶和0.1%EDTA及nbsp;
VECTASHIELD防褪入装载介质辅以DAPI	美国加利福尼亚州Vector实验室	# UX-93952-24	1 ng/mL