本方案描述了一种经济高效的方法，用于纯化、扩增和表征小鼠来源的高度均一的骨髓间充质干细胞（BMSCs）。该方法有助于获得大量具有高增殖和分化潜能的BMSCs，可支持小鼠模型研究并推动临床前研究的进展。
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方法文章
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、扩增及基于流式细胞术的表型分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
间充质干细胞（MSCs）是一类具有自我更新能力并可分化为多种细胞谱系的干细胞。其中，存在于骨髓中的间充质干细胞，称为骨髓间充质干细胞（BMSCs），在成骨作用、造血支持、归巢/迁移以及免疫抑制方面发挥着关键作用。由于其在细胞治疗策略中的潜力，以及易于获取、遗传稳定性高和免疫原性低等特点，BMSCs被广泛应用于细胞生物学和组织工程研究。造血干细胞（HSCs）与BMSCs共存于骨髓中，但来源于不同的前体细胞。在从骨髓提取细胞时，通常会获得多种细胞类型，可能导致细胞群体的异质性，从而引发实验偏差，难以满足高标准的实验要求。因此，建立有效的技术以提高体外培养中BMSCs的纯度和得率至关重要 in vitro。本研究提供了一种从BALB/c小鼠中分离BMSCs的详细方案，包括纯化、扩增及基于流式细胞术的表型鉴定。通过流式细胞术对第3代BMSCs的均一性和干细胞表型进行表征，结果显示其对CD29、CD44和Sca-1呈阳性，对CD45和CD31呈阴性，并证实其具备成骨和成脂分化能力。该方案成本低、操作简便高效，可获得数量充足、均一性高且具有强增殖与多向分化潜能的BMSCs，对于推动小鼠模型研究及广泛的临床前研究具有重要意义。
引言
骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其多向分化潜能特性而广为人知，且由于具有自我更新、分化和免疫调节特性，已被广泛应用于多种疾病的治疗1,2。BMSCs易于获取，可大量扩增，具有免疫抑制特性，且不会引发即刻的免疫反应3，因此在组织工程应用及作为细胞治疗的有效载体方面具有广阔前景。
在骨髓中，两种主要的干细胞群体及其后代——造血干细胞和骨髓间充质干细胞（BMSCs）——是骨髓的主要常驻细胞4。传统上，BMSCs通过靶向骨髓穿刺获取，并在体外鉴定为贴壁生长的细胞in vitro。然而，该方法不足以将BMSCs与其他骨髓亚群（包括内皮细胞、周细胞、白细胞和造血干细胞）区分开来5。因此，亟需一种简便且有效的BMSC分离方案。
本研究详细描述了通过骨髓间充质干细胞（BMSCs）对塑料细胞培养板的物理贴壁特性进行分离与纯化的方法。采用第三代BMSCs进行流式细胞术实验，检测细胞表面标志物CD29、CD44和Sca-1的表达，实验方案遵循国际细胞治疗学会（International Society for Cell & 基因治疗（ISCT）间充质基质细胞（MSC）委员会6根据国际细胞治疗学会（ISCT）标准，小鼠间充质干细胞（MSCs）的特征为表达CD29、CD44和干细胞抗原1（Sca-1），不表达造血细胞标志物CD45和内皮细胞标志物CD31。此外，骨髓间充质干细胞（BMSCs）应具备多向分化潜能，能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。在本实验中，对分离获得的BMSCs诱导成骨分化，于第7天进行碱性磷酸酶（ALP）染色，第21天进行茜素红S染色以评估成骨分化效果。同时对分离纯化的BMSCs诱导成脂分化，并于第21天进行油红O染色以评估成脂分化情况。
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方案
动物实验已根据上海中医药大学的实验动物伦理指南获得批准（伦理批准编号：PZSHUTCM2211070009）。本研究使用8周龄雌性BALB/c小鼠（SPF级，体重20 ± 1 g）。本方案概述了小鼠来源的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离纯化、传代培养、基于流式细胞术的表型鉴定，以及成骨和成脂分化。所用试剂与仪器列于材料表中。
1. 动物处理
- 在独立通风笼具中饲养无特定病原体（SPF）条件下的小鼠，每笼五只。提供SPF级饲料和无菌水。维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。
注：该方法已在BALB/c和C57BL/6小鼠品系中经过测试并证实可行。本文主要以BALB/c为例进行说明。
2. 从小鼠后肢收获股骨和胫骨
- 处死动物 通过 CO2 窒息后颈椎脱位7 遵循伦理准则。
- 将小鼠浸泡于75%乙醇中5分钟（图1A).
