生理盐水鼻腔灌洗可用于采集犬鼻腔免疫微环境样本。由于该方法相对无创且不会破坏鼻腔组织，可进行多次重复操作。通过鼻腔灌洗技术收集的细胞和蛋白质可进一步用于多种实验室分析。
本文内容
摘要
摘要
评估犬鼻腔局部免疫微环境对于研究正常组织健康状态及疾病状况（特别是与局部炎症相关的疾病）具有重要意义。我们已优化了一种通过连续鼻腔灌洗来评估犬鼻腔局部免疫微环境的技术。简而言之，在犬只接受麻醉并保持胸卧位的情况下，使用柔软的弹性橡胶导管将预热的无菌生理盐水注入患侧鼻孔。灌洗液回流后被收集至锥形管中，并重复该过程多次。将含有脱落细胞和蛋白质的灌洗液合并，随后通过细胞筛网过滤，以去除大块碎片和黏液。样品经离心后，收集细胞沉淀用于分析。样本处理完成后，可进行的后续分析包括流式细胞术、通过批量或单细胞RNA测序对细胞进行转录组分析，和/或对灌洗液中存在的细胞因子进行定量检测。
引言
犬在其一生中经常发生鼻腔炎症性疾病。犬急性或慢性鼻炎的潜在病因范围广泛，包括感染性因素（病毒：如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒；细菌[如支气管败血博德特氏菌、支原体]、真菌[如曲霉菌病、隐球菌病]；寄生虫[如鼻螨]）、肿瘤性因素（如鼻窦恶性肿瘤，最常见为癌或肉瘤组织学类型）、异物因素（如异物、牙齿移位至鼻腔内）以及牙周疾病，此外还包括犬特发性炎症性鼻炎1,2,3,4,5,6,7。
除了体格检查外，还可采用多种方法评估患有鼻腔炎症的犬类鼻窦腔的状况。影像学检查可能包括X线片（牙科、头颅）、计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MRI）。另一种对鼻腔进行成像的方法是鼻内镜检查。组织采样可包括采集鼻拭子、刷取样本或组织活检，进而进行细胞学和/或组织病理学评估，以及送检真菌或细菌培养。这些样本可通过多种方式获取，从"盲采"到在鼻内镜或高级影像引导下采样，途径包括经鼻孔、经鼻咽部，或通过颅骨钻孔术、鼻切开术或鼻窦切开术等外科方法获取。
鼻腔灌洗是一种将无菌生理盐水注入鼻腔的操作，已用于犬鼻腔的采样，以达到诊断和治疗目的。一种用于鼻腔肿瘤的鼻腔灌洗改良技术称为鼻腔水压推进术（nasal hydropulsion），即用力进行鼻腔冲洗，可冲出较大的肿瘤组织样本用于诊断评估，同时有助于缓解与鼻腔肿瘤相关的临床症状，起到治疗作用8。
本文介绍了另一种鼻腔灌洗技术，旨在收集和分析鼻腔免疫微环境中的细胞和蛋白质。通过一种温和且相对非侵入性的方法，我们优化了该鼻腔灌洗技术，以实现对鼻腔免疫微环境的连续取样。在涉及鼻腔无炎症、活动性疱疹病毒感染以及鼻窦肿瘤犬只的试验中，我们已证实鼻腔灌洗在样本采集与处理方面的实用性，可用于后续多种分析应用9,10。
本文描述了一种用于连续采样犬鼻腔免疫微环境的生理盐水鼻腔灌洗技术。我们提供了有效获取鼻腔灌洗样本且对组织损伤最小的操作方案细节，随后介绍了如何对样本进行多种分析的处理步骤。
方案
该鼻腔灌洗操作已获得科罗拉多州立大学机构动物护理和使用委员会及临床评审委员会批准（IACUC #2425）。鼻腔灌洗方法的示意图见图1。
1. 鼻腔灌洗的准备工作
- 鼻腔灌洗操作前一天，用无菌生理盐水（0.9%氯化钠溶液）填充五支20 mL注射器，并用帽封闭。将注射器置于设定为37 oC的培养箱中过夜预热。
2. 鼻腔灌洗时犬的体位摆放
- 对犬进行手术麻醉（例如，通过静脉留置针静脉注射右美托咪定（1–4 μg/kg）和布托啡诺（0.2–0.5 mg/kg）），随后根据效果滴定静脉注射丙泊酚（2–5 mg/kg）以实施气管插管；使用1–2%吸入性异氟烷根据效果维持麻醉。通过检查眼睑反射和下颌张力确认麻醉深度是否合适。
- 润滑眼睛，防止手术过程中角膜干燥。
- 在整个手术过程中持续监测心电遥测、血压、二氧化碳波形图和脉搏血氧饱和度数值。
- 将麻醉后的犬置于胸卧位。调整犬的头部位置，使其自然舒适地从治疗台边缘向下倾斜，以利于鼻腔灌洗样本的采集。
- 充起气管插管的气囊，以确保气道密封严密。
3. 进行鼻腔灌洗
