用于转化研究的高通量自动化多重免疫荧光检测方法

摘要

本报告介绍了一种在自动化载片染色机上进行多重免疫荧光（mIF）检测的自动化方案。该方案展示了在标准高通量组织自动染色机和全片荧光成像系统上实现空间蛋白质组学的高度可重复性，非常适合在转化研究中对大量组织切片进行定制化的mIF检测。

摘要

多重免疫荧光（mIF）是一种先进技​​术，可通过在单个组织切片中同时可视化多种蛋白质生物标志物，实现对组织样本的详细且具有空间分辨能力的分析。然而，大多数mIF技术在多重检测时面临灵敏度与通量之间的显著权衡，这限制了在多个组织切片中稳定检测低丰度生物标志物的能力。一种新型mIF方法利用与抗体相连的独特DNA条形码，并通过平行的单分子扩增机制进行信号放大。该方法在实现高重数检测能力和高通量全片成像的同时，染色质量可媲美临床级免疫组织化学（IHC）。该检测方法包括在组织上扩增一组DNA条形码标记的抗体混合物，随后通过多轮连续检测步骤，每轮可视化四种荧光标记的寡核苷酸，从而实现在每个组织样本中检测八种或更多生物标志物。该方法的关键步骤包括自动化组织制备、应用与DNA条形码偶联的一抗、信号扩增，以及检测、成像和信号清除的循环迭代过程。成像后，通过图像配准及基于人工智能增强的空间图像数据科学平台进行单细胞分析。本研究中，该方案应用于福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的多种组织微阵列（TMA），包括扁桃体、黑色素瘤、结肠和淋巴结组织芯，每种设置三个重复。先进的mIF技术可更深入揭示肿瘤应答、肿瘤微环境及免疫图谱特征。通过克服灵敏度、多重检测能力与成像通量之间的固有矛盾，研究人员现可致力于解析复杂分子特征及治疗反应生物标志物的异质性。

引言

高度多重免疫荧光（mIF）是一种先进的技术，通过在单个组织切片中同时可视化多种蛋白质生物标志物，正在彻底改变组织分析领域^1,2。该技术提供了无与伦比的细节水平和空间分辨率，对于理解组织微环境中具有复杂形态的多种细胞类型之间的相互作用至关重要，且适用于多个空间尺度的研究³。该技术在肿瘤学研究中尤为有价值，可用于共定位肿瘤生物标志物、蛋白质药物靶点、局部免疫状态和检查点状态、不同类型细胞之间的相互作用，甚至与组织内药物代谢相关的亚细胞共定位模式^4,5,6。

尽管具有潜力，大多数多重免疫荧光（mIF）技术仍面临重大挑战，尤其是在灵敏度、通量与多重检测能力之间实现平衡方面。这一局限性对于表达水平极低的临床生物标志物（如HER2和PD-L1^7,8,9）的检测尤为关键。要理解其原因，必须了解mIF的其他技术模式。这些传统方法为更复杂的mIF平台奠定了基础，但各自也存在特定的优势与局限性。

直接免疫荧光法（DIF）使用与荧光染料直接偶联的抗体，或与能够招募荧光染料的寡核苷酸偶联的抗体¹⁰。该方法在多重检测中操作简便，但灵敏度较低，且难以区分组织背景或染色伪影中的信号。

间接免疫荧光法（IIF）利用一种与一抗结合的二抗，其信号强度高于基于一抗的直接免疫荧光法（DIF）。当与改进的流式细胞仪设计相结合时，连续IIF可在一次检测中识别多达40种生物标志物^2,11。然而，与基于酶的信号放大策略（如免疫组化（IHC）技术中所采用的方法）相比，这些方法仍存在相对较低的灵敏度问题。

