需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

经皮诱导免疫调节的小鼠模型

836 次观看

⸱

DOI：

10.3791/67578

⸱

2025年6月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 2Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该研究揭示了皮肤在通过表皮（EC）免疫调节小鼠免疫反应中的作用。使用蛋白质抗原进行表皮免疫可抑制接触性超敏反应中的免疫应答，或在与病原体相关分子模式联合使用时逆转皮肤诱导的免疫抑制。表皮免疫作为一种有效的无针免疫治疗策略，展现出良好的应用前景。

摘要

皮肤作为人体最大的、与外界环境相接触的器官，具有多种重要的生理功能，包括（1）保护机体免受异物和微生物的侵害，（2）促进体温调节，（3）维持水和电解质平衡，（4）合成维生素D，以及（5）参与免疫反应。本文重点阐述了皮肤在免疫机制中的关键作用，展示了其通过抑制或增强免疫反应而实现免疫调节的能力。先前的研究发现，在小鼠中，通过表皮（EC）途径给予抗原，无论是单独使用还是与病原体相关分子模式（PAMPs）联合使用，可分别抑制或增强免疫反应。具体而言，观察到仅通过表皮途径给予抗原可在多种小鼠自身免疫疾病或变应性接触性皮炎模型中抑制免疫反应。结果表明，将抗原与PAMPs联合进行表皮免疫可作为一种有效策略，用于增强针对病原体的免疫力，或缓解T辅助细胞2型（Th2）依赖性过敏反应。本方案介绍了一种在由Th1细胞介导的人类变应性接触性皮炎（ACD）—接触性超敏反应（CHS）小鼠模型中，通过表皮途径施加抗原来诱导皮肤免疫抑制的方法。然而，该方法也可应用于多种其他小鼠疾病模型。本文将表皮诱导的免疫调节呈现为一种有吸引力的小鼠模型，可用于多种疾病的无针免疫治疗研究。

引言

本文介绍了一种在接触性超敏反应（CHS）小鼠模型中诱导耐受（本文中称为“抑制”）以及逆转该耐受（本文中称为“反向抑制”）的方法。 通过 单独或联合使用病原体识别受体（PRR）配体对皮肤表面施加抗原1在所述方案中，(a) 使用半抗原化的鼠免疫球蛋白（TNP-Ig）作为抗原 以抑制接触性超敏反应或（b）抗原 通过病原体相关分子模式（PAMPs）、Toll样受体（TLR）配体以及核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NOD-like receptors, NLRs）配体，逆转皮肤诱导的免疫抑制2,3,4研究结果表明，EC诱导的免疫调节由抗原非特异性的T抑制细胞（Ts细胞）和抗原特异性的T反抑制细胞（Tcs细胞）介导。这些细胞可通过过继性细胞转移的小鼠模型进行研究，以确定所检测反应的机制。本方案描述了两种细胞转移模型， "过继性转移" 和 "过继性转移"过继性转移技术适用于检测CHS传入相和传出相中的免疫调节作用。另一方面， "过继性转移" 仅反映免疫调节在CHS传出相中的作用。

皮肤诱导抑制方法的描述 通过 在人类变应性接触性皮炎（ACD）的小鼠模型中，通过辅助性T细胞1型（Th1）介导的接触性超敏反应（CHS）进行抗原的表皮应用5然而，该方法也已在T细胞毒性淋巴细胞1型（Tc1）介导的接触性超敏反应实验模型中，对其调节（抑制、耐受）效果进行了验证。6,7，类风湿性关节炎等自身免疫性疾病（如胶原诱导性关节炎，CIA）8,9 实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）10,11，以及溃疡性结肠炎12此外，本方案还描述了皮肤诱导的反向抑制（逆转抑制）方法。 通过 在CHS小鼠模型中，抗原与PRR配体共同应用于表皮接触致敏13,14,15,16结果表明，由EC诱导的抗原非特异性抑制可通过纯化的TLR2、TLR3、TLR4、TLR9和NOD2配体逆转。皮肤诱导的反向抑制方法亦应用于特应性皮炎（AD）动物模型，结果显示，在存在含非甲基化寡脱氧核苷酸（CpG）的合成单链DNA分子（TLR9配体）条件下，使用抗原进行EC处理可特异性抑制Th2介导的免疫反应（使免疫反应向Th1/Th17表型偏移）。17该方法还在肺炎链球菌肺炎中进行了测试，结果表明，以肺炎链球菌多糖-牛血清白蛋白偶联物（PC-BSA）进行表皮免疫，并联合使用CpG，可能增强对病原体的免疫应答 肺炎链球菌18.

