用于采样犬鼻腔免疫微环境的生理盐水灌洗法

摘要

生理盐水鼻腔灌洗可用于采集犬鼻腔免疫微环境样本。由于该方法相对无创且不会破坏鼻腔组织，可进行多次重复操作。通过鼻腔灌洗技术收集的细胞和蛋白质可进一步用于多种实验室分析。

摘要

评估犬鼻腔局部免疫微环境对于研究正常组织健康状态及疾病状况（特别是与局部炎症相关的疾病）具有重要意义。我们已优化了一种通过连续鼻腔灌洗来评估犬鼻腔局部免疫微环境的技术。简而言之，在犬只接受麻醉并保持胸卧位的情况下，使用柔软的弹性橡胶导管将预热的无菌生理盐水注入患侧鼻孔。灌洗液回流后被收集至锥形管中，并重复该过程多次。将含有脱落细胞和蛋白质的灌洗液合并，随后通过细胞筛网过滤，以去除大块碎片和黏液。样品经离心后，收集细胞沉淀用于分析。样本处理完成后，可进行的后续分析包括流式细胞术、通过批量或单细胞RNA测序对细胞进行转录组分析，和/或对灌洗液中存在的细胞因子进行定量检测。

引言

犬在其一生中经常发生鼻腔炎症性疾病。犬急性或慢性鼻炎的潜在病因范围广泛，包括感染性因素（病毒：如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒；细菌[如支气管败血博德特氏菌、支原体]、真菌[如曲霉菌病、隐球菌病]；寄生虫[如鼻螨]）、肿瘤性因素（如鼻窦恶性肿瘤，最常见为癌或肉瘤组织学类型）、异物因素（如异物、牙齿移位至鼻腔内）以及牙周疾病，此外还包括犬特发性炎症性鼻炎^{1,2,3,4,5,6,7}。

除了体格检查外，还可采用多种方法评估患有鼻腔炎症的犬类鼻窦腔的状况。影像学检查可能包括X线片（牙科、头颅）、计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）。另一种对鼻腔进行成像的方法是鼻内镜检查。组织采样可包括采集鼻拭子、刷取样本或组织活检，进而进行细胞学和/或组织病理学评估，以及送检真菌或细菌培养。这些样本可通过多种方式获取，从"盲采"到在鼻内镜或高级影像引导下采样，途径包括经鼻孔、经鼻咽部，或通过颅骨钻孔术、鼻切开术或鼻窦切开术等外科方法获取。

鼻腔灌洗是一种将无菌生理盐水注入鼻腔的操作，已用于犬鼻腔的采样，以达到诊断和治疗目的。一种用于鼻腔肿瘤的鼻腔灌洗改良技术称为鼻腔水压推进术（nasal hydropulsion），即用力进行鼻腔冲洗，可冲出较大的肿瘤组织样本用于诊断评估，同时有助于缓解与鼻腔肿瘤相关的临床症状，起到治疗作用⁸。

本文介绍了另一种鼻腔灌洗技术，旨在收集和分析鼻腔免疫微环境中的细胞和蛋白质。通过一种温和且相对非侵入性的方法，我们优化了该鼻腔灌洗技术，以实现对鼻腔免疫微环境的连续取样。在涉及鼻腔无炎症、活动性疱疹病毒感染以及鼻窦肿瘤犬只的试验中，我们已证实鼻腔灌洗在样本采集与处理方面的实用性，可用于后续多种分析应用^9,10。

本文描述了一种用于连续采样犬鼻腔免疫微环境的生理盐水鼻腔灌洗技术。我们提供了有效获取鼻腔灌洗样本且对组织损伤最小的操作方案细节，随后介绍了如何对样本进行多种分析的处理步骤。

方案

该鼻腔灌洗操作已获得科罗拉多州立大学机构动物护理和使用委员会及临床评审委员会批准（IACUC #2425）。鼻腔灌洗方法的示意图见图1。

1. 鼻腔灌洗的准备工作

1. 鼻腔灌洗操作前一天，用无菌生理盐水（0.9%氯化钠溶液）填充五支20 mL注射器，并用帽封闭。将注射器置于设定为37 ^oC的培养箱中过夜预热。

2. 鼻腔灌洗时犬的体位摆放

1. 对犬进行手术麻醉（例如，通过静脉留置针静脉注射右美托咪定（1–4 μg/kg）和布托啡诺（0.2–0.5 mg/kg）），随后根据效果滴定静脉注射丙泊酚（2–5 mg/kg）以实施气管插管；使用1–2%吸入性异氟烷根据效果维持麻醉。通过检查眼睑反射和下颌张力确认麻醉深度是否合适。
2. 润滑眼睛，防止手术过程中角膜干燥。
3. 在整个手术过程中持续监测心电遥测、血压、二氧化碳波形图和脉搏血氧饱和度数值。
4. 将麻醉后的犬置于胸卧位。调整犬的头部位置，使其自然舒适地从治疗台边缘向下倾斜，以利于鼻腔灌洗样本的采集。
5. 充起气管插管的气囊，以确保气道密封严密。