注意：干细胞需在30分钟内采集完毕2 安乐死后立即进行操作，整个过程（包括骨髓冲洗、过滤及接种至培养板）在2小时内完成，以确保细胞活性最佳。
注意：为获得最佳骨髓间充质干细胞（BMSC）产量，应使用成年小鼠（≥8周龄）；8–12周龄小鼠最为理想8. - 用无菌解剖剪在跟腱处的后肢做约1厘米的切口图1B).
- 用无菌剪刀在跟腱周围的后肢做环形切口以暴露 远端 胫骨（图1C).
- 从切口处向臀部方向剥离皮肤，以去除后肢两侧的皮肤图1D).
- 沿髂骨切开，将股骨头从髋骨分离图2A).
注意：解剖过程中应避免损伤股骨的双侧关节，以防骨髓丢失。 - 将收集的股骨和胫骨置于含有含2%青霉素/链霉素的无菌预冷PBS的60 mm培养皿中图2B).
- 使用无菌手术刀尽可能切除胫骨和腓骨上的肌腱和肌肉，以便后续冲洗图2C).
- 将处理后的骨骼放回含有2%青霉素/链霉素的PBS中，并转移至无菌操作台以进行后续分离步骤。
3. 小鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与培养
- 将 αMEM 与 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素混合，配制用于骨髓间充质干细胞（BMSC）培养的完全 MEM Alpha 改良（αMEM）培养基。
注意：选择αMEM培养基，因其含有1000 mg/L葡萄糖，属于相对较低的浓度，有助于防止高糖环境可能引起的细胞增殖抑制9 - 取一个50 mL注射器，并安装随注射器附带的针头。
- 将20 mL αMEM培养基吸入50 mL注射器中，然后更换为1 mL注射器附带的针头。
注意：使用 1 mL 注射器针头应根据骨的大小进行选择，以尽量减少细胞损伤。使用50 mL注射器可高效冲洗骨髓，同时降低细胞污染的风险。 来自重复插入。 - 使用剪刀剪断 在无菌操作台中处理分离后的股骨或胫骨的两端。
- 沿切缘将针头插入骨内，冲洗骨髓至含有完全αMEM培养基的100 mm培养皿中（图 2D).
- 反复冲洗骨腔，直至骨片呈现苍白，以确保大部分骨髓已被去除（图2E).
- 用移液枪头轻柔地上下吹打40次，以尽可能分散聚集的细胞。
- 将细胞悬液通过40 μm细胞滤器过滤至50 mL离心管中，以去除碎片、组织残片及未分散的细胞团块。
- 将过滤后的细胞悬液转移至100 mm细胞培养皿中，每皿加入完全αMEM培养基至终体积15 mL。
注意：将每只小鼠股骨和胫骨中收集的全部骨髓细胞培养于一个100 mm培养皿中，以促进细胞生长。根据前期实验结果，约1 × 107 BMC 可从一只 8 周龄小鼠（来自两根股骨和两根胫骨）中分离获得。将这些细胞以 1.8 × 10⁶5 细胞/厘米²2 用于原代培养。 - 用双手握住培养皿，轻轻以“8”字形旋转摇晃 轻轻晃动培养皿15次，以确保细胞在皿内均匀分布。
- 将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2 培养箱中培养5天（图 3A).
注意：在此期间避免移动培养皿，以确保细胞均匀生长。
4. BMSC 培养中 αMEM 培养基的更换
- 在显微镜下观察细胞，判断其是否已达到80%融合度。若未达到，请继续进行第5天的培养基更换操作th 天
- 用无菌巴斯德吸管吸取3 mL PBS，从培养皿上方1 cm高度的不同位置滴加。
注意：避免将液体沿培养皿一侧加入，以免因冲击力过大导致贴壁细胞脱落，并影响对不需要细胞的有效清除。 - 加入3 mL PBS后，轻轻摇动培养皿以充分洗涤细胞，并用移液器吸除培养皿中的PBS。重复洗涤一次，以确保细胞被彻底清洗。
- 用无菌巴斯德吸管吸取15 mL完全αMEM培养基，从距离培养皿上方1 cm处的不同位置滴加。
- 将培养皿放回培养箱，继续培养并观察，直至细胞融合度达到80%后再进行传代培养（图3B).
5. BMSCs 的传代
- 用 PBS 清洗 80% 汇合度的细胞两次（图3C).