EC诱导的免疫调节的一个关键方面是模型的选择以及抗原的性质。文章包含一个表格，详细列出了所使用的抗原、抗原暴露持续时间以及测试模型的T细胞特异性（见Table 1）。所述免疫调节方法主要针对涉及抗原特异性T淋巴细胞的疾病。该方法的有效性通过在过程中使用相容的EC施用抗原来评估。抗原的相容性至关重要，以确保其能有效与疾病过程中涉及的T淋巴细胞相互作用。将蛋白质或肽贴片应用于完整皮肤可促进抗原穿透表皮19,20。这种增强的抗原穿透归因于敷料下出汗增加。表皮通透性的改变发生在贴片应用后4–10小时内，而EC诱导的免疫调节效果可持续长达两周5,14。

尽管表皮划痕法（EC）治疗被广泛应用，但该方法存在多种变异形式，可能引发疑问。目前的研究认为，抗原给予前表皮损伤的程度可能影响所产生免疫应答的性质21。浅表性表皮损伤会触发朗格汉斯细胞释放抗炎性细胞因子，从而促进Th2型免疫应答的启动22。相反，更广泛的表皮损伤则促进促炎性细胞因子的释放，并有助于将抗原递送至真皮树突状细胞23。本方案强调了以下几点：（a）在小型且活跃的动物（尤其是小鼠）中应用该方法时所面临的挑战；（b）需考虑剃毛后皮肤状态、物质与皮肤的充分接触、暴露时间以及表皮划痕治疗期间皮肤的卫生状况等因素，这些均可能决定治疗的有效性。在抗原给予前，必须考虑皮肤脱毛方法（物理性或化学性），因为不同的皮肤预处理方式会对皮肤状态产生不同影响。已知所有这些操作均可能激活皮肤免疫细胞，进而可能导致皮肤感染或影响疾病进程。脱毛后对皮肤状况可能产生的副作用应是选择脱毛方法时的首要考虑因素。研究人员描述了一种通过在剃毛的背部皮肤上进行抗原表皮划痕处理所诱导的T细胞介导的免疫抑制方法，并在多种小鼠免疫应答模型中验证了其效果。抗原通过表皮划痕途径联合病原体相关分子模式（PAMPs）的应用，可诱导产生抗原特异性的T反向抑制细胞。此外，本方案所采用的表皮划痕方法，特别是反复暴露于抗原或PAMPs的情况下，未引起值得关注的不良反应。

本方案强调了采用该方法获得可靠且可重复结果时需考虑的多种因素，尤其是在小动物（如小鼠）中的应用。与皮内或注射式免疫接种技术相比，这种非侵入性方法通常具有较低的不良反应风险（例如疼痛、感染或瘢痕）。表皮免疫接种操作简便，易于在非临床环境中实施，从而提高了可及性和依从性，优于更具侵入性的方法。

表1：不同小鼠疾病模型中经皮免疫诱导对免疫应答的调节作用。 缩写： ACD = 变应性接触性皮炎；AD = 特应性皮炎；Ag = 抗原；CIA = 胶原诱导性关节炎；CHS = 接触性超敏反应；CFA = 完全弗氏佐剂；COLL II = II型胶原；DNFB = 2,4-二硝基氟苯；DNP-BSA = 二硝基苯基-牛血清白蛋白偶联物；EAE = 实验性自身免疫性脑脊髓炎；EC = 经皮；LPS = 脂多糖；OVA = 卵清蛋白；PAMP = 病原体相关分子模式；PC-BSA = 肺炎球菌多糖-牛血清白蛋白偶联物；Th1 = 辅助性T细胞1型；Tc1 = 细胞毒性T细胞1型；TNCB = 2,4,6-三硝基氯苯；TNP-Ig = 2,4,6-三硝基苯基偶联小鼠免疫球蛋白；Ts = 抑制性T细胞；Tcs = 反抑制性T细胞。 请点击此处下载该表格。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本文所述所有实验均经批准，并依照1st 和 2nd 波兰克拉科夫地方动物实验伦理委员会。所有操作均符合当地的推荐规范，特别是关于使用氯胺酮/赛拉嗪或异氟烷作为麻醉剂、使用刀片剃除小鼠皮肤毛发、在剃毛区域及双侧耳部应用物质/半抗原，以及外周免疫器官的采集。实验采用6-12周龄、体重20-25 g的CBA/J（H-2k）雄性和雌性小鼠。所用试剂与设备的详细信息列于 材料表.

