临床宏蛋白质组学为研究人类微生物组及其在疾病中的作用提供了深入见解。我们利用 Galaxy 平台的计算能力，开发了一种模块化的生物信息学工作流程，该流程可促进基于质谱的复杂宏蛋白质组学分析，并实现对多种与疾病研究相关的临床样本类型的表征。
本文内容
摘要
摘要
临床宏蛋白质组学揭示了宿主-微生物组相互作用在疾病中的基础作用。然而，该方法仍面临诸多挑战。特别是，相对于宿主蛋白，丰度较低的微生物蛋白的表征十分困难。另一个重要挑战源于使用非常庞大的蛋白质序列数据库，这不仅在从质谱数据中进行肽段和蛋白质鉴定时降低了灵敏度和准确性，还影响了分类学与功能注释的获取以及统计分析的执行。为解决这些问题，我们提出了一种整合的生物信息学工作流程，用于基于质谱的宏蛋白质组学分析，该流程结合了自定义蛋白质序列数据库构建、肽谱匹配生成与验证、定量分析、分类学和功能注释以及统计分析。该工作流程同时支持人类蛋白质的表征（在优先关注微生物蛋白质的前提下），从而提供对疾病中宿主-微生物相互作用动态的深入理解。这些工具和流程部署于Galaxy生态系统中，有助于开发、优化和共享这些计算资源。我们已将该工作流程应用于多种临床样本类型的宏蛋白质组学分析，例如鼻咽拭子和支气管肺泡灌洗液。在此，我们通过分析宫颈拭子残留液体来展示其应用价值。完整的工作流程及配套培训资源均可在Galaxy培训网络获取，旨在为非专业人员和经验丰富的研究人员提供分析其数据所需的知识与工具。
引言
基于质谱（MS）的宏蛋白质组学可从临床样本中鉴定并定量微生物和人类蛋白质。该方法为理解微生物组对疾病反应提供了新的视角，并揭示了宿主-微生物组相互作用的潜在介质1,2。尽管临床样本的宏蛋白质组学分析能够揭示微生物组与其宿主环境之间的相互作用，但该领域仍面临诸多挑战。其中一个主要挑战是宿主（人类）蛋白质的相对丰度较高，这会阻碍对低丰度微生物蛋白质的鉴定。此外，基于质谱的宏蛋白质组学依赖于非常大的蛋白质序列数据库。这些数据库包含样本中存在的微生物蛋白组，可能导致数据库规模庞大，包含数百万条序列。在通过胰蛋白酶消化蛋白质生成串联质谱（MS/MS）谱图后，需将这些MS/MS谱图与大型蛋白质序列数据库进行比对，为每张谱图匹配相应的肽段序列（即肽段-谱图匹配，PSM）。然而，随着宏蛋白质组学所用数据库规模的增大，检测灵敏度下降，假阳性风险也随之增加3。此外，不同分类群间保守的蛋白质序列以及对编码蛋白质注释的不足，限制了对检测到的肽段和蛋白质进行分类学和功能注释的准确性4,5。本文提出了一种用于临床样本高效宏蛋白质组学分析的生物信息学工作流程，可应对上述诸多挑战，并为研究人员提供易于使用的软件资源，以探究人类疾病中宿主-微生物组动态关系的机制。
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方案
MS/MS 质谱数据来自去标识化的残余 PTF 样本，这些样本的采集过程遵循机构审查委员会批准的指南和规定，如前所述21,29,30。
注意：图1 展示了完整工作流程的概览，该流程包含五个模块。补充表1 总结了所有输入、输出及软件工具。
图1：Galaxy平台内临床宏蛋白质组学工作流程模块概览。 完整的临床宏蛋白质组学工作流程包含五个模块：数据库生成、发现、验证、定量和数据解读。(A
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结果
本文所述通用方案已在从部分 PTF 样本获得的 MS/MS 文件上进行了验证21。Do 等人21分析了四个 PTF 样本的 MS/MS 文件，这些样本的采集遵循了 Boylan 等人29以及 Afiuni-Zadel 等人30所描述的操作流程。该工作流程优先关注微生物蛋白，但同时具备并行分析人类蛋白与微生物蛋白的灵活性21。该工作流程及其多种变体已在其他研究中得到应用6,20。
为了整理一份相关物种的列表，Do 等人从一项先前研究中选取了118个分类学物种，该研究曾探讨宫颈-阴道微生物组30。该列表包含117种细菌以及酵母菌Candida albicans（
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讨论
临床宏蛋白质组学研究为临床研究提供了潜在的突破，但其实施过程中仍存在诸多挑战。在大多数样本中，微生物蛋白的丰度远低于宿主蛋白，这阻碍了非宿主蛋白的检测与表征6,10。准确鉴定和定量肽段及蛋白质依赖于庞大的蛋白质序列数据库，同时在对已鉴定的肽段和蛋白质进行分类学和功能注释以实现定量和统计分析时也面临复杂性，这些均构成了技术障碍1,3。本研究在Galaxy生物信息学平台中建立的临床宏蛋白质组学工作流程，可有效应对上述多项挑战。该流程使研究人员能够分析其质谱（MS）数据，生成针对其临床样本定制的蛋白质序列数据库，并利用多种搜索算法将MS/MS数据与蛋白质序列数据库进行匹配。通过纳入对假定微生物肽段匹配结果与MS/MS谱图的验证步骤，提高了所鉴定肽段及推断蛋白质的可信度，并支持其定量、可视化以及分类学归属和功能注释的分配，进而开展统计分析。
