酒精滥用会因抑制线粒体呼吸和生物能量代谢而损害肺泡巨噬细胞（AM）的免疫功能。我们近期研究发现，乙醇（EtOH）暴露会增加AM中线粒体呼吸对谷氨酰胺的依赖性。本文提供了利用细胞外通量生物分析仪检测经乙醇处理的AM中谷氨酰胺在线粒体呼吸中作用的方法。
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摘要
摘要
肺泡巨噬细胞（AMs）是下呼吸道抵御病原体的第一道细胞防线。然而，长期且过量饮酒会损害AMs吞噬和清除肺泡腔内病原体的能力，部分原因是细胞能量代谢和生物能量学的失调。我们先前的研究表明，长期乙醇（EtOH）摄入会损害AMs的线粒体生物能量功能，并导致乳酸水平升高。此外，我们最近还发现，EtOH会增加AMs对谷氨酰胺的依赖性，提升谷氨酰胺依赖性的最大呼吸速率，同时降低代谢灵活性，使呼吸底物由丙酮酸依赖性呼吸向谷氨酰胺依赖性呼吸转变。当丙酮酸被用于乳酸生成或其他燃料来源不足时，谷氨酰解是线粒体呼吸的重要代偿途径。本研究采用小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S细胞，分别在无乙醇或含乙醇（0.08%）条件下处理72小时，利用细胞外通量生物分析仪评估线粒体呼吸和生物能量对谷氨酰胺作为燃料来源的依赖程度。实验中实时检测了在基础培养基条件下或加入谷氨酰胺酶1抑制剂——双(5-苯乙酰胺-1,3,4-噻二唑-2-基)乙基硫醚（BPTES）后的反应，该抑制剂可阻断谷氨酰胺转化为谷氨酸的酶促反应；随后进行溶剂对照处理，并进一步检测线粒体应激状态。本文提供的分步实验方案详细描述了我们用于分析多组生物学重复和实验重复中谷氨酰胺依赖性基础线粒体呼吸、线粒体ATP偶联呼吸、最大线粒体呼吸以及线粒体备用呼吸能力平均值的方法与计算过程。
引言
酒精使用障碍（AUD）影响了美国超过2800万人1。患有AUD的人发生呼吸道感染的风险增加至2-4倍2,3，从而提高了早发性发病和死亡的风险3,4,5。酒精滥用会增加个体对呼吸道感染的易感性，部分原因是其抑制了肺部的免疫功能。肺泡巨噬细胞（AMs）是抵御下呼吸道病原体的第一道细胞防线，能够吞噬并清除吸入的微生物。然而，长期饮酒会损害AMs吞噬和杀灭病原体的能力6,7。
肺泡巨噬细胞（AMs）的免疫功能（如吞噬作用）是高耗能过程，需要活跃的代谢通路以生成大量三磷酸腺苷（ATP）。线粒体氧化磷酸化是细胞内生成ATP效率最高的过程，但长期乙醇（EtOH）暴露会增加线粒体来源的氧化应激，可能导致AMs中线粒体功能障碍8,9,10。利用细....
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方案
1. 慢性乙醇暴露 体外
- 在含有RPMI-1640培养基、10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、11.9 mM碳酸氢钠、40 mg/mL庆大霉素和50 µM 2-巯基乙醇的完全培养基中，于37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养MH-S细胞（一种小鼠肺泡巨噬细胞系）。
- 用或不用乙醇（EtOH，0.8 mg/mL或0.08%）处理培养的MH-S细胞72小时，每24小时更换一次乙醇。将经乙醇处理的MH-S细胞置于另一湿润培养箱中，在37°C、5% CO2条件下孵育，且培养箱的水盘中含有0.08%的乙醇。
2. 使用细胞外通量分析仪评估谷氨酰胺作为能源物质时 MH-S 细胞的接种
- 确保未经处理的对照组（Con）和长期乙醇（EtOH）处理的 MH-S 细胞在 T-75 培养瓶中生长至至少 50% 汇合度（70%–90% 汇合度为最佳），以便传代至 96 孔细胞外通量微培养板。为每组生物学重复的 Con 和 EtOH 实验条件及其培养基对照设置 5–6 个技术重复，绘制板图，共设四组（生物学重复 n= 1），用于与 BPTES 注射结果进行比较。
- 用培养基或磷酸盐缓冲液清洗细胞。
- 向培养瓶....
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结果
长期乙醇暴露降低 MH-S 细胞对谷氨酰胺的依赖性。
谷氨酰胺分解是线粒体呼吸的关键通路，表明谷氨酰胺是细胞生物能量的重要燃料来源。为了确定长期乙醇暴露是否改变 MH-S 细胞对谷氨酰胺作为线粒体呼吸燃料来源的依赖性，将 MH-S 细胞分别用无乙醇的对照（Con）或乙醇处理，并随时间测量其对与线粒体呼吸相关的试剂序贯注射所引起的氧消耗率（OCR）变化。通过序贯注射寡霉素（ATP合酶抑制剂）、FCCP（质子解偶联剂）以及R/A（分别为线粒体复合物I和复合物III抑制剂）所获得的OCR生物能量谱，可用于计算线粒体生物能量学的其他参数，例如ATP偶联呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力。所示所有数据均为Crotty等人已发表研究中Con + 培养基、Con + BPTES、EtOH + 培养基、EtOH + BPTES MH-S细胞实验组的额外生物学重复数据11。如图2A所示，寡霉素因抑制复合物V而导致OCR下降，FCCP因破坏膜电位导致线粒体解偶联并促进线粒体依赖性ATP生成而使OCR升高
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讨论
本文所提供的数据是未经处理及长期乙醇（EtOH）暴露的 MH-S 细胞在培养基对照或 BPTES 处理下的额外生物学重复实验，相关结果已发表于 Crotty 等人的研究11。所描述的实验方案用于评估乙醇暴露的 MH-S 细胞对谷氨酰胺作为线粒体呼吸和生物能量学燃料来源的依赖性，检测工具为细胞外通量生物分析仪。该方案包含若干关键步骤。首先，MH-S 细胞的贴壁状态和汇合度至关重要。MH-S 细胞最初以较低密度接种于细胞外通量微孔板中培养，并在细胞达到约 90% 汇合度形成单层时使用。由于 MH-S 细胞的乙醇暴露时间为 72 小时，因此在进行细胞外通量生物分析仪检测前，细胞应已达到 90% 的最终汇合度。这一标准与其他文献中报道的细胞单层形成要求一致，即实验前细胞汇合度应达到 90%–100%15,16,17。其次，将线粒体呼吸值归一化至各样品中的蛋白含量至关重要。部分研究将线粒体生物能量学参数归一化至细胞.......