1. 动物准备

  1. 将小鼠共同饲养，以避免隔离对它们的行为和健康产生负面影响。为确保统计学显著性，每组使用10至12只动物。

2. 准备操作区域

  1. 在所有操作前后，使用70%乙醇溶液对操作台进行消毒。若使用小鼠需要无菌条件，则应在生物安全柜内进行所有操作。

3. 诱导抑制性细胞（Ts）以抑制Th1介导的接触性超敏反应（CHS）

注意：该操作流程如图1A所示。

  1. 在当天 "0" 采用开放滴加法，用丙二醇配制的30%异氟烷麻醉小鼠。用左手握住小鼠，使其背部朝上暴露。右手取大量清水充分起泡的灰色肥皂，涂抹于皮肤表面。
    1. 使用无菌剃刀片，轻轻剃除约2 cm² 皮肤区域。避免损伤皮肤。任何皮肤病变都将导致小鼠被排除在后续实验之外。
      注意：该灰色肥皂是一种天然且低致敏性产品，由温和的植物基底制成，可有效再生和保湿干燥及敏感皮肤。该肥皂不含任何人造色素、合成香料或动物源成分。成分为棕榈酸钠、棕榈仁酸钠、水（Aqua）、甘油、蒲公英（Taraxacum Officinale）花/叶/茎提取物、棕榈酸、棕榈仁酸、氯化钠、丙二醇、四钠 EDTA、依地酸。该灰色肥皂专为易受刺激及银屑病倾向的敏感和脆弱皮肤设计，能有效清洁问题皮肤，同时防止过度干燥和紧绷感。此外，该肥皂可舒缓皮肤刺激，提供保湿，并促进皮肤更快再生。重要的是，它不会破坏皮肤的保护屏障。
  2. 将小鼠放入笼中。剃毛后，至少等待六小时再施加抗原，以使皮肤干燥并由动物自身完成清洁。
  3. 第0天 "+1"，用无菌的Dulbecco培养基配制1 mg/mL的2,4,6-三硝基苯基偶联小鼠免疫球蛋白（TNP-Ig）抗原溶液′磷酸盐缓冲液（DPBS）。准备抗原的体积为1200 µ十只小鼠使用 L。使用前在 2 mL 小瓶中混合溶液。用铝箔包裹小瓶以避光保护 TNP-Ig。
    注意：应设置仅用溶剂（DPBS）处理的接触性超敏反应（CHS）对照组小鼠，以评估剃毛及在剃毛区域施加溶剂所引起的非特异性炎症反应。为检测抑制性T细胞（Ts）的抗原特异性，应使用不同类型的抗原进行诱导。小鼠免疫球蛋白（Ig）从小鼠血清中制备，并与TNP半抗原偶联。补充文件 1）。在整个实验中，均使用一个取代水平为每 Ig 分子结合 40 个 TNP 的单一制备物（TNP40-Ig）。24,25.
  4. 同一天，使用丙二醇配制的30%异氟烷麻醉小鼠。将抗原置于此前已剃毛的部位，使用1 cm2 浸有100的纱布片 µL 抗原（步骤 3.3 中制备）。用一片薄塑料贴片（2 cm²）并用织物胶带固定。在CHS对照组中，仅使用DPBS。
    注意：30 µ可使用透明塑料文件袋作为塑料贴片。织物胶带应易于移除、具有柔韧性、能贴合身体轮廓，并允许空气和水蒸气透过。
  5. 在当天 "+5," 用30%异氟烷溶于丙二醇中对小鼠进行麻醉。使用圆角安全剪刀小心剪开贴片，然后轻柔移除胶带。让小鼠自由活动，并使其自然清洁皮肤至少4小时。如有必要，可剃除抗原施用部位重新生长的毛发，但通常无需此步骤。
    注意：仅在抗原施用区域（纱布和塑料区域）裁剪胶带，使胶带仅在敷料边缘处紧密粘附。施加抗原前至少等待4小时，以使皮肤干燥并由动物自身完成清洁。
  6. 第0天 "+5," 重复步骤 3.3 和步骤 3.4。
  7. 在当天 "+8," 重复步骤 3.5。至此完成为期一周的皮肤抗原暴露。此后，使用小鼠检测接触性超敏反应（CHS）的抑制情况。体内 主动模型（步骤6）或处死以作为Ts细胞供体的模型 "过继性转移" （步骤 8）或在 "过继性转移" （步骤9）。

4. 诱导针对 Th1 介导的 CHS 反应的反抑制性 T 细胞（Tcs）

注意：该操作流程如图1B所示。

  1. 在第“0”天执行步骤 3.1–3.2。
  2. 在第“+1”天，于 2 mL 小瓶中立即配制含有 100 µg 抗原 TNP-Ig 和 100 µg LPS（PAMP 的示例）的混合物，溶于 100 µL DPBS 中，并在配制后立即使用；若抗原对光敏感，需用铝箔包裹小瓶以避光。
    注意：为评估反向抑制（皮肤诱导的抑制作用的逆转），必须设置抑制对照组（Ts 对照组），即仅用抗原 TNP-Ig 处理小鼠。此外，还需设置仅使用 DPBS（CHS 对照组）或仅使用 LPS（PAMP 对照组）处理的小鼠组，以确定免疫反应非特异性调节的程度。LPS 是一种免疫刺激颗粒的示例26。任何免疫刺激剂的具体特性取决于所使用的鼠模型、参与免疫反应的免疫细胞类型以及待研究物质的药代动力学。
  3. 同一天，使用丙二醇中 30% 的异氟烷对小鼠进行麻醉。将一块 1 cm2 的纱布贴片置于此前已剃毛的皮肤上，纱布需充分浸润步骤 4.2 中制备的 100 µL 混合溶液。用一块薄塑料贴片（2 cm²）覆盖纱布，并使用织物胶带固定。在对照组中，分别施加 DPBS（CHS 对照组）、LPS（PAMP 对照组）或单独的 TNP-Ig（Ts 对照组）。
    注意：可使用 30 µm 透明文件套作为塑料贴片。织物胶带应易于移除、柔韧、能贴合身体轮廓，并允许空气和水蒸气透过。
  4. 在第“+5”天，执行步骤 3.5。
  5. 在第“+5”天，重复步骤 4.2–4.3。
  6. 在第“+8”天，重复执行步骤 3.5。至此完成为期一周的皮肤暴露于抗原与 LPS 混合物的过程。在此之后，可对小鼠进行接触性超敏反应（CHS）检测——即 in vivo 活体模型（步骤 6），或实施安乐死以作为“过继转移 OUT”中 Tcs 细胞的供体（步骤 10）。

