本文介绍了一种在蛹期对Drosophila腿部进行长期活体成像的实验方案，涉及完全去除蛹壳。该方案也可应用于其他组织。
本文内容
摘要
摘要
在过去的几十年中，人们对细胞命运决定的机制已经有了显著的认识进展。然而，已决定命运的细胞如何形成三维生物体形态的过程仍不清楚。共聚焦显微镜技术的最新进展推动了通过活体成像观察发育过程中细胞动态的研究工作。 黑腹果蝇 蛹因其静止不动、蛹壳透明以及存在荧光报告基因品系，是活体成像的理想材料。成像的主要挑战在于围蛹壳，即包裹蛹体的外骨骼结构，会阻碍光学成像。以往的方法通常需要部分或完全去除围蛹壳，但在此操作后长期维持蛹的存活能力一直存在困难。本文介绍一种简单的方法，可用于持续数天的活体成像 果蝇 蛹期腿部发育的完整蛹壳去除方法。该方法包括将粘附于双面胶带上的蛹的蛹壳去除，随后在玻璃底培养皿上构建一个小室，以容纳蛹及一滴水，从而将其封闭。此装置操作简便、结果可靠，并通过防止干燥显著延长蛹的存活时间，支持长期活体成像 果蝇 蛹期显著促进了对成体腿部在2-3天内发生剧烈三维结构变化过程的观察。这些变化包括上皮细胞短暂形成一种引人注目的结构（类似帕特农神庙的结构）、组织快速变窄、关节形成以及刚毛伸长。该方法适用于多种组织的观察，并可潜在地与其他技术（如光学基因诱导）结合，以深化对蛹期组织最终形态建成过程中细胞动态的理解。
引言
尽管在过去几十年中，细胞命运决定机制的研究已取得显著进展，但已决定命运的细胞如何构建出三维生物体形态仍不清楚。近年来，得益于共聚焦显微镜技术的进步，通过活体成像揭示发育过程中细胞动态的研究尝试日益增多1,2。该 黑腹果蝇 蛹因其适合的特性而成为活体成像的优选材料：个体静止不动、蛹体角质层透明，以及存在多种可用的荧光报告基因品系3,4,5进行活体成像的最大障碍是 果蝇 蛹壳（蛹的外壳）是由末龄幼虫表皮变形并鞣化形成的，包裹在蛹体外。为避免光学干扰，在此前报道的方法中，蛹壳被部分或完全去除。1,2,3,4,5,6,7,8,9,10完全去除蛹壳可最大化观察区域并提高对多种组织的适用性。然而，失去蛹壳的蛹通常在约半天内死亡，推测是由于脱水所致。因此，维持蛹体水分对于延长活体成像至关重要。尽管此前方法中完全去除蛹壳后蛹体存活的确切时长尚不明确，但已有报道的实例通常最多维持约20小时。由于蛹期持续约四天，若能实现更长时间的活体成像，将有助于完整捕捉组织形态形成的全过程。
成年 Drosophila 的腿部是研究三维组织形态形成过程的优良模型。它起源于幼虫阶段形成的盘状原基（腿原基）。成虫腿部各节段对应的区域在前蛹期已确定11。随后，腿原基从中央区域向外突出，于蛹壳形成后约 11 小时（APF）发育成一个膨胀的管状结构。这种结构简单的组织如何在后续发育阶段实现成虫腿部的最终形态，长期以来尚不明确。已有若干研究探讨了这一问题12,13,14。但由于这些研究观察的是固定或体外培养的组织，无法连续追踪单个细胞的动态变化，所获信息较为零散。要全面理解形态建成过程，必须通过长期活体成像对单个细胞的动态进行连续观察。
最近一项研究通过长期活体成像揭示了组织和细胞水平上三维结构的动态形变（图1）。该研究中最引人注目的发现是上皮细胞短暂形成了一个出乎意料的复杂结构。这一结构被称为“"类帕特农结构"”，其特征是上皮细胞具有顶-基底方向的突起以及基底侧网状连接。重要的是，该结构的形成与消失与组织快速变窄过程相吻合15。随后的形态发生过程，包括关节形成和刚毛伸长，持续进行了2至3天。长期活体成像有效捕捉到了这些持续数天的连续事件的完整过程。
本文提供了一种逐步操作的方法，用于在完全去除蛹壳的情况下，对果蝇（Drosophila）蛹期腿部进行持续数天的活体成像。该方法易于实施，也可应用于其他多种组织。
方案
本方案使用表达荧光报告基因的 Drosophila melanogaster 品系15。研究中所用试剂与仪器的详细信息见材料表。
1. 蛹的制备
- 使用画笔收集所需品系的白色蛹 黑腹果蝇 从冻存管中取出并放入培养皿或空冻存管中（图 2A).