基于酶催化作用的免疫荧光技术最常见于利用辣根过氧化物酶（HRP）进行显色（DAB）或荧光染料沉积（例如，酪胺信号放大法（TSA））的免疫组织化学（IHC）方法中。由于这些检测方法均基于相同的催化酶，其检测灵敏度相似，因此多光谱TSA为基础的多重免疫荧光（mIF）检测适用于临床应用^2,12。基于DNA的信号放大技术的优势在于可在保持优异信号放大效果和模块化的同时，实现高度多重检测。相比之下，HRP-based方法的模块化程度较低，且难以优化，需要额外的抗体组合开发和测试周期。

DNA条形码抗体免疫荧光
本实验所展示的多重免疫荧光（mIF）检测方法利用DNA聚合酶同时扩增带有DNA条形码的抗体，随后在每轮成像中使用四种荧光寡核苷酸进行多轮报告探针染色与脱色循环（图1）。

图1：多重免疫荧光检测流程的示意图。 条形码偶联抗体通过单步加入，条形码同时进行扩增。每轮循环中加入四组荧光探针，可同时可视化四个标志物。请点击此处查看该图的放大版本。

单轮抗体添加和单步扩增显著简化了检测流程。该过程通过自动化的高通量染色和扫描系统实现，确保在临床研究中大量样本的片间和批间结果具有良好的可重复性¹³。

该技术的主要优势之一是在实现高度多重检测的同时仍能保持高灵敏度²。该工作流程还确保了成像通量维持在高水平，从而解决了高度多重mIF技术（例如，> 8种生物标志物）在临床研究中的一个主要局限性。这一点在临床研究中尤为重要，因为患者之间低丰度药物靶点（例如，低HER2）的微小差异可能为治疗反应提供关键见解。

除了这些关键特性外，该检测方法还提供面板可配置性、高通量全片成像能力以及必要的光学分辨率，可用于研究亚细胞过程和区室，以及与巨噬细胞和树突状细胞相关的细胞突起。能够在多个空间尺度上研究复杂的细胞表型，是光学成像相较于基于成像质谱流式细胞术（IMC）方法的关键优势²。

本研究介绍了一种使用自动染色机和全片扫描仪进行8重多重免疫荧光（mIF）检测的实验方案。该检测包含八种一抗组成的抗体组合：CD3、CD4、CD8、CD68、FOXP3、PD-1、PD-L1 和 pan-Cytokeratin¹⁴。该标记物组合可用于肿瘤组织的免疫表型分析，并识别存在于肿瘤或间质微环境中的细胞类型。本方案采用自动化载片染色仪完成初始染色及探针更换循环，整个染色与成像过程可在2天内完成。文中还展示了多重免疫荧光检测的验证方法以及对所得图像进行分析的技术。

方案

所有实验必须遵循机构内人体研究伦理委员会的指导方针。本方案中使用的所有组织切片均来自外部组织供应商。

1. 组织样本制备

1. 选择将使用多重免疫荧光（mIF）检测进行染色的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块。若使用FFPE组织切片，请确保样本厚度为3-5 µm，置于带正电荷的玻片上，且无皱褶或其他撕裂，以免影响最终结果。
   注意：为获得最佳结果，避免对超过2个月前切片的组织样本进行染色。此外，避免使用储存超过10年或外观明显干燥的组织块。
2. 若使用FFPE组织块，请使用切片机将组织切成所需数量的4 µm厚切片，并将切片贴附于带正电荷的玻片上。为获得最一致的结果，所有切片应保持相同的方向贴附。确保组织无皱褶和撕裂。
3. 若样本不立即染色，可将其置于氮气环境下的切片盒中保存，最长可保存2个月。