5. 诱导效应T细胞（Teff）以介导Th1型CHS反应（CHS的致敏阶段）

  1. 在第“0”天，使用灰色肥皂和水配合剃刀剃除小鼠胸部和腹部的毛发（2 × 2 cm 区域），然后让皮肤静置6小时，待其完全恢复且无刺激反应后，再施加半抗原。
  2. 同一天，在使用前现配半抗原溶液（5%），将2,4,6-三硝基氯苯（TNCB）溶于丙酮-乙醇混合液（比例1:3）中，置于玻璃小瓶内，并用铝箔包裹以避光。
  3. 同一天，通过在之前脱毛的区域涂抹150 µL半抗原溶液对小鼠进行致敏；阴性对照组仅涂抹溶剂（丙酮-乙醇混合液），以评估非特异性炎症反应。在将动物放回笼子前，等待30秒使皮肤干燥。
    注意：操作时须佩戴手套；TNCB 可在大多数人中引发严重过敏反应。

6. 主动模型：Th1介导的接触性超敏反应中Ts或Tcs细胞的检测

注意：本操作步骤如图2所示。

  1. 按照步骤3和步骤4诱导Ts或Tcs细胞。该过程将持续从第“0”天至第“+8”天。
  2. 在第“+8”天，按照步骤5开始诱导Teff细胞。
  3. 四天后，通过进行激发阶段（攻击）来评估接触性超敏反应（CHS）。简言之，将TNCB涂抹于双耳两侧，随后使用千分尺测量耳部厚度以量化耳部肿胀程度。该检测方法及其他可能的终点指标的详细描述见其他文献报道（Zemelka-Wiacek M. 等27）。

7. 从供体小鼠中分离效应T细胞、抑制性T细胞或细胞毒性T细胞

  1. 每次操作前后均用70%乙醇溶液对操作台进行消毒。所有操作均应在生物安全柜内进行，以保持无菌状态，并使用无菌器械。在第“+8”天，分别使用步骤3、4和5中所述的经表皮免疫的小鼠来分离Ts、Tcs和Teff细胞。
    注意：供体与受体的比例应保持1:1。
  2. 通过腹腔注射（i.p.）给予供体小鼠氯胺酮（90-120 mg/kg）和赛拉嗪（5-10 mg/kg）混合物进行麻醉。整个过程中提供保温支持。确保小鼠完全麻醉至少5分钟。
  3. 用70%乙醇对麻醉小鼠的整个腹部区域进行消毒，然后切开腹壁（3-4 cm），暴露腹腔。用无菌镊子将腋窝淋巴结（ALNs）和腹股沟淋巴结以及脾脏（SPL）分离至含有添加1%胎牛血清（FBS）的无菌DPBS的试管中。将所有供体的ALNs汇集于一个离心管中，SPLs汇集于另一离心管中，并将离心管置于冰上。每侧腋窝含有两个腋淋巴结，而单个腹股沟淋巴结位于髋部区域，邻近三条血管。SPLs位于身体左侧，肠道和胃的后方。
    注意：操作过程中需在生物安全柜内使用无菌器械，以维持无菌条件。此操作完成后，必须按照机构批准的方案对小鼠实施安乐死。
    1. 用两片磨砂端的显微镜载玻片轻轻碾压组织。将细胞悬液通过孔径为70 µm的细胞筛过滤。
  4. 用30 mL添加1% FBS的DPBS冲洗细胞。在4 °C下以300 x g离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1-5 mL DPBS中。
  5. 使用血细胞计数板和台盼蓝（Trypan Blue）检测细胞活力。将10 µL细胞悬液与90-990 µL台盼蓝混合，根据细胞浓度调整体积。在计算细胞活力时需计入该稀释倍数。
  6. 制备ALNs和SPLs的混合液（比例1:1）。按照细胞数量要求：每只受体小鼠使用1至5 x 107个Ts或Tcs细胞，溶于1 mL添加1% FBS的DPBS中；每只受体小鼠使用7 x 107个Teff细胞/受体，溶于1 mL DPBS中。所有细胞群体均需保持供体-受体比例为1:1，同时保持供体-DPBS比例为1:1。将装有细胞的离心管置于冰上。
    注意：后续进行体外实验时，需按比例增加细胞供体数量。
    注意：此外，分离得到的Teff、Ts和Tcs细胞还可通过流式细胞术进行进一步纯化或分析，如表型鉴定或细胞因子分泌评估。也可建立细胞培养体系，以探究细胞增殖能力或定量检测培养上清中的细胞因子水平。进行此类进一步实验时，需按比例增加细胞供体数量。

8. 过继性转移 IN：在 Th1 介导的 CHS 中检测 Ts

注意：本操作流程如图3所示。操作过程中需保持无菌，每次操作前后均应使用70%乙醇溶液。确保所有细胞操作均在生物安全柜内进行，以维持无菌环境，并使用灭菌器械。

  1. 按照步骤3和步骤7诱导并分离Ts细胞（供体）。用30 mL DPBS冲洗细胞，在4 °C下以300 × g离心10分钟。弃去上清液，每只受体小鼠用200 µL DPBS重悬细胞沉淀（供体-受体比例为1:1）。
  2. 受体（未经致敏的同系小鼠）：通过腹腔（i.p.）注射氯胺酮（90–120 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg）混合物对受体小鼠进行麻醉。确保小鼠完全麻醉至少5分钟。
  3. 通过静脉（i.v.）注射将200 µL含1–5 × 107个Ts细胞（步骤8.2制备）的混合液注入麻醉后的受体小鼠体内。
  4. 同一天诱导Th1介导的CHS反应。简言之，诱导效应T细胞（致敏阶段），操作见步骤5.1–5.3。四天后，通过执行步骤6.3中描述的激发阶段（攻击）来评估CHS反应。

