该研究揭示了皮肤在通过表皮（EC）免疫调节小鼠免疫反应中的作用。使用蛋白质抗原进行表皮免疫可抑制接触性超敏反应中的免疫应答，或在与病原体相关分子模式联合使用时逆转皮肤诱导的免疫抑制。表皮免疫作为一种有效的无针免疫治疗策略，展现出良好的应用前景。
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本文内容
摘要
摘要
皮肤作为人体最大的、与外界环境相接触的器官，具有多种重要的生理功能，包括（1）保护机体免受异物和微生物的侵害，（2）促进体温调节，（3）维持水和电解质平衡，（4）合成维生素D，以及（5）参与免疫反应。本文重点阐述了皮肤在免疫机制中的关键作用，展示了其通过抑制或增强免疫反应而实现免疫调节的能力。先前的研究发现，在小鼠中，通过表皮（EC）途径给予抗原，无论是单独使用还是与病原体相关分子模式（PAMPs）联合使用，可分别抑制或增强免疫反应。具体而言，观察到仅通过表皮途径给予抗原可在多种小鼠自身免疫疾病或变应性接触性皮炎模型中抑制免疫反应。结果表明，将抗原与PAMPs联合进行表皮免疫可作为一种有效策略，用于增强针对病原体的免疫力，或缓解T辅助细胞2型（Th2）依赖性过敏反应。本方案介绍了一种在由Th1细胞介导的人类变应性接触性皮炎（ACD）—接触性超敏反应（CHS）小鼠模型中，通过表皮途径施加抗原来诱导皮肤免疫抑制的方法。然而，该方法也可应用于多种其他小鼠疾病模型。本文将表皮诱导的免疫调节呈现为一种有吸引力的小鼠模型，可用于多种疾病的无针免疫治疗研究。
引言
本文介绍了一种在接触性超敏反应（CHS）小鼠模型中诱导耐受（本文中称为“抑制”）以及逆转该耐受（本文中称为“反向抑制”）的方法。 通过 单独或联合使用病原体识别受体（PRR）配体对皮肤表面施加抗原1在所述方案中，(a) 使用半抗原化的鼠免疫球蛋白（TNP-Ig）作为抗原 以抑制接触性超敏反应或（b）抗原 通过病原体相关分子模式（PAMPs）、Toll样受体（TLR）配体以及核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NOD-like receptors, NLRs）配体，逆转皮肤诱导的免疫抑制2,3,4研究结果表明，EC诱导的免疫调节由抗原非特异性的T抑制细胞（Ts细胞）和抗原特异性的T反抑制细胞（Tcs细胞）介导。这些细胞可通过过继性细胞转移的小鼠模型进行研究，以确定所检测反应的机制。本方案描述了两种细胞转移模型， "过继性转移" 和 "过继性转移"过继性转移技术适用于检测CHS传入相和传出相中的免疫调节作用。另一方面， "过继性转移" 仅反映免疫调节在CHS传出相中的作用。
皮肤诱导抑制方法的描述 通过 在人类变应性接触性皮炎（ACD）的小鼠模型中，通....
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方案
本文所述所有实验均经批准，并依照1st 和 2nd 波兰克拉科夫地方动物实验伦理委员会。所有操作均符合当地的推荐规范，特别是关于使用氯胺酮/赛拉嗪或异氟烷作为麻醉剂、使用刀片剃除小鼠皮肤毛发、在剃毛区域及双侧耳部应用物质/半抗原，以及外周免疫器官的采集。实验采用6-12周龄、体重20-25 g的CBA/J（H-2k）雄性和雌性小鼠。所用试剂与设备的详细信息列于 材料表.
1. 动物准备
- 将小鼠共同饲养，以避免隔离对它们的行为和健康产生负面影响。为确保统计学显著性，每组使用10至12只动物。
2. 准备操作区域
- 在所有操作前后，使用70%乙醇溶液对操作台进行消毒。若使用小鼠需要无菌条件，则应在生物安全柜内进行所有操作。
3. 诱导抑制性细胞（Ts）以抑制Th1介导的接触性超敏反应（CHS）
注意：该操作流程如图1A所示。
- 在当天 "0" 采用开放滴加法，....