2. 初始设置中辅助试剂和一抗的注册

1. 在自动染色机软件中，点击屏幕顶部的“试剂设置”选项卡。点击添加以新增试剂。
2. 染色和交换实验将使用九个试剂容器，具体信息见表1。例如，为第一个名为“洗涤缓冲液”（缩写为ISPWsh1）的试剂进行设置时，请按以下步骤操作：选择类型为辅助试剂，并确认*BWash和DI均列于“兼容的主缓冲液”中。保存前请勾选首选框。
3. 根据表1中的名称和缩写，对剩余的辅助试剂重复上述操作。
   1. 扩增溶液试剂（ULTAmp1）与Bond Wash不兼容。在该试剂的设置窗口中，请选择*BWash，然后点击<<按钮，将该试剂从“兼容试剂”列表移至可用试剂区域。若未将Bond Wash从扩增溶液试剂的兼容列表中移除，可能导致检测染色性能显著下降。
4. 完成所有试剂容器注册后，在开始首次运行前创建一个研究用检测试剂盒。该检测试剂盒需包含一个30 mL的滴定容器。
5. 将30 mL滴定容器添加至检测试剂盒中。为防止两者分离，请用胶带将滴定容器固定在检测棒上。
6. 扫描检测试剂盒左侧的条形码。在弹出窗口中为该试剂盒命名（例如：InSituPlex试剂盒）。将有效期设置为注册日期起10年。
   注意：此处设置的有效期并非试剂瓶上标注的日期，而是滴定容器中试剂的有效期。将有效期设为较远的未来可确保试剂盒不会无故过期。
7. 在试剂盒的第一个试剂位置，从下拉菜单中选择洗涤缓冲液作为对应试剂。
8. 点击该试剂位置的条形码输入框，扫描已固定好的30 mL滴定容器上的条形码，以注册该容器为洗涤缓冲液，并将试剂容器与检测棒关联。
9. 滴定容器与试剂盒关联成功后，点击添加按钮保存并关闭弹出窗口。
10. 向滴定容器中加入30 mL的1× Bond Wash溶液，并在每次染色运行之间于4 °C冷藏保存。

表1：实验设置所需的辅助试剂。 请点击此处下载该表格。

3. 初始实验方案设置

1. 完成所有试剂容器的成功注册后，导航至自动染色机软件屏幕顶部的“实验方案设置”选项卡。
2. 通过点击屏幕右上方的 Logo 确认当前运行的软件版本。弹出窗口将在“软件信息”标题下列出当前安装的软件版本。
3. 如果软件版本为 7.0 或更高版本，则系统中已预装染色实验方案模板。在屏幕底部，确认“首选状态”选择已设置为“全部”。将该模板协议命名为 *ISP 染色实验。对于早期版本的软件，可在 表 2 中找到该实验方案。
4. 右键点击 *ISP 染色实验 并复制该实验方案。在弹出的窗口中，将实验方案重命名为“染色实验 1”，并设置简写名称为 (ISP_IHC1)。
5. 在“首选检测系统”下，选择在步骤 2.6 初始试剂设置期间创建的检测系统。

表2：多重免疫荧光染色方案。*MARKER 对应抗体溶液，Wash Buffer 对应 BOND 洗涤液。所有其他辅助试剂均有名称相对应的试剂盒组分。本方案适用于软件版本 7.0 及以上、BXD 39 及以上版本。请点击此处下载该表格。

4. 试剂准备

1. 除抗体偶联物、扩增酶、交换引发剂和交换中和剂外，将所有试剂盒试剂在室温下解冻。其余试剂盒组分储存于 -20 °C，直至使用。
2. 若尚未完成，请为步骤 2.3 中定义的每种试剂注册一个新的滴定容器，并在每个容器中放入一个新的滴定插件。
3. 取出步骤 2.6 中已注册的研究检测系统，确保相关的洗涤缓冲液容器中已加入 30 mL 的 1x Bond 洗涤液。将每种试剂的滴定容器放入该系统中。
4. 在相应的容器中配制抗体稀释液。所需体积为 350 + (150 µL × 载玻片数量)，使用试剂盒提供的抗体稀释液配制。解冻后涡旋震荡缓冲液以充分混匀。
5. 在抗体染色溶液 1 容器中配制抗体染色溶液。将所有抗体以 1:100 的比例加入提供的抗体稀释液中。所需体积为 350 + (150 µL × 载玻片数量)。切勿涡旋震荡抗体原液或完整的抗体染色溶液，仅通过移液混匀。
6. 在预扩增混合液容器中配制预扩增混合液。所需体积为 350 + (150 µL × 载玻片数量)，使用试剂盒提供的预扩增混合液配制。解冻后涡旋震荡该溶液以混匀。
7. 在扩增溶液容器中配制扩增溶液。所需体积为 350 + (150 µL × 载玻片数量)，由扩增酶以 1:10 的比例在扩增缓冲液中稀释而成。切勿涡旋震荡扩增酶或已完成的扩增溶液，仅通过移液混匀。
8. 在核复染容器中配制核复染液。所需体积为 350 + (300 µL × 载玻片数量)，由提供的核复染溶液以 1:100 的比例在超纯水中稀释而成。通过涡旋震荡混匀。
9. 在荧光探针容器中配制对应第一轮成像的荧光探针混合液。所需体积为 350 + (450 µL × 载玻片数量)，由荧光探针 1 溶液以 1:20 的比例在探针缓冲液中稀释而成。解冻后对各组分以及最终的完整混合液进行涡旋震荡。
10. 所有试剂配制完成后，将其放入对应的容器中，并将完整的试剂棒插入软件系统，以便测量试剂体积。