9. 过继转移 OUT：Th1介导的CHS中调节性T细胞（Ts）的检测

  1. 按照步骤 3、5 和 7 诱导并分离 Ts 和 Teff 细胞（供体），将分离得到的 Ts 和 Teff 细胞分别保存在两个不同的离心管中。将 Teff 细胞分成两份，分别用于“Ts 测试组”和“CHS 对照组”。
    注意：操作过程中需保持无菌，每次操作前后均应使用 70% 乙醇溶液。所有细胞操作均应在生物安全柜内进行，以维持无菌环境，并使用灭菌器械。设立一个仅接受 Teff 细胞的受体对照组（“CHS 对照组”）。为此，应额外使用供体动物，以维持 1:1 的供体-受体比例。为提高实验结果质量，建议增加一组受体动物，其接受来自经溶剂溶液 EC 处理供体的对照细胞。是否增加额外的受体与供体组别需谨慎规划，因为该方法需要使用大量小鼠，不符合“3R 原则”（减少、优化、替代）。
  2. 将 Ts 细胞加入“Ts 测试组”的 Teff 细胞中；向“CHS 对照组”离心管中的 Teff 细胞加入适量 DPBS。
    注意：每只受体动物所用 Ts 细胞数量为 1–5 × 107，Teff 细胞数量为 7 × 107。
  3. 轻轻混匀所有离心管，置于 37 °C 水浴中孵育 30 分钟，每隔 5 分钟轻柔混匀一次。
  4. 用含 1% FBS 的 30 mL DPBS 冲洗每管细胞，于 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于每只受体 200 µL 的 DPBS 中。
  5. 将每种细胞悬液通过 70 µm 孔径的细胞筛过滤。如有必要，可调整每只受体 200 µL DPBS 的体积。
  6. 受体动物（未经免疫的同系小鼠）：通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮（90–120 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg）混合物进行麻醉，确保小鼠至少持续麻醉 5 分钟。
  7. 静脉注射（i.v.）给予制备好的细胞悬液。
  8. 于同一天进行第 6.3 步所述的 CHS 诱导阶段（激发），并设立“阴性对照组”，即仅进行 CHS 激发处理。

10. 过继转移 OUT：Th1介导的接触性超敏反应中Tcs的检测

  1. 按照步骤 3-5 和步骤 7 诱导并分离 Ts、Tcs 和 Teff 细胞（供体）。
    注意：操作全程需保持无菌，每次操作前后均使用 70% 乙醇溶液处理。确保所有细胞操作均在生物安全柜内进行以维持无菌状态，并使用灭菌器械。设置两个受体对照组：“CHS 对照”组仅给予 Teff 细胞，“Ts 对照”组将 Teff 细胞仅与 Ts 细胞共孵育。为这些组别额外使用供体动物，以遵循 1:1 的供体-受体比例。
  2. 将分离的 Ts 和 Tcs 细胞分别保存在不同的小瓶中。将 Teff 细胞分为三份，分别用于“Tcs 实验组”、“Ts 对照组”和“CHS 对照组”。
  3. 第一次孵育：(a) “Tcs 实验组”中，将 Tcs 细胞加入 Teff 细胞中；(b) “Ts 对照组”和 (c) “CHS 对照组”中，向 Teff 细胞中加入适量 DPBS（见表 2）。
    注意：每只受体动物所用 Tcs 细胞数量保持在 1–5 × 107，Teff 细胞数量为 7 × 107。
  4. 轻轻混匀所有小瓶中的细胞悬液，在 37 °C 水浴中孵育 30 分钟，每隔 5 分钟轻柔混匀一次。
  5. 用含 1% FBS 的 30 mL DPBS 冲洗每瓶细胞，于 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于每只受体动物 1 mL 含 1% FBS 的 DPBS 中。保持细胞混合物与 DPBS 的比例为 1:1。
  6. 第二次孵育：(a) “Tcs 实验组”中，将 Ts 细胞加入预先孵育的 Teff 与 Tcs 细胞混合物中；(b) “Ts 对照组”中，将 Ts 细胞加入预先孵育的 Teff 细胞与 DPBS 混合物中；(c) “CHS 对照组”中，向预先孵育的 Teff 细胞中加入适量 DPBS。
    注意：每只受体动物所用 Ts 细胞数量保持在 1–5 × 107。对所有实验组（a、b 和 c）同时进行孵育，以确保在洗涤和离心过程中细胞损失情况一致。
  7. 轻轻混匀所有小瓶中的细胞悬液，在 37 °C 水浴中孵育 30 分钟，每隔 5 分钟轻柔混匀一次。
  8. 用 30 mL DPBS 冲洗每瓶细胞，于 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于每只受体动物 200 µL DPBS 中。
  9. 将每份细胞悬液通过 70 µm 孔径的细胞筛。如有需要，可调整每只受体动物 200 µL DPBS 的体积。
  10. 受体动物（未经致敏的同系小鼠）：通过腹腔（i.p.）注射氯胺酮（90–120 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg）混合物对受体动物进行麻醉，确保小鼠完全麻醉状态持续至少 5 分钟。
  11. 通过静脉（i.v.）注射给予制备好的细胞。
  12. 同一天内，诱导 CHS 的激发阶段（攻击），具体操作见步骤 6.3。设置“阴性对照”组，仅进行 CHS 攻击操作。