3. 进行鼻腔灌洗

1. 将一根8 FR的无菌红色橡胶导管在基部剪断，使其能紧密地安装在装有温热生理盐水的预充式20 mL注射器上。测量一根无菌红色橡胶导管的长度，使导管远端尖端在经鼻孔插入时可延伸至鼻腔约中段位置。若采样目标为鼻腔肿瘤，应通过影像学或鼻内镜引导估算鼻腔肿瘤前端的位置，据此确定红色橡胶导管的长度，使导管尖端可抵达肿瘤的前端部位。
2. 随后，根据已确定的鼻腔内导管长度，在导管尖端处进行剪切，以确保插入鼻腔时尖端可到达目标位置。但需预留额外长度，用于导管基部在鼻孔外的延伸部分（从注射器固定点至鼻孔入口的导管长度，约为3–5 cm）。使用永久性记号笔在导管基部末端做一标记，以指示起始点，对应鼻孔入口位置；该预设的导管长度将在鼻腔内延伸，使导管尖端定位于鼻腔内的目标位置。
3. 鼻腔灌洗操作需由两名人员共同完成。指定一人（人员A）负责将导管送入鼻腔并实施灌洗，另一人（人员B）负责收集从鼻腔流出的样本。
4. 让人员A位于犬头部前方下方位置。戴好手套后，人员A应轻柔地将红色橡胶导管尖端引导至鼻腔内侧，并向前推进，直至导管上的标记与鼻孔外缘对齐。在此过程中，确保导管连接于装有温热无菌生理盐水的注射器。人员B应在鼻孔下方持一个50 mL锥形管，准备收集流出液体。
5. 人员A轻柔地闭合对侧鼻孔，并以缓慢、稳定的压力或脉冲式推注方式开始将生理盐水注入鼻腔。由于犬头部处于向下倾斜的位置，人员B可利用重力作用将从鼻腔流出的液体收集至50 mL锥形管中。
6. 重复此鼻腔灌洗操作，最多进行总共五次20 mL生理盐水灌洗，根据需要更换锥形管，以收集合并样本。操作完成后，记录所收集鼻腔灌洗液的总体积，并与注入的生理盐水量进行对比。
7. 操作完成后， 若此前使用右美托咪定进行麻醉，则应肌内注射与右美托咪定等体积的阿替美唑进行拮抗，并让犬从麻醉中恢复。为安全起见，应使犬保持胸卧位，头部向下倾斜，以促进鼻腔灌洗后残留生理盐水的进一步引流。

4. 鼻腔灌洗样本的处理

1. 轻轻涡旋和/或用移液器吹打锥形管中的鼻腔灌洗样本，以打散碎片和细胞团块。将混合的鼻腔灌洗样本通过70 µm细胞滤筛，去除大块碎片和黏液。在300 × g 条件下离心5–10分钟，形成细胞沉淀。
2. 用移液器吸取上清液，并转移至洁净离心管中，用于目标蛋白的分析。
3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）或适合的溶液重悬细胞沉淀，用于后续细胞检测。
4. 为去除样本中的红细胞，可采用氯化铵-氯化钾（ACK）裂解法，以从鼻腔灌洗液中收集有核细胞^11,12。

结果

采用这种鼻腔灌洗方法时，收集到的样本会略显浑浊，当旋转离心管时，可能可见细胞碎片和黏液颗粒。如果灌洗操作不慎引起出血，导致样本呈现红色，则视为被外周血污染。尽管部分灌入的生理盐水在操作过程中会丢失，但如果灌入的生理盐水未从鼻孔回流至收集管中，则视为灌洗失败；可能的原因包括头部未充分前倾，导致回流不充分，样本经对侧鼻孔向后或侧方引流，或红色橡胶导管与注射器连接不紧密，导致生理盐水从连接处外漏。

当成功采集患有鼻腔癌犬只的鼻腔冲洗样本后，预期有核细胞计数范围为 1 × 10⁶-200 × 10⁶，活细胞比例为 75–96%。相比之下，当成功采集鼻腔健康且无炎症犬只的鼻腔冲洗样本时，细胞计数范围为 7 × 10⁵-2 × 10⁶，活细胞比例为 6–16%。图2展示了从荷瘤犬只鼻腔冲洗样本中获得的细胞学标本的代表性图像。此外，图3展示了对健康犬只和荷瘤犬只鼻腔冲洗样本中细胞群体进行流式...

讨论

鼻腔灌洗操作流程中有多个关键步骤。对于接受鼻腔灌洗的犬只，必须使其处于足够深的麻醉状态，以确保其对导管置入或灌洗液注入无反应。若犬只在麻醉状态下仍出现反应，可能会影响灌洗样本的采集质量与数量，同时可能增加急性鼻腔组织损伤的风险，这种损伤可由鼻腔内导管造成的局部创伤引起，或因犬只误吸灌洗液而导致。

犬只头部的体位对于获取最佳鼻腔灌洗样本也至关重要。如果头部向下的角度不足，无法依靠重力使灌注的生理盐水顺利回流，灌洗液可能向尾侧流动，并通过鼻咽部流失，导致样本丢失。此外，在进行鼻腔灌洗过程中，操作者A与操作者B之间的清晰沟通也非常重要。当操作者A进行冲洗、灌洗液从鼻孔流出时，操作者B可能需要迅速调整收集管的位置；由于在操作过程中，两位操作者均可能难以清晰观察到灌洗液是否顺利流入锥形管，因此整个过程中的主动沟通是成功采集样本的关键。一旦完成鼻腔灌洗样本的收集，若需保持细胞活力以供后续分析，则必须将细胞保存在生理pH溶液中，例如0.9%生理盐水或1×PBS。

在样本采集和处理过程中，可对鼻腔灌洗方案进行调整。在样本采集期间，可调整麻醉深...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL  离心管	Eppendorf	05-402
1000 µL 移液器	VWR	89079-974
1× PBS	Corning	21-040-CV
20 mL 注射器	VWR	BD302830
50 mL 锥形离心管	VWR	89039-656
70 µm 细胞筛	Fisherbrand	22-363-548
8FR 无菌红色橡胶导管	Med Vet International	50-252-2428
ACK 裂解缓冲液	Gibco	A1049201
离心机	Beckman Coulter	366816
生理盐水（0.9%）	Vetivex	17033-492-01
涡旋振荡器	VWR	10153-838