5. 运行设置

1. 所有试剂准备就绪后，进入软件顶部的“载玻片设置”选项卡，点击新建研究按钮。根据需要添加研究编号、研究名称和研究备注。可参考图2作为示例。
2. 在加样体积部分，选择150 µL，并将预处理程序设为*Dewax 4步骤。如果下拉菜单中未显示*Dewax 4步骤，请在“程序设置”菜单中找到该程序，并勾选首选框。然后点击确定。
3. 研究创建完成后，在载玻片设置界面右侧点击添加载玻片按钮。在“载玻片备注”栏中为每张载玻片命名，确保名称唯一。
4. 在本界面的其他字段中，将组织类型设为测试组织，加样体积设为150 µL，染色模式左侧下拉菜单选择单次，右侧下拉菜单选择常规。在处理流程中选择IHC，标记物选择抗体染色液。
5. 在“添加载玻片”窗口的程序部分，染色程序选择染色检测1，预处理程序选择*Dewax 4步骤，HIER程序选择*HIER 20分钟使用ER2。酶处理程序保持为*----。设置完成后，点击添加载玻片。可参考图2作为示例。
6. 根据本研究所需运行的载玻片数量，重复上述操作，并确保每次添加载玻片时更新“载玻片备注”字段，以便后续能够唯一识别每张载玻片。所有载玻片添加完毕后，关闭“添加载玻片”窗口，并打印所有标签，将其贴至对应的组织切片上。
7. 将每张载玻片放入托盘中，并在每个组织切片上放置盖片，然后将托盘装入仪器。试剂和载玻片加载完成后，在软件右侧选择对应的自动染色机。选择后，软件将显示全部三个载玻片托盘以及所有试剂的信息，包括批量试剂和试剂准备阶段添加的试剂。
8. 确认批量试剂容器已加满，废液容器有足够的剩余容量以完成本次运行，然后点击运行按钮开始实验。
9. 每次运行约需5小时15分钟完成。请记录结束时间，并在程序完成后立即从自动染色机中取出载玻片。

图 2：软件操作提示。（A）Autostainer 软件中的新建研究提示，显示多重免疫荧光（mIF）染色方案的正确设置。（B）软件中的添加玻片提示，显示 mIF 染色方案的正确设置。请点击此处查看此图的放大版本。

6. 成像

1. 染色程序完成后，从封片剂中取出染色的载玻片和盖玻片。在避光条件下让封片剂充分固化，直至盖玻片牢固固定（通常需1小时或更长时间，可在此暂停）。
2. 使用配备适当滤光片的荧光显微镜或全片扫描仪对载玻片进行成像。本实验所用染料通常与DAPI、FITC、TRITC、Cy5和Cy7的滤光片兼容。
3. 成像结果应与图3A中的图像相似。需目视确认组织所有区域均清晰对焦，且信号强度适当（无过曝或欠曝）。如有必要，可调整曝光参数重新成像。
4. 成像后，如需进行下一轮成像，将载玻片浸泡于1×PBS中，直至盖玻片自行脱落。（可在此暂停）