- 将一根8 FR的无菌红色橡胶导管在基部剪断，使其能紧密地安装在装有温热生理盐水的预充式20 mL注射器上。测量一根无菌红色橡胶导管的长度，使导管远端尖端在经鼻孔插入时可延伸至鼻腔约中段位置。若采样目标为鼻腔肿瘤，应通过影像学或鼻内镜引导估算鼻腔肿瘤前端的位置，据此确定红色橡胶导管的长度，使导管尖端可抵达肿瘤的前端部位。
- 随后，根据已确定的鼻腔内导管长度，在导管尖端处进行剪切，以确保插入鼻腔时尖端可到达目标位置。但需预留额外长度，用于导管基部在鼻孔外的延伸部分（从注射器固定点至鼻孔入口的导管长度，约为3–5 cm）。使用永久性记号笔在导管基部末端做一标记，以指示起始点，对应鼻孔入口位置；该预设的导管长度将在鼻腔内延伸，使导管尖端定位于鼻腔内的目标位置。
- 鼻腔灌洗操作需由两名人员共同完成。指定一人（人员A）负责将导管送入鼻腔并实施灌洗，另一人（人员B）负责收集从鼻腔流出的样本。
- 让人员A位于犬头部前方下方位置。戴好手套后，人员A应轻柔地将红色橡胶导管尖端引导至鼻腔内侧，并向前推进，直至导管上的标记与鼻孔外缘对齐。在此过程中，确保导管连接于装有温热无菌生理盐水的注射器。人员B应在鼻孔下方持一个50 mL锥形管，准备收集流出液体。
- 人员A轻柔地闭合对侧鼻孔，并以缓慢、稳定的压力或脉冲式推注方式开始将生理盐水注入鼻腔。由于犬头部处于向下倾斜的位置，人员B可利用重力作用将从鼻腔流出的液体收集至50 mL锥形管中。
- 重复此鼻腔灌洗操作，最多进行总共五次20 mL生理盐水灌洗，根据需要更换锥形管，以收集合并样本。操作完成后，记录所收集鼻腔灌洗液的总体积，并与注入的生理盐水量进行对比。
- 操作完成后， 若此前使用右美托咪定进行麻醉，则应肌内注射与右美托咪定等体积的阿替美唑进行拮抗，并让犬从麻醉中恢复。为安全起见，应使犬保持胸卧位，头部向下倾斜，以促进鼻腔灌洗后残留生理盐水的进一步引流。
4. 鼻腔灌洗样本的处理
- 轻轻涡旋和/或用移液器吹打锥形管中的鼻腔灌洗样本，以打散碎片和细胞团块。将混合的鼻腔灌洗样本通过70 µm细胞滤筛，去除大块碎片和黏液。在300 × g 条件下离心5–10分钟，形成细胞沉淀。
- 用移液器吸取上清液，并转移至洁净离心管中，用于目标蛋白的分析。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）或适合的溶液重悬细胞沉淀，用于后续细胞检测。
- 为去除样本中的红细胞，可采用氯化铵-氯化钾（ACK）裂解法，以从鼻腔灌洗液中收集有核细胞11,12。
结果
采用这种鼻腔灌洗方法时，收集到的样本会略显浑浊，当旋转离心管时，可能可见细胞碎片和黏液颗粒。如果灌洗操作不慎引起出血，导致样本呈现红色，则视为被外周血污染。尽管部分灌入的生理盐水在操作过程中会丢失，但如果灌入的生理盐水未从鼻孔回流至收集管中，则视为灌洗失败；可能的原因包括头部未充分前倾，导致回流不充分，样本经对侧鼻孔向后或侧方引流，或红色橡胶导管与注射器连接不紧密，导致生理盐水从连接处外漏。
当成功采集患有鼻腔癌犬只的鼻腔冲洗样本后，预期有核细胞计数范围为 1 × 106-200 × 106，活细胞比例为 75–96%。相比之下，当成功采集鼻腔健康且无炎症犬只的鼻腔冲洗样本时，细胞计数范围为 7 × 105-2 × 106，活细胞比例为 6–16%。图2展示了从荷瘤犬只鼻腔冲洗样本中获得的细胞学标本的代表性图像。此外，图3展示了对健康犬只和荷瘤犬只鼻腔冲洗样本中细胞群体进行流式细胞术分析的结果。若细胞计数和活细胞百分比低于上述范围，则提示鼻腔冲洗操作及样本采集未获成功。Table 1 总结了作者所开展的鼻腔冲洗技术结果，包括操作次数、犬只数量、鼻腔状态（健康或荷瘤）、有核细胞收获量、所获细胞的活力，以及冲洗样本是否被视为可用于后续分析的成功样本。就纳入Table 1的鼻腔冲洗样本所开展的实验而言，细胞收获量至少达到 150,000 被视为鼻腔冲洗样本采集成功。
