生理盐水鼻腔灌洗可用于采集犬鼻腔免疫微环境样本。由于该方法相对无创且不会破坏鼻腔组织，可进行多次重复操作。通过鼻腔灌洗技术收集的细胞和蛋白质可进一步用于多种实验室分析。
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摘要
摘要
评估犬鼻腔局部免疫微环境对于研究正常组织健康状态及疾病状况（特别是与局部炎症相关的疾病）具有重要意义。我们已优化了一种通过连续鼻腔灌洗来评估犬鼻腔局部免疫微环境的技术。简而言之，在犬只接受麻醉并保持胸卧位的情况下，使用柔软的弹性橡胶导管将预热的无菌生理盐水注入患侧鼻孔。灌洗液回流后被收集至锥形管中，并重复该过程多次。将含有脱落细胞和蛋白质的灌洗液合并，随后通过细胞筛网过滤，以去除大块碎片和黏液。样品经离心后，收集细胞沉淀用于分析。样本处理完成后，可进行的后续分析包括流式细胞术、通过批量或单细胞RNA测序对细胞进行转录组分析，和/或对灌洗液中存在的细胞因子进行定量检测。
引言
犬在其一生中经常发生鼻腔炎症性疾病。犬急性或慢性鼻炎的潜在病因范围广泛，包括感染性因素（病毒：如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒；细菌[如支气管败血博德特氏菌、支原体]、真菌[如曲霉菌病、隐球菌病]；寄生虫[如鼻螨]）、肿瘤性因素（如鼻窦恶性肿瘤，最常见为癌或肉瘤组织学类型）、异物因素（如异物、牙齿移位至鼻腔内）以及牙周疾病，此外还包括犬特发性炎症性鼻炎1,2,3,4,5,6,7。
除了体格检查外，还可采用多种方法评估患有鼻腔炎症的犬类鼻窦腔的状况。影像学检查可能包括X线片（牙科、头颅）、计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）。另一种对鼻腔进行成像的方法是鼻内镜检查。组织采样可包括采集鼻拭子、刷取样本或组织活检，进而进行细胞学和/或组织病理学评估，以及送检真菌或细菌培养。这些样本可通过多种方式获取，从"盲采"到在鼻内镜或高级影像引导下采样，途径包括经鼻孔、经鼻咽部，或通过颅骨钻孔术、鼻切开术或鼻窦....
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方案
该鼻腔灌洗操作已获得科罗拉多州立大学机构动物护理和使用委员会及临床评审委员会批准（IACUC #2425）。鼻腔灌洗方法的示意图见图1。
1. 鼻腔灌洗的准备工作
- 鼻腔灌洗操作前一天，用无菌生理盐水（0.9%氯化钠溶液）填充五支20 mL注射器，并用帽封闭。将注射器置于设定为37 oC的培养箱中过夜预热。
2. 鼻腔灌洗时犬的体位摆放
- 对犬进行手术麻醉（例如，通过静脉留置针静脉注射右美托咪定（1–4 μg/kg）和布托啡诺（0.2–0.5 mg/kg）），随后根据效果滴定静脉注射丙泊酚（2–5 mg/kg）以实施气管插管；使用1–2%吸入性异氟烷根据效果维持麻醉。通过检查眼睑反射和下颌张力确认麻醉深度是否合适。
- 润滑眼睛，防止手术过程中角膜干燥。
- 在整个手术过程中持续监测心电遥测、血压、二氧化碳波形图和脉搏血氧饱和度数值。
- 将麻醉后的犬置于胸卧位。调整犬的头部位置，使其自然舒适地从治疗台边缘向下倾斜，以利于鼻腔灌洗样本的采集。
- 充起气管插管的气囊，以确保气道密封严密。
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结果
采用这种鼻腔灌洗方法时，收集到的样本会略显浑浊，当旋转离心管时，可能可见细胞碎片和黏液颗粒。如果灌洗操作不慎引起出血，导致样本呈现红色，则视为被外周血污染。尽管部分灌入的生理盐水在操作过程中会丢失，但如果灌入的生理盐水未从鼻孔回流至收集管中，则视为灌洗失败；可能的原因包括头部未充分前倾，导致回流不充分，样本经对侧鼻孔向后或侧方引流，或红色橡胶导管与注射器连接不紧密，导致生理盐水从连接处外漏。
当成功采集患有鼻腔癌犬只的鼻腔冲洗样本后，预期有核细胞计数范围为 1 × 106-200 × 106，活细胞比例为 75–96%。相比之下，当成功采集鼻腔健康且无炎症犬只的鼻腔冲洗样本时，细胞计数范围为 7 × 105-2 × 106，活细胞比例为 6–16%。图2展示了从荷瘤犬只鼻腔冲洗样本中获得的细胞学标本的代表性图像。此外，图3展示了对健康犬只和荷瘤犬只鼻腔冲洗样本中细胞群体进行流式.......
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讨论
鼻腔灌洗操作流程中有多个关键步骤。对于接受鼻腔灌洗的犬只，必须使其处于足够深的麻醉状态，以确保其对导管置入或灌洗液注入无反应。若犬只在麻醉状态下仍出现反应，可能会影响灌洗样本的采集质量与数量，同时可能增加急性鼻腔组织损伤的风险，这种损伤可由鼻腔内导管造成的局部创伤引起，或因犬只误吸灌洗液而导致。
犬只头部的体位对于获取最佳鼻腔灌洗样本也至关重要。如果头部向下的角度不足，无法依靠重力使灌注的生理盐水顺利回流，灌洗液可能向尾侧流动，并通过鼻咽部流失，导致样本丢失。此外，在进行鼻腔灌洗过程中，操作者A与操作者B之间的清晰沟通也非常重要。当操作者A进行冲洗、灌洗液从鼻孔流出时，操作者B可能需要迅速调整收集管的位置；由于在操作过程中，两位操作者均可能难以清晰观察到灌洗液是否顺利流入锥形管，因此整个过程中的主动沟通是成功采集样本的关键。一旦完成鼻腔灌洗样本的收集，若需保持细胞活力以供后续分析，则必须将细胞保存在生理pH溶液中，例如0.9%生理盐水或1×PBS。
在样本采集和处理过程中，可对鼻腔灌洗方案进行调整。在样本采集期间，可调整麻醉深.......
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本文所述的犬鼻灌洗技术已通过以下项目的支持进行了优化：K01 OD03109、CCTSI Colorado Pilot Grant Award、CSU CVMBS College Research Council Shared Resources Program 以及 CO HNC SPORE CA261605：职业发展计划。图1 使用 BioRender.com 制作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 离心管 | Eppendorf | 05-402 | |
| 1000 µL 移液器 | VWR | 89079-974 | |
| 1× PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 20 mL 注射器 | VWR | BD302830 | |
| 50 mL 锥形离心管 | VWR | 89039-656 | |
| 70 µm 细胞筛 | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| 8FR 无菌红色橡胶导管 | Med Vet International | 50-252-2428 | |
| ACK 裂解缓冲液 | Gibco | A1049201 | |
| 离心机 | Beckman Coulter | 366816 | |
| 生理盐水（0.9%） | Vetivex | 17033-492-01 | |
| 涡旋振荡器 | VWR | 10153-838 |
参考文献
- Cohn, L. A. Canine nasal disease: An update. Vet Clin: Small Anim Pract. 50 (2), 359-374 (2020).
- Mortier, J., Blackwood, L. Treatment of nasal tumours in dogs: A review. J Small Anim Pract. 61 (7), 404-415 (2020).
- Plickert, H., Tichy, A., Hirt, R.
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重印与许可