7. 交换方案的初始设置

1. 如果软件版本为 7.0 或更高版本，则系统中已预装自动染色机程序模板。在屏幕底部，确认首选状态选项设置为“全部”。该模板程序的名称为 *ISP Signal Exchg。对于较早版本的软件，可在表 3中找到该程序。
2. 右键点击*ISP Signal Exchg 并复制该程序。在弹出的窗口中，将程序重命名为“Exchange Protocol 1”，简称 ISPEXCH1。在继续操作前，请确保已勾选“首选”复选框，并分配与步骤 2.6 中设定相同的试剂盒名称。

表3：多重免疫荧光信号交换实验方案。 洗涤缓冲液对应BOND洗涤液。所有其他辅助试剂均有名称相对应的试剂盒组分。本方案适用于软件版本7.0及以上、BXD 39及以上型号。请点击此处下载该表格。

8. 交换程序的设置与运行

1. 在室温下解冻交换缓冲液。交换中和剂和交换启动剂在使用前需保持在 -20 °C。进行交换程序需要两个试剂滴定容器和一个检测试剂盒。
2. 在相应的容器中配制交换溶液。所需体积为 350 + (450 µL × 载玻片数量)，由交换启动剂以1:500比例稀释于交换缓冲液中组成。切勿涡旋震荡交换酶或已配制完成的交换溶液，仅通过移液操作进行混匀。
3. 在“荧光探针2”容器中配制第二荧光探针混合液。所需体积为 350 + (450 µL × 载玻片数量)，由荧光探针2溶液以1:20比例、交换中和剂以1:40比例共同稀释于探针缓冲液2中组成。荧光探针混合液和探针缓冲液可进行涡旋震荡，但交换中和剂及最终混合溶液仅可通过移液操作混匀。
4. 所有试剂准备完毕后，将完整的加样棒装入自动染色仪，使仪器对试剂进行浸入测试。
5. 按照步骤5添加所有载玻片。在添加载玻片过程中，将标记更改为 *Negative。对于“前处理”、“HIER”和“酶处理”步骤，选择 *---- 选项，因为交换程序无需脱蜡或抗原修复。完成设置后，点击 添加载玻片。
6. 根据实验所需载玻片数量重复此过程，并确保每次添加载玻片时更新“载玻片备注”字段，以便后续能够唯一识别每张载玻片。
7. 所有载玻片添加完毕后，关闭“添加载玻片”窗口，打印所有标签并将其粘贴至对应的组织切片上。
8. 将每张载玻片装载到托盘上，并在每个组织切片上方放置覆盖片，然后将托盘载入软件系统。
9. 当所有试剂和载玻片均添加完成后，在软件中选择对应的自动染色仪；该选项位于右侧。选择后，软件将显示全部三个载玻片托盘以及所有试剂的信息，包括批量试剂和试剂准备过程中添加的试剂。
10. 确保批量试剂容器已加满，废液容器有足够的剩余容量以完成整个运行过程。
11. 确认无误后，按下 运行 按钮开始程序。该程序约需90分钟完成。请记录结束时间，并在运行完成后立即取出载玻片。