注意：在本研究中， "白化蛹" 指幼虫完全停止活动至蛹壳变褐之前的阶段。在25 °C条件下，该阶段持续约30分钟。 - 将白色蛹在 25 °C 下孵育至少 14 小时，直至发育至待观察的阶段（图2B).
注意：蛹壳只有在羽化后12-13.5小时（APF）蛹体角质层完全形成后方可移除，且在14小时APF之后才易于移除。 - 用浸有蒸馏水的画笔将胶水和果蝇食物从蛹壳上擦拭干净。
注意：蛹壳的腹面应特别清洁，以确保在后续步骤中能充分粘附于双面胶上。 - 将蛹置于清洁湿巾上数分钟以晾干。
注意：蛹壳上残留的水分会妨碍其与双面胶带的良好粘附。 - 在载玻片上固定一片双面胶带。
- 将干燥的蛹置于双面胶带上，腹面朝下（图2C).
- 用干燥的画笔轻轻推动蛹的背面，以使其更好地粘附于双面胶带上。
- 在体视显微镜下，用镊子小心打开鳃盖图2 D，E).
注意：蛹壳的前背区是成虫果蝇羽化时突破的位置，因此易于打开。 - 从打开的蛹壳边缘，将镊子的一端插入蛹与蛹壳之间的空隙中（图2F).
注意：使用镊子时切勿损伤蛹的角质层。 - 用镊子夹住蛹壳，向外拉动直至其破裂。
- 用镊子提起蛹壳的撕裂碎片，并将其粘附到双面胶带上（图2G).
- 重复步骤1.10–1.11，直至蛹壳的开口延伸至末端，仅保留一小部分蛹壳图2 H，I).
注意：若蛹体有液体流出，则说明其已被损伤（图2K）。为了观察正常发育过程，应避免对受损的蛹进行成像。
2. 成像设置
- 在玻璃底培养皿底部加入 1 µL 蒸馏水或硅油（使用硅油浸没物镜时）。
- 将画笔浸入蒸馏水中，轻轻挑起蛹（图 2J）。
- 将蛹腹面朝下放置于蒸馏水或硅油中（图 2L）。
- 用移液器在玻璃底培养皿玻璃区域边缘附近加入 10 µL 蒸馏水（图 2L）。
- 用注射器在玻璃底培养皿玻璃区域边缘周围涂一圈硅脂（图 2M）。
- 将盖玻片置于硅脂上以密封（图 2M）。组装示意图见 图 2N。
注意：确保盖玻片与硅脂之间无任何缝隙。
3. 共聚焦成像
- 开启倒置共聚焦激光显微镜及成像软件。
- 将培养皿放置于倒置共聚焦显微镜的载物台卡槽中。
- 使用低倍物镜在明场模式下找到蛹体，并确认蛹体无体液渗漏现象。
- 将待观察蛹体的目标区域（ROI）置于视野中央。
注意：第一和第二对足跗节的前外侧，以及第三对足跗节的腹侧，均朝向蛹体的腹面。因此，在第一和第二对足中可观察到沿背腹轴方向的跗节纵切面，而在第三对足中则可观察到沿前后轴方向的纵切面。 - 更换为适用于活体成像的物镜。
注意：若使用水浸物镜，在长时间观察过程中，物镜与玻底培养皿之间的水会逐渐蒸发。建议使用非浸入式或硅油浸入式物镜。 - 调整成像参数以满足观察需求，并开始数据采集。
注意：为避免对蛹造成损伤，激光功率应尽可能调至最低，同时保证图像清晰。减小ROI范围并增大Z轴步进间距有助于缩短Z轴层扫所需时间。在设定Z轴层扫深度时，应考虑组织后续的形态变化。例如，在15–25小时APF期间观察足部时，由于足部显著变细，靠近盖玻片的最外侧部分（侧向表皮）会迅速向深层移动。因此，应从一开始就设置更深的Z轴层扫范围。有关在15–30小时APF期间对足跗节区域进行活体成像的共聚焦显微镜参数设置示例，请参见补充文件1。长时间活体成像过程中荧光衰减难以避免。为减轻此问题，建议使用最低激光功率。推荐使用ImageJ插件"AutoEnhance"16处理活体成像数据，以补偿荧光衰减效应。
结果