采用这种鼻腔灌洗技术时，使用无菌0.9%生理盐水来收集细胞。或者，也可考虑使用哈特曼溶液（乳酸林格液）；然而，使用生理盐水或哈特曼溶液收集的样本均需经过测试，以确保目标细胞的存活率和实验结果具有可比性。此外，在无肿瘤的犬只中，可选用弗利导管替代红色橡胶导管进行鼻腔灌洗。虽然本研究所介绍的鼻腔灌洗技术中未使用弗利导管，但其末端带有可充气球囊，能够在插入后膨胀，阻塞鼻腔，防止灌洗液向后流失。同时，尽管在本研究所述的鼻腔灌洗样本处理方法中尚未尝试，也可考虑在鼻腔灌洗样本中加入透明质酸酶，以降解所收集样本中的黏液，释放更多游离细胞用于后续分析。但该方法同样需要优化，以确保透明质酸酶的添加不会改变鼻腔灌洗处理过程的实验结果。
一项针对参与犬类癌症临床试验的犬只成功实施鼻腔灌洗程序后获得的已发表结果 图310. 文中展示的结果 图3 来自一项研究，该研究探讨了选择性淋巴结照射对患有鼻窦肿瘤犬类局部免疫微环境的影响，这些犬的肿瘤接受单独放疗或联合颈部区域淋巴结放疗。通过在临床试验中对犬鼻腔进行系列灌洗取样，并对收集的细胞进行流式细胞术分析，结果显示，当鼻窦肿瘤与区域淋巴结同时接受放疗时，效应T细胞群体在放疗最后一天显著减少，而仅对肿瘤进行放疗并保留区域淋巴结的犬则未出现此现象。这表明利用灌洗法对鼻腔进行系列取样，可用于研究不同时间点及不同治疗条件下细胞群体的变化。
图1：鼻腔灌洗方法示意图。 使用红色橡胶导管将温热的无菌生理盐水注入麻醉犬的鼻腔。鼻腔灌洗液从鼻腔流出后被收集至试管中。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：来自患有鼻腔肿瘤犬的鼻腔灌洗样本的细胞组成。 鼻腔灌洗样本获得的细胞学标本代表性图像（500倍放大，改良瑞氏-吉姆萨染色）。中性粒细胞（箭头）为主要细胞，另可见少量鳞状上皮细胞（箭头所示）和少量成熟的小淋巴细胞（方框内高亮显示）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3．来自健康犬和肿瘤携带犬的鼻腔灌洗样本的流式细胞术分析。 比较健康犬（蓝色，n = 3）与患有鼻窦癌的肿瘤携带犬（红色，n = 4）之间活细胞、免疫细胞和中性粒细胞的丰度。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：参与临床试验的犬鼻腔灌洗液中收集的细胞流式细胞术分析，该试验研究选择性淋巴结照射（ENI）对局部免疫微环境的影响。 对鼻腔灌洗样本中 CD4（CD5+CD4+）和 CD8（CD5+CD8+）T 细胞的定量分析。与仅接受肿瘤靶向放疗的犬（n = 3）相比，在放疗最后一天（第 3 天），同时接受 ENI 和肿瘤照射治疗的犬（n = 3）效应 CD4 和 CD8 T 细胞显著减少。本图改编自 Darragh 等人10。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 健康组 (n=3) | 荷瘤组 (n=19) | |
| 执行的操作次数 | 3 | 80 |
| 细胞计数 | 0.7 × 106 - 2.8 × 106 | 1.6 × 106 - 210 × 106；中位数：8.7 × 106 |
| 细胞活力 | 6.3 - 15.9% | 75% - 96%；中位数：87% |
| 成功率 | 100% | 98.80% |
表1：所执行鼻腔灌洗操作的总结及所获样本的细胞特征。
讨论
鼻腔灌洗操作流程中有多个关键步骤。对于接受鼻腔灌洗的犬只，必须使其处于足够深的麻醉状态，以确保其对导管置入或灌洗液注入无反应。若犬只在麻醉状态下仍出现反应，可能会影响灌洗样本的采集质量与数量，同时可能增加急性鼻腔组织损伤的风险，这种损伤可由鼻腔内导管造成的局部创伤引起，或因犬只误吸灌洗液而导致。
犬只头部的体位对于获取最佳鼻腔灌洗样本也至关重要。如果头部向下的角度不足，无法依靠重力使灌注的生理盐水顺利回流，灌洗液可能向尾侧流动，并通过鼻咽部流失，导致样本丢失。此外，在进行鼻腔灌洗过程中，操作者A与操作者B之间的清晰沟通也非常重要。当操作者A进行冲洗、灌洗液从鼻孔流出时，操作者B可能需要迅速调整收集管的位置；由于在操作过程中，两位操作者均可能难以清晰观察到灌洗液是否顺利流入锥形管，因此整个过程中的主动沟通是成功采集样本的关键。一旦完成鼻腔灌洗样本的收集，若需保持细胞活力以供后续分析，则必须将细胞保存在生理pH溶液中，例如0.9%生理盐水或1×PBS。