9. 成像

1. 按照步骤5，对新一轮探针重复进行成像。图像将如图3B所示。

10. 叠加（用于 >4-plex 蛋白质成像）

1. 同一张切片现在将存在多张图像。使用图像共定位软件将这些图像合并，生成一张叠加的8重图像。
2. 按以下步骤对每一轮的图像进行共定位：
   1. 每轮图像的命名格式如下：_，其中为切片的唯一名称（条形码），为一个字符串，按字母顺序排序时可使第一轮图像排在第一位，第二轮图像排在第二位。例如，当 = 1234ABC时，文件名可能为1234ABC_Round1和1234ABC_Round2，所有文件均带有扫描仪对应的适当扩展名（如.czi）。将所有轮次的图像文件放入一个名为“Source Images”的文件夹中。
   2. 在共定位软件中，点击用户界面中“源图像目录”部分的Set按钮，随后选择上述创建的Folder Created Above文件夹。
   3. 在“源图像”部分将文件类型设置为源图像的扩展名（例如.czi、.qptiff等）。软件现在将在表格中同时显示两轮图像，表明切片1234ABC包含两张轮次图像。
   4. 如需将输出的叠加图像保存至与源图像文件夹不同的目录，请使用用户界面中“叠加图像目录”部分的Set按钮，并选择Desired Output文件夹。否则，默认使用源图像文件夹。
   5. 默认情况下，软件仅生成堆叠图像的.afi文件。请在处理选项部分勾选“保存整个堆叠图像的OME.tif文件”选项。
   6. 为验证整个样本范围内的共定位准确性，请在界面的输出部分勾选Validation选项。
   7. 点击START按钮以开始图像共定位。

11. 图像分析

1. 载玻片成像后，可使用任意选择的分析方法对载玻片进行可视化和分析，例如 Ultivue 的 STARVUE 图像处理套件或 QuPath¹⁵。

结果

按照上述方案，对FFPE组织进行多靶点染色，并已获得每四个标志物一组的高质量图像（图3A、B）。图像共定位软件可将同一张切片的图像进行合并与共定位，如图3C所示。对于结直肠癌（CRC）组织切片，图4展示了类似的结果。

应通过评估预期的染色模式来判断实验方案是否成功。在所示的结直肠癌（CRC）示例中，每个标记靶点均在预期的亚细胞区域表达，例如核内表达的FoxP3、膜上表达的CD3以及胞质内表达的CD68（图4B-D）。每个功能性靶点均在相应细胞类型上表达，例如PD1与CD3的共定位以及PDL-1与CD68的共定位，分别代表耗竭的T细胞和具有免疫抑制功能的巨噬细胞。良好的信噪比评估通常由病理学家或图像分析专家通过定性方式完成，以区分真实的阳性信号与潜在的背景噪声，从而确认染色质量，确保后续图像分析的顺利进行。为进一步验证染色的质量与性能，可增加与连续切片上金标准免疫组化（IHC，显色DAB法）的比较（见图5示例），同时可使用阳性对照组织样本（如人扁桃体组织），后者对大多数免疫靶点而言均有助于确认本次染色实验的成功。需要注意的是，肿瘤组织中某些靶点的表达水平可能低于人扁桃体组织¹⁶。

在定性确认结果后，可进行定量分析。本研究中的定量分析主要包括计算表达特定靶标的各类表型的细胞密度（细胞数/mm²），以及计算可在较宽动态范围内表达的功能性靶标的平均信号强度水平。在评估多重免疫荧光（mIF）检测的精密度时，使用相同标记物染色的连续切片应在不同玻片间呈现可比较的信号，这可在图6中通过肉眼观察判断。不同组织类型中单个标记物密度的定量分析示例结果见图7。对这些图像进行图像分析可识别阳性细胞，并针对每个标记物计算相应的阳性细胞密度以及每个阳性细胞的平均信号强度。由此可计算每个标记物的变异系数（CV），以评估多重检测的精密度（Table 4）。