此处为发育过程中44小时的活体成像示例 果蝇 蛹期成虫腿部的发育过程被描述。表达 His2Av-mRFP 的果蝇17 （标记细胞核）和 sGMCA18 （标记肌动蛋白的GFP标签肌动蛋白结合蛋白Moesin）在白色蛹期采集，并在25°C下孵育15小时 25 °C。按照方案去除蛹壳并进行制片（图2）。在室温下（无需严格控制，但需接近室温），从羽化后16小时至60小时期间，每隔15分钟成功获取了腿部末端跗节和前跗节的Z轴层扫图像 25 °C）。该系列图像的前半部分如图所示 图3，后半部分在 图4, 以及整个过程的视频 视频 1随着腿部组织迅速变窄，上皮细胞短暂地形成了一种引人注目的结构，即类似帕特农神庙的结构，其特征为具有顶端-基底方向的突起和基底连接（图3）。即使在轮廓几乎完成之后，仍可观察到上皮层厚度的减少（图4）。整个过程概述如下 图1.
图1最终形态形成的概述 果蝇 蛹期成虫的跗节 整个过程根据长期活体成像实验中观察到的组织和细胞水平的形态学变化，分为五个阶段。左侧展示了对应若干时间点的代表性照片或表面渲染图像（sGMCA信号），右侧简要描述了各阶段发生的事件。该图改编自Hiraiwa等人的研究。15参见 视频 1. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图2：活体成像的蛹壳去除与封片组装。（A）在培养皿中收集的一只白色蛹。（B）（A）中的蛹在25 °C下培养15小时后的状态。青色标记区域表示前蛹盖。（C）一张照片，显示一只蛹粘附在一段双面胶带上。（D–J）一系列图像，展示去除蛹壳的操作过程。（D）用镊子抬起前蛹盖。（E）前蛹盖被移除。（F）将镊子尖端插入蛹体表皮与蛹壳之间。（G）蛹壳部分打开。（H）再次插入镊子尖端。（I）蛹壳完全打开，仅后端残留一小部分。（J）用画笔将蛹体轻轻挑起。（K）蛹体体液泄漏的示例。箭头指示由镊子尖刺破伤口流出的液体。（L–N）展示封片组装过程的图像与示意图。（L）从上方观察的图像，显示将蛹置于玻璃底培养皿底部，并加入蒸馏水。（M）完成封片组装后的培养皿。在玻璃区域边缘涂抹硅脂，并将盖玻片置于硅脂上以密封。（N）用于长期活体成像的黑腹果蝇（Drosophila）蛹封片组装的示意图。（O）一只已接近发育为成虫的封片蛹。（P）一只正在羽化的封片蛹。请点击此处查看该图的放大版本。
图316-27.5 小时 APF 期间跗节上皮细胞的动态形态变化 (A腹面观蛹的示意图。虚线矩形框所示区域为观察区域 (B-E）L1：第一对足，L2：第二对足，L3：第三对足。 (B，C，D，E) 表达 sGMCA（绿色）和 His2Av-mRFP（品红色）的果蝇跗节远端部分活体成像的静态图像。该组织迅速变窄，关节区域的凹陷逐渐加深。B',C',D',E') 放大虚线框选区域内的部分B、C、D、E），箭头和箭头末端分别位于（C') 分别展示了顶端-基底向投影及基底连接位置的示例。类帕特农结构从（B'），在（C')，在（D'）中开始消失，在（E'）。所有图中右侧为远端，上方为背侧。（右下角显示发育阶段B，C，D，E比例尺： B，C，D，E: 50 µm; B',C',D'，E'： 10 µm该图已根据Hiraiwa等人进行修改。15参见 视频 1. 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：羽化后41–60小时跗节上皮细胞层的形态变化。 （A,B,C,D）与图3相同的活体成像连续数据集中的静态图像。图（A,B,C,D）中虚线矩形区域分别在（A',B',C',D'）中放大显示。约在羽化后48小时（A-B'），刚毛、爪和跗垫等外部形态的伸长基本完成。凹陷关节的底部向近端移动，随后约在羽化后54小时开始形成关节球窝结构。背侧与腹侧上皮之间的形态差异变得明显（B',C',D'中的双箭头和空心双箭头）。羽化后54小时以后（C-D'），上皮层厚度减小，但节段轮廓几乎未发生变化。所有图像中，背侧朝上，远端朝右。比例尺：A,B,C,D：50 µm；A',B',C',D'：20 µm。本图引自Hiraiwa等15。另见视频1。请点击此处查看此图的放大版本。
图5：使用Bright Z功能观察腿部的示例。（A,B）表达sGMCA（绿色）和His2Av-mRFP（品红色）的果蝇第三条腿跗节区域在相同深度和发育阶段的图像，其中（B）使用了Bright Z功能，而（A）未使用。(A) 在16小时APF时采集的第三条腿跗节区域图像中，未使用Bright Z功能，提取深度为59.1 µm的XY平面图像。（A'）对应于（A）中黄色垂直线的横截面视图。（A'）中的垂直线表示（A）的焦平面。（B）在16小时APF时采集的第三条腿跗节区域图像中，使用了Bright Z功能，提取深度为61.6 µm的XY平面图像。光电倍增管电压和激光功率均经过调整，图像可见性较（A）有所改善。（B'）对应于（B）中黄色垂直线的横截面视图。（B'）中的黄色垂直线表示（B）的焦平面。请点击此处查看该图的放大版本。
补充文件1：15-30小时蛹后（APF）活体成像腿部跗区的共聚焦显微镜设置示例。请点击此处下载该文件。
视频 1：跗节远端部分持续 44 小时的长期活体成像。实验使用表达 sGMCA（绿色）和 His2Av-mRFP（品红色）的果蝇。该图像数据集与图 3 和图 4 来自同一样本，从中提取了最具代表性的 XY 平面。箭头指示未来关节区域的示例。组织中快速移动的细胞为类巨噬细胞。沿跗节各节段延伸的丝状信号为隔膜的一部分。时间戳显示格式为 hh:mm。图像右侧为远端，上方为背侧。本视频改编自 Hiraiwa 等人15请点击此处下载该文件。
讨论
本文提供了一种对果蝇（Drosophila）蛹期腿部进行长期活体成像的详细实验方案。腿部成虫盘从中央向外突出形成管状结构，随后在蛹期完成成体腿部的最终形态建成，但该过程此前一直不甚清楚。以往对这一过程的观察主要依赖固定染色、组织培养和扫描电子显微镜12,13,14。这些方法无法连续追踪单个细胞的动态变化，仅能获得片段化的信息。本研究所描述的方法可利用共聚焦显微镜实现持续数天的连续活体成像，成功观察跗节区域最终形态建成的过程，并能够对单个细胞的动态变化进行持续追踪。近期的一篇研究报告中已详细描述了该活体成像所揭示的引人入胜的细胞动态行为15。
为了成功实现长期活体成像，关键在于维持蛹的存活能力，并确保其发育过程不受影响。在本方法中，去除蛹壳的蛹在多数情况下能够正常发育为围蛹期成虫及成虫（图2O、P）。通过本方法观察到的跗节发育过程中形态变化的时间点，与先前报道的结果一致12,13,14。此外，即使在48–60 h APF（固定后32–44 h），上皮细胞仍表现出厚度减少等变化（图4B'–D'）。这些结果表明，在采用本方法进行长期活体成像期间，蛹仍保持完整，其正常发育几乎未受到干扰或延迟。请注意，接受活体成像的去蛹壳蛹的存活能力可能因蛹壳去除的时间、操作过程中的处理方式、成像过程中光毒性程度以及所使用的果蝇品系而有所差异。