串联质谱标签（T.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢明尼苏达大学的 Amy Skubitz 博士和 Kristin Boylan 博士提供的初步数据集，以及美国西北太平洋国家实验室（PNNL）的 Paul Piehowski 博士、Tao Liu 博士和 Karin Rodland 博士在样本采集、PTF 样本处理以及本研究中所用 TMT 标记质谱数据生成方面的专业支持。本项目部分由明尼苏达卵巢癌联盟（MOCA）、美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助，资助编号：5R01CA262153（A.P.N.S.）、1R21CA267707（P.D.J. 和 T.J.G.），以及美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助编号：P30CA077598（P.D.J. 和 T.J.G.）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 合并数据集列表集合为单个文件（按列表顺序） | GalaxyP | Galaxy 版本 5.1.1 | 将数据集列表集合合并为一个文件（按列表顺序） |
| 连接数据集 | GalaxyP | Galaxy 版本 0.1.1 | 将文件首尾相连进行拼接 |
| 剪切 | GalaxyP | Galaxy 版本 1.0.2 | 从文件中剪切（选择）指定的列 |
| FASTA 合并文件并筛选唯一序列 | GalaxyP | Galaxy 版本 1.2.0 | 将多个 FASTA 数据库文件合并在一起 |
| FastaCLI | GalaxyP | Galaxy 版本 4.0.41+galaxy1 | 向 FASTA 文件追加诱饵序列 |
| FASTA 转表格 | GalaxyP | Galaxy 版本 1.1.0 | 将 FASTA 格式的序列转换为制表符分隔格式 |
| 筛选 | GalaxyP | Galaxy 版本 1.1.1 | 使用简单表达式筛选列 |
| 筛选表格文件 | GalaxyP | Galaxy 版本 3.3.0 | 通过行筛选条件过滤表格文件 |
| Galaxy 欧洲（EU）服务器 | GalaxyP | https://usegalaxy.eu/ | |
| 分组 | GalaxyP | Galaxy 版本 2.1.4 | 按特定列对文件进行分组并执行聚合函数 |
| 鉴定参数设置 | GalaxyP | Galaxy 版本 4.0.41+galaxy1 | 为 SearchGUI/PeptideShaker 设置鉴定参数 |
| 学习路径：Galaxy 中的临床宏蛋白质组学工作流程 | GalaxyP | https://training.galaxyproject.org/training-material/learning-pathways/clinical-metaproteomics.html | |
| MaxQuant | GalaxyP | Galaxy 版本 2.0.3.0+galaxy0（发现模块）；Galaxy 版本 1.6.17.0+galaxy4（定量模块） | 用于分析大规模质谱数据文件的定量蛋白质组学软件包 |
| MetaNovo | GalaxyP | Galaxy 版本 1.9.4+galaxy4 | 将 MS/MS 数据与已知蛋白质的 FASTA 数据库进行比对，生成用于质谱分析的靶向数据库（匹配的蛋白质） |
| msconvert | GalaxyP | Galaxy 版本 3.0.20287.2 | 转换和/或过滤质谱文件 |
| MSstatsTMT | GalaxyP | Galaxy 版本 2.0.0+galaxy1 | 基于 R 的软件包，用于在基于串联质谱标签（TMT）标记的 shotgun 质谱蛋白质组学实验中检测差异丰度蛋白 |
| PepQuery2 | GalaxyP | Galaxy 版本 2.0.2+galaxy0 | 以肽段为中心的搜索引擎，用于鉴定和/或验证目标已知或新肽段 |
| PeptideShaker | GalaxyP | Galaxy 版本 2.0.33+galaxy1 | 解析 SearchGUI 的结果以实现蛋白质鉴定 |
| 蛋白质数据库下载器 | GalaxyP | Galaxy 版本 0.3.4 | 将指定的蛋白质序列下载为 FASTA 文件 |
| 查询表格文件 | GalaxyP | Galaxy 版本 3.3.0 | 将表格文件加载到 SQLite 数据库中 |
| 移除开头部分 | GalaxyP | Galaxy 版本 1.0.0 | 从文件中移除指定数量的（标题）行 |
| SearchGUI | GalaxyP | Galaxy 版本 4.0.41+galaxy1 | 在 MGF 峰值列表上运行搜索引擎，并将结果准备为 PeptideShaker 的输入 |
| 选择 | GalaxyP | Galaxy 版本 1.0.4 | 选择匹配表达式的行 |
| Unipept | GalaxyP | Galaxy 版本 4.5.1 | 检索胰蛋白酶肽段对应的 UniProt 条目及分类学信息 |
| UniProt | GalaxyP | Galaxy 版本 2.3.0 | 从 UniProtKB 下载蛋白质组为 XML（UniProtXML）或 FASTA 文件 |
参考文献
- Zhang, X., Li, L., Butcher, J., Stintzi, A., Figeys, D. Advancing functional and translational microbiome research using meta-omics approaches. Microbiome. 7 (1), 154(2019).
- Van Den Bossche, T., et al. The Met....
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