图3：通过8重免疫荧光染色方案中连续染色轮次获得的组织微阵列（TMA）核心图像。（A）第一轮成像获得的图像，包含标记物CD8、PD1、PD-L1和CD68。经过交换染色程序后，（B）显示在同一张切片上第二轮标记物CD3、CD4、FoxP3和CK/SOX10的第二轮成像结果，（C）为将图像（A）和（B）共定位叠加后的合成图像。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：结直肠癌（CRC）组织的8重免疫荧光染色代表性结果。 该图展示了通过在同一细胞内共定位多个靶标可识别的细胞表型。（顶部）CRC组织的全切片图像。（底部）组织区域的详细视图，突出显示：（A）调节性T细胞（CD3+/CD4+/FOXP3+）；（B）肿瘤和间质中表达PD-1和PD-L1的细胞；（C）耗竭型细胞毒性T细胞（CD3+/CD8+/PD-1）；（D）逃避免疫的肿瘤细胞（PD-L1+/CK+）以及具有免疫抑制功能的巨噬细胞（CD68+/PDL1+）。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：免疫组织化学（IHC）与免疫荧光（IF）染色的定性比较。连续切片分别进行单标志物免疫组织化学染色（DAB，第一行）、单标志物免疫荧光染色（ISP单重）以及多重免疫荧光的单通道成像（ISP多重），显示不同染色方法之间具有良好的定性一致性。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：连续切片染色。（A）显示多组织TMA布局的示意图。（B）TMA中每种组织类型组织芯的代表性8重图像。（C）在单次染色运行中，扁桃体组织芯在六个连续TMA切片中CD8的代表性图像。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：TMA中包含的每种组织类型的单标记密度定量。 每种组织的密度为TMA切片上每种组织类型三个代表性组织芯的平均密度。y轴表示x轴上不同组织类型的单标记密度，单位为阳性细胞/mm²。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 8：本方案所述扩增型 ISP 多重免疫荧光（mIF）与间接免疫荧光（IF）相对荧光信号的感兴趣区域（ROI）分析。（A）分别针对 CK（左）或 PD-L1（右）染色的代表性切片，标示出五个 ROI。（B）CK（上）和 PD-L1（下）的代表性 ROI 图像。（C）CK 和（D）PD-L1 在五个 ROI 中的平均信号强度，每个 ROI 为 100 µm × 100 µm，约含 200 个细胞。Y 轴数值表示任意荧光单位，误差棒表示标准差（n=3）。(E) 扩增型 ISP mIF（紫色）与间接 IF（蓝色）的相对信号强度通过计算所有 ROI 中扩增型 mIF 信号均值与间接 IF 信号均值的比值得出。请点击此处查看该图的放大版本。

表4：计算的变异系数（CV）。 扁桃体图像中阳性细胞密度和平均信号强度的CV值如图6所示。请点击此处下载该表格。

讨论

本报告描述了一种使用自动染色仪进行高通量、高灵敏度多重免疫荧光染色的实验方案。在执行该方案时，试剂制备步骤至关重要，需特别注意。必须确保试剂混合充分且准确量取，以尽量减少同一次运行中不同载玻片之间，或使用相同组分的不同运行之间的染色差异。

执行本方案时常见的问题包括加样前未充分混匀试剂，以及因脱片处理不当可能导致组织丢失。尽管该染色方案适用于任何类型的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织，包括各类癌组织，但某些组织类型可能需要更加谨慎地操作（例如，高脂肪含量的组织）。为避免组织脱落，应让已加盖玻片的切片浸泡足够长的时间，直至盖玻片自行脱落。切勿强行移除盖玻片或用工具撬开玻璃片。

一个局限性是，尽管免疫肿瘤学中许多最常用的靶标已经过验证并可直接使用，但某些靶标在纳入多重检测面板之前可能需要进行检测方法开发。尽管这一过程相对较快，但在能够使用定制的多重检测面板之前，仍可能需要额外几周时间。

该检测方法与其他多重免疫荧光技术之间存在若干差异。与直接和间接免疫荧光技术相比，此处展示的检测方法具有显著更高的信号放大水平，从而显著改善信噪比，尤其在易出现组织自发荧光的通道（如FITC通道）中效果更为明显。根据全切片强度分析和基于手动ROI的分析定量结果，该方法产生的信号强度约为直接免疫荧光的30倍，间接免疫荧光的10倍（图8）。该方法可在显著缩短曝光时间的条件下实现对靶蛋白更灵敏的检测，同时避免了图像处理操作（如背景扣除），从而消除了低强度信号被误去除的风险。

与基于酶催化扩增的多重免疫荧光（mIF）检测相比，本检测方法在多重检测能力方面显著提升，同时具有更简便的操作流程和通常更短的检测时间（图1）。在本方法中，抗体在单一步骤中同时加入并同步扩增，从而极大地简化了检测流程。此外，某些基于酶的技术（如酪胺信号放大技术，TSA）可能会出现不同抗体之间的干扰，即所谓的“伞状效应”^12,17,18。本研究所采用的扩增技术避免了这一问题，能够实现对同一细胞上多个共定位和共表达标志物的检测，如图4所示。