表2：Tcs“转移出”过程中细胞孵育的时间安排。 请点击此处下载该表格。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本研究检验了所施加的抗原是否 通过 单独的皮肤抗原或与PAMP联合使用可分别诱导调节性T细胞（Ts）或细胞毒性T细胞（Tcs），进而调节CHS反应。CBA/J小鼠的免疫 通过 EC 注射 100 µg TNP-Ig 或 TNP-Ig 加 100 µg LPS 分别诱导 Ts 或 Tcs 细胞。随后用 5% TNCB 对小鼠进行致敏，并在 4 天后以相同半抗原进行攻击。通过测量攻击前后耳部肿胀来评估反应。每次实验均设阴性对照，用于评估非特异性炎症反应，以及接触性超敏反应（CHS）对照，以验证 CHS 反应的诱导。

图4 表明在接触性超敏反应（CHS）诱导前暴露于TNP-Ig的小鼠，其CHS反应显著降低（图 4A，Ts 测试组 与. CHS对照）。然而，在CHS诱导前将EC暴露于TNP-Ig联合PAMP可逆转CHS的抑制作用 体内 (图4B

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

这些研究在多种不同的动物模型上进行，使用了多种小鼠品系，如 BALB/c、C57BL/6、HLADR4-Tg、DBA 1、B10.PL 和 SJL，结果表明，通过指定抗原进行表皮细胞（EC）免疫接种可作为一种多功能且潜力无限的手段，用于诱导免疫耐受并控制不必要的免疫反应。本实验方案概述了两种细胞转移模型：（1）“过继性转入”（adoptive transfer IN），适用于评估接触性超敏反应（CHS）传入相和传出相期间的免疫调节作用；（2）“过继性转出”（adoptive transfer OUT），专门用于评估其在传出相中的效应。此外，已有研究表明，将抑制性T细胞（Ts细胞）注射到已致敏的小鼠体内，可下调CHS7,28。这一发现已被作为多发性硬化症患者临床试验的起点29,30。本方案的另一种策略是反向抑制/免疫增强（contrasuppression/immunopotentiation），即在脱毛小...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由波兰科学研究委员会资助项目3 PO5B 091 25、2PO5A 204 29以及国家科学中心项目N N401 3554 33（资助对象：M.S.）提供支持。图表使用GraphPad Prism软件10.2.3绘制，图1-3在BioRender中创建。Zemelka-Wiacek, M.（2025）：（1）https://BioRender.com/3ux2px；（2） https://BioRender.com/s0y8zs7；（3）https://BioRender.com/0qziglw。作者感谢Dorota Woźniak对小鼠品系的维护工作。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,4,6-三硝基氯苯（TNCB）Tokyo Chemical Industry CO., LTD, 日本C0307
2,4,6-三硝基苯基偶联小鼠免疫球蛋白（TNP-Ig）波兰克拉科夫雅盖隆大学医学院健康科学学院生物医学科学系
丙酮（ACS级试剂，≥99.5%）Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国179124
铝箔Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国Z185140  
分析天平 Sartorius Weighing Technology GmbH, 哥廷根, 德国PRACTUM224-1s, 29105177
牛血清白蛋白（BSA）Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国A9418
CBA/J (H-2k) 波兰克拉科夫雅盖隆大学医学院健康科学学院生物医学科学系繁殖单元
细胞筛，孔径 70 μmBIOLOGIX, 中国15-1070
一次性移液管，容量：5 mL、10 mL、25 mLMerck KGaA, 达姆施塔特, 德国Z740301, Z740302, Z740303
Dulbecco′s 磷酸盐缓冲液（DPBS）ThermoFisher Scientific,  马萨诸塞州沃尔瑟姆, 美国14190144
Eppendorf Safe-Lock 管，1.5 mlEppendorf, 德国30120086
Eppendorf Safe-Lock 管，2.0 mlEppendorf, 德国30120094
乙醇 100%（绝对乙醇）Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国1.07017
乙醇 96%Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国1.59010
胎牛血清（FBS）ThermoFisher Scientific,  马萨诸塞州沃尔瑟姆, 美国A3160802
玻璃显微镜载玻片（喷砂单面磨砂）ThermoScientific, 新罕布什尔州朴茨茅斯, 美国421-004T
Graph Pad PrismGraphPad Software Inc.v. 10.2.3
灰色肥皂（Bialy jelen 肥皂块）Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., 波兰163057
血细胞计数板VWR, Avantor, 美国612-5719
Heracell 150i 培养箱Thermo Electron  LED Gmbh, 德国41071068
异氟烷（Aerrane）Baxter, 伊利诺伊州迪尔菲尔德, 美国8AGG9623
氯胺酮 100 mg/mL，注射液Biowet Pulawy Sp. z o.o., 普瓦维, 波兰货号不可用
实验室离心机（Heraeus Fresco 21）Thermo Scientific, 德国75002425
实验室离心机（Heraeus Megafuge 1.0R） Thermo Scientific, 德国B00013899
脂多糖（LPS）Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国L-8274
口罩（FFP2）VWR, 宾夕法尼亚州拉德诺, 美国111-0917
千分尺Mitutoyo, 东京, 日本193-111
带物镜的显微镜Leica Microsystems CMS GmbH, 德国DM1000, 294011-082007
丙二醇 Chempur, Piekary figure-materials-1 波兰114489005
剃须刀片VWR, 宾夕法尼亚州拉德诺, 美国PERS94-0462
透明文件套，30 µmSCHEMAT5906961126542
台盼蓝Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国T8154
15 mL 无菌离心管Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国CLS430055 (Corninig)
50 mL 无菌离心管Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国CLS430290 (Corning)
螺口小瓶，透明玻璃（仅小瓶），22 mLMerck KGaA, 达姆施塔特, 德国27173
Viscoplast Polovis, 丝质粘合剂, 5x0.0125m3M 波兰, 纳达尔任, 波兰7100231620
水浴锅 AJL Electronic, 波兰LW102
赛拉嗪（xylapan 20 mg/mL）注射液Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., 大波兰地区戈茹夫, 波兰货号不可用