在样本采集和处理过程中，可对鼻腔灌洗方案进行调整。在样本采集期间，可调整麻醉深度以确保犬只对鼻腔灌洗无反应。这可以通过调节麻醉气体（如异氟烷）的浓度或静脉推注短效麻醉剂（如丙泊酚）来实现。
如果将生理盐水注入鼻腔后，仅收集到少量液体，应重新调整犬的头部位置，使其呈向下倾斜角度，舒适地置于桌面边缘之外，以增加重力作用，促进液体从鼻腔流出。若观察到液体从对侧鼻孔流出，应在后续灌洗过程中紧密封闭对侧鼻孔。在样本处理阶段，若初始样本的细胞计数较低，可再次离心样本的上清液部分，以收集可能存在的额外细胞，提高总细胞收获量。
利用鼻腔灌洗法分析犬鼻腔免疫微环境存在显著局限性。该技术所获取的鼻腔灌洗样本主要包含来自鼻腔表面、易于脱落的细胞和蛋白质。这些表面细胞和蛋白质可能无法完全代表犬鼻腔微环境深层组织的真实情况。目前已有研究正在开展，旨在比较犬鼻腔灌洗样本与活检样本在细胞组成和蛋白质谱方面的异同，以明确这两种鼻腔取样方法在各项指标上的相似性与差异性。
尽管存在这些局限性，采集犬鼻腔免疫微环境样本的鼻腔灌洗技术仍为现有方法提供了一种替代方案。与组织活检甚至鼻内窥镜检查相比，鼻腔灌洗对犬类患者而言相对无创。通过鼻腔灌洗获取细胞和蛋白质，相较于组织活检，可降低临床上值得关注的、持续时间较长或严重的急性出血风险；此外，与鼻腔组织活检相比，鼻腔灌洗术后局部炎症和不适感也可能更轻。因此，鼻腔灌洗可重复进行，以便在不同时间点采集多个样本用于分析。此外，在后续实验室方法和检测中，相对于组织活检样本，鼻腔灌洗样本在将上清液中的细胞成分与蛋白质分离方面也具有更高的处理便捷性。
鼻腔灌洗方法在与免疫微环境相关的研究领域具有重要的应用潜力。在癌症研究中，鼻腔灌洗技术已被使用10，可用于记录荷瘤犬在不同治疗条件下鼻腔微环境的连续变化；这些鼻腔灌洗样本在关联免疫微环境的变化以更好地理解对癌症治疗的反应方面也可能具有重要价值。对于多种兽医临床及转化性感染性和炎症性研究领域，也可采用该方法探索和研究鼻腔免疫微环境的连续变化。
披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本文所述的犬鼻灌洗技术已通过以下项目的支持进行了优化：K01 OD03109、CCTSI Colorado Pilot Grant Award、CSU CVMBS College Research Council Shared Resources Program 以及 CO HNC SPORE CA261605：职业发展计划。图1 使用 BioRender.com 制作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 离心管 | Eppendorf | 05-402 | |
| 1000 µL 移液器 | VWR | 89079-974 | |
| 1× PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 20 mL 注射器 | VWR | BD302830 | |
| 50 mL 锥形离心管 | VWR | 89039-656 | |
| 70 µm 细胞筛 | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| 8FR 无菌红色橡胶导管 | Med Vet International | 50-252-2428 | |
| ACK 裂解缓冲液 | Gibco | A1049201 | |
| 离心机 | Beckman Coulter | 366816 | |
| 生理盐水（0.9%） | Vetivex | 17033-492-01 | |
| 涡旋振荡器 | VWR | 10153-838 |
参考文献
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