大约90%的人类癌症起源于上皮细胞¹⁹。这是因为上皮细胞通常是抵御外界环境的第一道防线，且增殖速度较快，从而更容易快速积累潜在的致癌突变。在此过程中，炎症在肿瘤的发生、发展和扩散中起着关键作用。在过去十年中，许多靶向免疫检查点抑制剂和免疫细胞的疗法已成为对抗多种肿瘤类型的有力手段^5,20,21。然而，仍有相当一部分患者对治疗无反应。这很可能与肿瘤微环境（TME）及局部免疫格局密切相关。通过分析大量患者中与药物反应差异相关的TME分子特征，或许能够更准确地定义治疗性生物标志物。本报告表明，多重免疫荧光（mIF）技术可用于并行分析数百张完整组织切片或肿瘤微阵列样本中的多种蛋白质生物标志物，包括低表达水平的标志物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗 CD3	Ultivue		克隆 BC33（BioCare）。属于 ULT50801
抗 CD4	Ultivue		克隆 SP35（Abcam）。属于 ULT50801
抗 CD68	Ultivue		克隆 KP1（BioCare）。属于 ULT50801
抗 CD8	Ultivue		克隆 C8/144B（BioCare）。属于 ULT50801
抗角蛋白 + 抗 SOX10	Ultivue		克隆 AE1/AE3（Bethyl Labs）和 BC34（BioCare）。属于 ULT50801，以混合物形式提供
抗 FOXP3	Ultivue		克隆 236A/E7（Thermo）。属于 ULT50801
抗 PD1	Ultivue		克隆 CAL20（Abcam）。属于 ULT50801
抗 PDL1	Ultivue		克隆 73-10（Abcam）。属于 ULT50801
Axioscan.Z1 显微镜	Zeiss		文中称为荧光显微镜
Bond 脱蜡液	Leica	AR9222
Bond 抗原修复液 2	Leica	AR9640
Bond 开放式容器，30 mL	Leica	OP309700
Bond 研究用检测试剂盒	Leica	DS9455
Bond 滴定插入件	Leica	OPT9049
Bond 滴定试剂盒	Leica	OPT9719
Bond 通用盖片	Leica	S21.4611
Bond 洗涤液 10 倍浓缩液	Leica	AR9590
BondRX 自动染色机	Leica		文中称为 "自动染色机"
BondRX 软件	Leica		版本 6.0 或更高
盖玻片，#1.5 厚度	Corning	2980-244
乙醇，200 证明	VWR	89370-084
FFPE 组织块	BioIVT		组织类型各异
OmniVUE 8 重检测（CD3、CD4、CD8、CD68、FOXP3、PD-1、PD-L1、泛角蛋白/SOX10）	Ultivue	ULT50801	包含所有其他 Ultivue 组分
磷酸盐缓冲液（PBS）	Boston BioProducts	C-9911F	（pH 7.4，含 2.7 mM KCl 和 137 mM NaCl）
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Thermo	P10144	文中称为 "封片介质"
UltiAnalyzer.AI	Ultivue
UltiStacker.AI	Ultivue
Ultivue 扩增缓冲液	Ultivue		属于 ULT50801
Ultivue 抗体稀释液	Ultivue		属于 ULT50801
Ultivue 交换缓冲液	Ultivue		属于 ULT50801
Ultivue 交换引发剂	Ultivue		属于 ULT50801
Ultivue 交换中和剂	Ultivue		属于 ULT50801
Ultivue 荧光探针 1	Ultivue		属于 ULT50801
Ultivue 荧光探针 2	Ultivue		属于 ULT50801
Ultivue 预扩增混合液	Ultivue		属于 ULT50801
Ultivue 探针缓冲液	Ultivue		属于 ULT50801
超纯水	Sigma-Aldrich	W4502