参考文献

  1. Szczepanik, M., Majewska-Szczepanik, M. Transdermal immunotherapy: Past, present and future. Pharmacol Rep. 68 (4), 773-781 (2016).
  2. Majewska-Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization with hapten-conjugated protein antigen alleviates contact sensitivity mediated by three different types of effector cells. Pharmacol Rep. 64 (4), 919-926 (2012).
  3. Majewska, M., et al. Role of TLR ligands in epicutaneously induced contrasuppression. Pharmacol Rep. 61 (3), 539-549 (2009).
  4. Ptak, W., et al. Toll-like receptor ligands reverse suppression of contact hypersensitivity reactions induced by epicutaneous immunization with protein antigen. Int Arch Allergy Immunol. 139 (3), 188-200 (2006).
  5. Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization induces alphabeta T-cell receptor CD4 CD8 double-positive non-specific suppressor T cells that inhibit contact sensitivity via transforming growth factor-beta. Immunology. 115 (1), 42-54 (2005).
  6. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunol Cell Biol. 90 (8), 784-795 (2012).
  7. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacol Rep. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  8. Marcińska, K., Majewska-Szczepanik, M., Maresz, K. Z., Szczepanik, M. Epicutaneous Immunization with Collagen Induces TCRαβ Suppressor T Cells That Inhibit Collagen-Induced Arthritis. Int Arch Allergy Immunol. 166 (2), 121-134 (2015).
  9. Marcińska, K., et al. Epicutaneous (EC) immunization with type II collagen (COLL II) induces CD4(+) CD8(+) T suppressor cells that protect from collagen-induced arthritis (CIA). Pharmacol Rep. 68 (2), 483-489 (2016).
  10. Majewska, M., et al. Epicutaneous immunization with myelin basic protein protects from the experimental autoimmune encephalomyelitis. Pharmacol Rep. 59 (1), 74-149 (2007).
  11. Tutaj, M., Szczepanik, M. Epicutaneous (EC) immunization with myelin basic protein (MBP) induces TCRalphabeta+ CD4+ CD8+ double positive suppressor cells that protect from experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). J Autoimmun. 28 (4), 208-215 (2007).
  12. Majewska-Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization with protein antigen TNP-Ig alleviates TNBS-induced colitis in mice. Pharmacol Rep. 64 (6), 1497-1504 (2012).
  13. Majewska, M., et al. TCRalphabeta + CD8+ and TCRgammadelta+ lymphocytes inhibit the capability of peritoneal macrophages to induce contact hypersensitivity. Folia Biol (Krakow). 57 (1-2), 23-27 (2009).
  14. Ptak, W., et al. Epicutaneous immunization with protein antigen in the presence of TLR4 ligand induces TCR alpha beta+CD4+ T contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression of Th1-mediated contact sensitivity. J Immunol. 182 (2), 837-850 (2009).
  15. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. Int Arch Allergy Immunol. 164 (2), 122-136 (2014).
  16. Majewska-Szczepanik, M., Dorożyńska, I., Strzępa, A., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen TNP-Ig and NOD2 ligand muramyl dipeptide (MDP) reverses skin-induced suppression of contact hypersensitivity. Pharm Rep. 66 (1), 137-142 (2014).
  17. Majewska-Szczepanik, M., Askenase, P. W., Lobo, F. M., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with ovalbumin and CpG induces TH1/TH17 cytokines, which regulate IgE and IgG2a production. J Allergy Clin Immunol. 138 (1), 262-273 (2016).
  18. Majewska-Szczepanik, M., Yamamoto, N., Askenase, P. W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with phosphorylcholine conjugated to bovine serum albumin (PC-BSA) and TLR9 ligand CpG alleviates pneumococcal pneumonia in mice. Pharmacol Rep. 66 (4), 570-575 (2014).
  19. Tan, G., et al. Hydration effects on skin microstructure as probed by high-resolution cryo-scanning electron microscopy and mechanistic implications to enhanced transcutaneous delivery of biomacromolecules. J Pharm Sci. 99 (2), 730-740 (2010).
  20. Mondoulet, L., et al. Epicutaneous immunotherapy on intact skin using a new delivery system in a murine model of allergy. Clin Exp Allergy. 40 (4), 659-667 (2010).
  21. Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. Eur J Immunol. 34 (8), 2100-2109 (2004).
  22. Callard, R. E., Harper, J. I. The skin barrier, atopic dermatitis and allergy: a role for Langerhans cells. TRENDS Immunol. 28 (7), 294-298 (2007).
  23. Eidsmo, L., Martini, E. Human Langerhans Cells with Pro-inflammatory Features Relocate within Psoriasis Lesions. Front Immunol. 22 (9), 300(2018).
  24. McKinney, M. M., Parkinson, A. A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. J Immunol Methods. 96 (2), 271-278 (1987).