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结果
本研究检验了所施加的抗原是否 通过 单独的皮肤抗原或与PAMP联合使用可分别诱导调节性T细胞（Ts）或细胞毒性T细胞（Tcs），进而调节CHS反应。CBA/J小鼠的免疫 通过 EC 注射 100 µg TNP-Ig 或 TNP-Ig 加 100 µg LPS 分别诱导 Ts 或 Tcs 细胞。随后用 5% TNCB 对小鼠进行致敏，并在 4 天后以相同半抗原进行攻击。通过测量攻击前后耳部肿胀来评估反应。每次实验均设阴性对照，用于评估非特异性炎症反应，以及接触性超敏反应（CHS）对照，以验证 CHS 反应的诱导。
图4 表明在接触性超敏反应（CHS）诱导前暴露于TNP-Ig的小鼠，其CHS反应显著降低（图 4A，Ts 测试组 与. CHS对照）。然而，在CHS诱导前将EC暴露于TNP-Ig联合PAMP可逆转CHS的抑制作用 体内 (图4B
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讨论
这些研究在多种不同的动物模型上进行，使用了多种小鼠品系，如 BALB/c、C57BL/6、HLADR4-Tg、DBA 1、B10.PL 和 SJL，结果表明，通过指定抗原进行表皮细胞（EC）免疫接种可作为一种多功能且潜力无限的手段，用于诱导免疫耐受并控制不必要的免疫反应。本实验方案概述了两种细胞转移模型：（1）“过继性转入”（adoptive transfer IN），适用于评估接触性超敏反应（CHS）传入相和传出相期间的免疫调节作用；（2）“过继性转出”（adoptive transfer OUT），专门用于评估其在传出相中的效应。此外，已有研究表明，将抑制性T细胞（Ts细胞）注射到已致敏的小鼠体内，可下调CHS7,28。这一发现已被作为多发性硬化症患者临床试验的起点29,30。本方案的另一种策略是反向抑制/免疫增强（contrasuppression/immunopotentiation），即在脱毛小.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由波兰科学研究委员会资助项目3 PO5B 091 25、2PO5A 204 29以及国家科学中心项目N N401 3554 33（资助对象：M.S.）提供支持。图表使用GraphPad Prism软件10.2.3绘制，图1-3在BioRender中创建。Zemelka-Wiacek, M.（2025）：（1）https://BioRender.com/3ux2px；（2） https://BioRender.com/s0y8zs7；（3）https://BioRender.com/0qziglw。作者感谢Dorota Woźniak对小鼠品系的维护工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,4,6-三硝基氯苯（TNCB） | Tokyo Chemical Industry CO., LTD, 日本 | C0307 | |
| 2,4,6-三硝基苯基偶联小鼠免疫球蛋白（TNP-Ig） | 波兰克拉科夫雅盖隆大学医学院健康科学学院生物医学科学系 | ||
| 丙酮（ACS级试剂，≥99.5%） | Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国 | 179124 | |
| 铝箔 | Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国 | Z185140 | |
| 分析天平 | Sartorius Weighing Technology GmbH, 哥廷根, 德国 | PRACTUM224-1s, 29105177 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国 | A9418 | |
| CBA/J (H-2k) | 波兰克拉科夫雅盖隆大学医学院健康科学学院生物医学科学系繁殖单元 | ||
| 细胞筛，孔径 70 μm | BIOLOGIX, 中国 | 15-1070 | |
| 一次性移液管，容量：5 mL、10 mL、25 mL | Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国 | Z740301, Z740302, Z740303 | |
| Dulbecco′s 磷酸盐缓冲液（DPBS） | ThermoFisher Scientific, 马萨诸塞州沃尔瑟姆, 美国 | 14190144 | |
| Eppendorf Safe-Lock 管，1.5 ml | Eppendorf, 德国 | 30120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock 管，2.0 ml | Eppendorf, 德国 | 30120094 | |
| 乙醇 100%（绝对乙醇） | Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国 | 1.07017 | |
| 乙醇 96% | Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国 | 1.59010 | |
| 胎牛血清（FBS） | ThermoFisher Scientific, 马萨诸塞州沃尔瑟姆, 美国 | A3160802 | |
| 玻璃显微镜载玻片（喷砂单面磨砂） | ThermoScientific, 新罕布什尔州朴茨茅斯, 美国 | 421-004T | |
| Graph Pad Prism | GraphPad Software Inc. | v. 10.2.3 | |
| 灰色肥皂（Bialy jelen 肥皂块） | Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., 波兰 | 163057 | |
| 血细胞计数板 | VWR, Avantor, 美国 | 612-5719 | |
| Heracell 150i 培养箱 | Thermo Electron LED Gmbh, 德国 | 41071068 | |
| 异氟烷（Aerrane） | Baxter, 伊利诺伊州迪尔菲尔德, 美国 | 8AGG9623 | |
| 氯胺酮 100 mg/mL，注射液 | Biowet Pulawy Sp. z o.o., 普瓦维, 波兰 | 货号不可用 | |
| 实验室离心机（Heraeus Fresco 21） | Thermo Scientific, 德国 | 75002425 | |
| 实验室离心机（Heraeus Megafuge 1.0R） | Thermo Scientific, 德国 | B00013899 | |
| 脂多糖（LPS） | Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国 | L-8274 | |
| 口罩（FFP2） | VWR, 宾夕法尼亚州拉德诺, 美国 | 111-0917 | |
| 千分尺 | Mitutoyo, 东京, 日本 | 193-111 | |
| 带物镜的显微镜 | Leica Microsystems CMS GmbH, 德国 | DM1000, 294011-082007 | |
| 丙二醇 | Chempur, Piekary  波兰 | 114489005 | |
| 剃须刀片 | VWR, 宾夕法尼亚州拉德诺, 美国 | PERS94-0462 | |
| 透明文件套，30 µm | SCHEMAT | 5906961126542 | |
| 台盼蓝 | Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国 | T8154 | |
| 15 mL 无菌离心管 | Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国 | CLS430055 (Corninig) | |
| 50 mL 无菌离心管 | Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国 | CLS430290 (Corning) | |
| 螺口小瓶，透明玻璃（仅小瓶），22 mL | Merck KGaA, 达姆施塔特, 德国 | 27173 | |
| Viscoplast Polovis, 丝质粘合剂, 5x0.0125m | 3M 波兰, 纳达尔任, 波兰 | 7100231620 | |
| 水浴锅 | AJL Electronic, 波兰 | LW102 | |
| 赛拉嗪（xylapan 20 mg/mL）注射液 | Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., 大波兰地区戈茹夫, 波兰 | 货号不可用 |
参考文献
- Szczepanik, M., Majewska-Szczepanik, M. Transdermal immunotherapy: Past, present and future. Pharmacol Rep. 68 (4), 773-781 (2016).
- Majewska-Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization with hapten-co....
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重印与许可