确保蛹保持完整及其正常发育的关键步骤之一是在不损伤蛹的情况下移除蛹壳。将蛹稳定地粘附在双面胶带上，并小心使用镊子进行操作，是成功的关键。防止蛹脱水也至关重要。在这方面，必须确保盖玻片与硅脂之间没有任何缝隙。
为避免蛹体干燥，以往许多方法均采用部分去除蛹壳的方式1,2,3,4,5,6,7。然而，若要完整观察整个蛹体，则更倾向于完全去除蛹壳。尽管目前尚不清楚蛹在完全去壳后的最长存活时间，但已有若干报道采用了完全去除蛹壳的方法8,9,10。在这些方法中，为蛹体提供湿度的最常见方式是使用湿润的滤纸。与以往方法相比，本文所述方法通过滴加一滴水的方式，更为简单便捷地实现了湿度供给。此外，许多先前的方法需要将蛹固定于载玻片上。当将去壳后的蛹置于载玻片并加盖盖玻片时，可能存在因压迫盖玻片而对蛹造成机械应力，或因盖玻片倾斜导致成像中出现噪声、畸变及清晰度下降等问题。本文所述方法采用底部为玻璃的培养皿，无需将盖玻片直接压在蛹体上，从而尽可能接近自然状态地观察组织。由于无需调整盖玻片角度，该装置稳定性高、操作简便且更可靠。因此，该方法几乎无需特殊操作技能，即使是初学者也能成功完成活体成像。
该方法的主要局限性在于观察深度和时间分辨率。在观察跗节的条件下，仅能获得约40 µm深度以内的清晰图像。使用Bright Z功能有助于解决这一问题。例如，如图5所示，通过Bright Z功能随深度增加而提高激光功率和PMT电压，可改善较深位置的图像质量。然而，提高激光功率会带来光毒性和信号衰减的权衡问题。因此，必须根据观察目的寻找最佳条件。在观察快速移动的细胞和组织时，时间分辨率同样重要。减少切片数量和缩小感兴趣区域（ROI）是解决该问题的主要方法。使用探测器灵敏度更高的最新设备或转盘共聚焦显微镜，可能有助于提高时间分辨率。另一个局限性与蛹的发育阶段有关。蛹壳仅在12–13.5小时APF时蛹体壁完全形成后才可去除，并且通常在14小时APF之后才易于去除。早于12小时APF的发育阶段可通过不剥离蛹壳直接制备样本进行部分观察15，但在该条件下，由于组织运动迅速以及蛹壳造成的光学障碍，获得清晰图像较为困难19。
故障排除
蛹壳去除困难
在去除蛹壳时，蛹壳腹面与双面胶带之间的粘附至关重要。必须清除蛹壳表面的胶水和食物残留，并进行后续干燥处理，因为湿润的表面会影响粘附效果。值得注意的是，材料表中列出的双面胶带内侧具有更强的粘性。应使用内侧（较强的一侧）来粘附蛹体。当难以去除蛹壳时，使用解剖剪刀剪开蛹壳，而非用镊子撕开，会更为有效。
蛹体液体渗漏
去除蛹壳时避免损伤蛹体至关重要。若出现蛹体液体渗漏，则表明蛹体已受损（图2K）。此类蛹体应避免用于活体成像。为防止去除蛹壳过程中损伤蛹体，除小心操作外，建议使用尖端相对宽大的镊子。
图像质量差
当荧光信号过弱时，可通过多种方式调节亮度，例如提高光电倍增管（PMT）电压、增大针孔（C.A.）、降低扫描速度以及增加激光功率。请注意，每种方法均存在副作用：提高PMT电压可能增加噪声，增大针孔会降低Z轴分辨率，降低扫描速度 会延长扫描时间，而增加激光功率则会提高光毒性和光漂白的风险。应根据感兴趣区域、荧光报告分子的种类及其表达水平，以及活体成像所需时长，合理选择成像参数。总体而言，建议在长时间活体成像中将激光功率降至最低。