  25. Methods in Immunology and Immunochemistry by: Curtis A Williams Merrill W. Chase vol. 2 Physical and chemical methods. , Academic Press. Now York. 359(1968).
  26. Wang, G., Wang, Y., Ma, F. Exploiting bacterial-origin immunostimulants for improved vaccination and immunotherapy: current insights and future directions. Cell Biosci. 14 (1), 24(2024).
  27. Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a murine model of allergic contact dermatitis. J Vis Exp. 26 (187), e64329(2022).
  28. Thomas, W. R., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Differences in the ability of T cells to suppress the induction and expression of contact sensitivity. Immunology. 42 (1), 53-59 (1981).
  29. Walczak, A., Siger, M., Ciach, A., Szczepanik, M., Selmaj, K. Transdermal application of myelin peptides in multiple sclerosis treatment. JAMA Neurol. 70 (9), 1105-1109 (2013).
  30. Juryńczyk, M., et al. Immune regulation of multiple sclerosis by transdermally applied myelin peptides. Ann Neurol. 68 (5), 593-601 (2010).
  31. Beaujean, M., et al. The immunological effects of intradermal particle-based vaccine delivery using a novel microinjection needle studied in a human skin explant model. Vaccine. 41 (13), 2270-2279 (2023).
  32. Prins, M. L. M., Prins, C., de Vries, J. J. C., Visser, L. G., Roukens, A. H. E. Establishing immunogenicity and safety of needle-free intradermal delivery by nanoporous ceramic skin patch of mRNA SARS-CoV-2 vaccine as a revaccination strategy in healthy volunteers. Virus Res. 334, 199175(2023).
  33. Brough, H. A., et al. Epicutaneous sensitization in the development of food allergy: What is the evidence and how can this be prevented. Allergy. 75 (9), 2185-2205 (2020).
  34. Paris, J. L., Vora, L. K., Torres, M. J., Mayorga, C., Donnelly, R. F. Microneedle array patches for allergen-specific immunotherapy. Drug Discov Today. 28 (5), 103556(2023).
  35. Bartnikas, L. M., et al. Epicutaneous sensitization results in IgE-dependent intestinal mast cell expansion and food-induced anaphylaxis. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 451-460 (2013).
  36. Leyva-Castillo, J. M., et al. Mechanical skin injury promotes food anaphylaxis by driving intestinal mast cell expansion. Immunity. 50 (5), 1262-1275 (2019).
  37. Amberg, N., Holcman, M., Stulnig, G., Glitzner, E., Sibilia, M. Effects of depilation methods on imiquimod-induced skin inflammation in mice. J Invest Dermatol. 137 (2), 528-531 (2017).
  38. He, X., Jia, L., Zhang, X. The effect of different preoperative depilation ways on the healing of wounded skin in mice. MDPI Animals. 12 (5), 581(2022).
  39. Liu, I. -L., Wang, L. -F. Epicutaneous sensitization with protein antigen. Dermatol Sinica. 30, 154-159 (2012).
  40. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Pyrczak, W., Szczepanik, M. Complementary methods for contact hypersensitivity (CHS) evaluation in mice. J Immunol Methods. 387 (1-2), 270-275 (2013).
  41. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  42. SanMiguel, A. J., Meisel, J. S., Horwinski, J., Zheng, Q., Grice, E. A. Topical antimicrobial treatments can elicit shifts to resident skin bacterial communities and reduce colonization by Staphylococcus aureus competitors. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), e00774-e00817 (2017).
  43. Strzępa, A., Majewska-Szczepanik, M., Lobo, F. M., Wen, L., Szczepanik, M. Broad spectrum antibiotic enrofloxacin modulates contact sensitivity through gut microbiota in a murine model. JACI. 140 (1), 121-133.e3 (2017).
  44. Meisel, J. S., et al. Commensal microbiota modulate gene expression in the skin. Microbiome. 6 (1), 20(2018).
  45. Arildsen, A. W., Zachariassen, L. F., Krych, L., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Delayed gut colonization shapes future allergic responses in a murine model of atopic dermatitis. Front Immunol. 12, 650621(2021).
  46. Griffin, M. F., desJardins-Park, H. E., Mascharak, S., Borrelli, M. R., Longaker, M. T. Understanding the impact of fibroblast heterogeneity on skin fibrosis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), dmm044164(2020).
  47. Majewska-Szczepanik, M., Strzępa, A., Marcińska, K., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig antigen induces CD11c+IL-10+ dendritic cells that promote suppression of Th1-mediated contact hypersensitivity in humanized HLA-DR4 transgenic mice. Int Immunopharmacol. 119, 110281(2023).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

表皮免疫接种免疫调节方案接触性超敏反应抑制性T细胞效应T细胞过继性转移皮肤免疫变应性接触性皮炎病原体相关分子模式
经皮诱导免疫调节的小鼠模型
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。