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披露
所有作者均无任何相关的财务利益冲突需要申报。
致谢
我们感谢张莎拉（Sarah S. Chang，理学学士）在初始细胞培养及实验用 MH-S 细胞制备方面所做的贡献。本研究由美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所（NIAAA）R01-AA026086 项目资助 SMY（ORCID: 0000-0001-9309-0233），NIAAA F31-F31AA029938 项目资助 KMC，以及美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）T32-GM008602 项目资助兰迪·霍尔（Randy Hall），埃默里大学药理学与化学生物学系。本报告内容不代表美国退伍军人事务部或美国政府的观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 锥形管 | VWR International, Inc. | 21008-670 | 用于配制线粒体相关试剂的储备浓度。 |
| 2-巯基乙醇 | Sigma Aldrich Co. | M6250 | 用于 MH-S 细胞的培养。 |
| 细胞刮刀 | Dot Scientific, Inc. | 70-1180 | 用于从 T-75 培养瓶中刮取 MH-S 细胞。 |
| Countess 3 FL 仪器：细胞计数仪 | Fisher Scientific Company | AMQAF2000 | 用于计数待接种进行实验的 MH-S 细胞数量。 |
| D-葡萄糖 | Sigma Aldrich Co. | G8270 | 用于细胞外通量基础培养基。 |
| 乙醇 | Fisher Scientific Company | 4355720 | 对 MH-S 细胞进行实验处理。 |
| 胎牛血清 | Sciencell Research Laboratories | 500 | 用于 MH-S 细胞的培养。 |
| 庆大霉素 | Sigma Aldrich Co. | G1397 | 用于 MH-S 细胞的培养。 |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | 用于细胞外通量基础培养基。 |
| GraphPad Prism 10.2.3 | GraphPad Software | N/A | 用于统计分析的软件。购买后可从 https://www.graphpad.com/features 下载。 |
| MH-S 细胞 | American Type Culture Collection | CRL-2019 | 小鼠肺泡巨噬细胞系。 |
| 微量离心管 | USA Scientific, Inc. | 4036-3212 | 用于配制线粒体相关试剂的工作浓度。 |
| Microsoft 365 Excel：计算机电子表格程序 | Microsoft | N/A | 用于数据整理及线粒体生物能量学计算的软件。购买后可从 https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel 下载。 |
| 青霉素/链霉素 | Fisher Scientific Company | 15140122 | 用于 MH-S 细胞的培养。 |
| 磷酸盐缓冲液 | VWR International, Inc. | 45000-446 | 用于清洗 MH-S 细胞。 |
| RPMI-1640 | VWR International, Inc. | 45000-396 | 用于 MH-S 细胞的培养。 |
| Seahorse Wave Pro 软件：用于实验设计与分析的计算机软件程序 | Agilent Technologies, Inc. | N/A | 该计算机连接 Seahorse XF Pro 分析仪。可从 https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523 下载。 |
| Seahorse XF 基础培养基：细胞外通量基础培养基，pH 7.4 | Agilent Technologies, Inc. | 103334-100 | 用于配制线粒体相关试剂的储备和工作浓度，并在实验前用于 MH-S 细胞的培养。 |
| Seahorse XF 谷氨酰胺氧化应激检测试剂盒 | Agilent Technologies, Inc. | 103674-100 | 包含储备液 BPTES、寡霉素、FCCP 和鱼藤酮/抗霉素 A。 |
| Seahorse XF Pro 分析仪：细胞外通量生物分析仪 | Agilent Technologies, Inc. | N/A | 细胞外通量生物分析仪。 |
| Seahorse XFe96 FluxPak：96 孔细胞外通量检测用卡盒、96 孔细胞外通量微培养板及校准液 | Agilent Technologies, Inc. | 102416-100 | 用于使用细胞外通量生物分析仪前对 MH-S 细胞进行准备。 |
| 移液管 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-550678 | 用于移除 MH-S 细胞的培养基。 |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich Co. | S6014 | 用于 MH-S 细胞的培养。 |
| 丙酮酸钠 | Sigma Aldrich Co. | P4562 | 用于细胞外通量基础培养基。 |
| T-75 培养瓶 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-200263 | 用于 MH-S 细胞的培养。 |
参考文献
- 2021 National Survey on Drug Use and Health (NSDUH). Table 5.6A - Alcohol Use Disorder in Past Year: Among People Aged 12 or Older; by Age Group and Demographic Characteristics, Numbers in Thousands, 2021. , Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA). At https://www.samhsa.gov/data/sites/default/files/reports/rpt39441/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetTabsSect5pe2021.htm (2021).
- Everts, R. J., et al.
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