荧光衰减
在长期活体成像过程中，荧光衰减是不可避免的。建议尽量降低激光功率以避免此问题。为补偿荧光衰减，在处理所获得的活体成像数据时，推荐使用 ImageJ 插件 "AutoEnhance"16。
由于完全去除了蛹壳，通过修改蛹的感兴趣区域（ROI）和方向，该方法可高度适用于其他组织。事实上，尽管在Hiraiwa等人15的研究中并非活体成像，但该方法已成功观察到腿部近端、喙、触角附近的头部上皮以及背胸部的上皮组织。这种对多种组织的适用性可能有助于进一步与其他技术（如基因的光诱导）相结合。该方法也可能适用于除黑腹果蝇（Drosophila）以外的环裂亚目（形成蛹壳的）物种。此外，若其他昆虫物种具有透明的蛹体表皮，则该方法亦可能适用于这些物种。本文为黑腹果蝇（Drosophila）研究人员提供了详细的活体成像操作指南，以捕捉活体组织中的细胞动态过程。
披露
作者声明无竞争利益。
致谢
我们感谢东京大学的Masayuki Miura博士 和东京大学的Yuya Fujisawa博士提供的技术建议，并感谢布卢明顿果蝇资源中心提供的果蝇资源。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35 毫米/玻璃底培养皿 | IWAKI | 3911-035 | |
| 清洁擦拭纸 | NIPPON PAPER CRECIA | S-200 | |
| Dumont #3c 镊子 | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Eppendorf Research plus 2-20 µL | Eppendorf | 3123000098 | |
| 果蝇品系：His2Av-mRFP, sGMCA | Bloomington Drosophila Stock Center | 59023 | |
| FV3000 | EVIDENT | 倒置共聚焦显微镜 | |
| FV31S-SW | EVIDENT | FV3000 软件 | |
| G40L | Shin-Etsu Silicone | 硅脂 | |
| 18 x 18 毫米 0.13–0.17 毫米 微型盖玻片 | MATSUNAMI | C018181 | |
| 76 x 26 毫米 0.9–1.2 毫米 微型载玻片 | MATSUNAMI | S7213 | |
| NEO-SABLE 0 号 圆头 细毛画笔 | Pentel | XZBNR-0 | 画笔 |
| SIL300CS-30CC | EVIDENT | 硅油 | |
| SZX7 体视显微镜系统 | EVIDENT | ||
| Terumo 50 毫升注射器 | Terumo | SS-50ESZ | |
| 透明双面胶带 | Scotch | 665-1-12 | 由于内层粘性比外层强，应使用内层固定蛹。 |
| UPLSAPO10x | EVIDENT | ||
| UPLSAPO40XS | EVIDENT | 硅油浸没物镜 | |
| Vannas 弹簧剪刀 - 2.5 毫米刃口 | Fine Science Tools | 15000-08 | 可选 |
参考文献
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