注意：在消化前用 PBS 清洗细胞有助于去除残留的培养基和细胞分泌物，并减少间充质干细胞（MSC）对培养皿的黏附。 - 用1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C、5% CO₂条件下孵育消化细胞2 孵育 2–3 分钟。
- 通过向细胞悬液中加入4 mL完全αMEM培养基来中和胰蛋白酶。
- 用1 mL移液器吸头吸出培养皿中的细胞悬液，并轻轻冲洗皿底，以脱离所有贴壁细胞。
- 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在300 × g 室温下孵育5分钟。
- 使用移液器弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于2 mL完全αMEM培养基中。
注意：传代培养时，接种密度约为 4 × 104 细胞/厘米²2 被发现最有利于持续生长和增殖。 - 以1:1至1:2的比例将细胞分种至新的100 mm细胞培养皿中（此为第1代）st 传代，P1）（图3D).
- 当细胞达到80%融合度时，大约每三天以1:1.5的比例进行一次传代，以获得第二代（P2）细胞。图3E）以及第三代（P3）（图 3F骨髓间充质干细胞的数量。
6. 准备P3代骨髓间充质干细胞用于表型鉴定及成骨分化
- 弃去细胞培养基。
- 用3 mL的P3代BMSCs进行洗涤 mL PBS 两次。
- 用1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C、5% CO₂条件下消化P3代BMSCs2 当细胞达到80%融合度时，在培养箱中孵育2–3分钟。
- 通过向细胞悬液中加入4 mL完全αMEM培养基来中和胰蛋白酶。
- 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，300 × g 室温孵育5分钟，弃去上清液。
注意：此处制备的P3代BMSC细胞球将用于表型鉴定 通过 流式细胞术以及成骨或成脂分化评估。
7. 通过流式细胞仪对骨髓间充质干细胞进行表型鉴定
- 用含有 2% FBS 的 1.5 mL PBS 溶液重悬 P3 代 BMSCs 细胞沉淀，并调整细胞浓度至 5 × 106 个细胞/mL。
- 将 100 μL 细胞悬液分装至 11 支试管中，每管含 5 × 105 个细胞。准备以下分组：空白对照、CD29 同型对照、CD29、CD44 同型对照、CD44、Sca-1 同型对照、Sca-1、CD31 同型对照、CD31、CD45 同型对照和 CD45。
注意：本研究中使用的荧光染料如下：CD29-FITC、CD29 同型-FITC、CD44-APC、CD44 同型-APC、Sca-1-PECy7、Sca-1 同型-PECy7、CD45-PerCPcy5.5、CD45 同型-PerCPcy5.5、CD31-PE 和 CD31 同型-PE（见材料表）。可根据不同流式细胞仪的配置调整所用荧光染料。 - 向各组分别加入以下试剂：向空白对照组加入 2 μL PBS，向 CD29 同型对照组加入 2 μL CD29 同型抗体（1:50 稀释），向 CD29 组加入 2 μL CD29 抗体（1:50 稀释），向 CD44 同型对照组加入 0.5 μL CD44 同型抗体（1:200 稀释），向 CD44 组加入 0.5 μL CD44 抗体（1:200 稀释），向 Sca-1 同型对照组加入 0.5 μL Sca-1 同型抗体（1:200 稀释），向 Sca-1 组加入 0.5 μL Sca-1 抗体（1:200 稀释），向 CD31 同型对照组加入 2 μL CD31 同型抗体（1:50 稀释），向 CD31 组加入 2 μL CD31 抗体（1:50 稀释），向 CD45 同型对照组加入 2 μL CD45 同型抗体（1:50 稀释），向 CD45 组加入 2 μL CD45 抗体（1:50 稀释）。
注意：抗体使用量依据生产商推荐的最佳流式细胞术条件。预实验已验证染色效果和靶细胞特异性。请参考生产商提供的剂量指南，并根据需要进行滴定预实验。 - 轻轻混匀，使用掌上离心机离心后，在 4 °C 避光条件下孵育 30 分钟。
- 向每管中加入 900 μL PBS，通过翻转混匀，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液以去除未结合的抗体。
- 用 300 μL PBS 重悬每管中的细胞沉淀，并立即进行流式细胞仪分析。
注意：若流式细胞仪检测可在 1–2 小时内完成，则无需使用 2.5% 中性甲醛固定细胞。若无法在 1–2 小时内完成检测，应使用 2.5% 中性缓冲甲醛 （按 10% 中性缓冲甲醛 与 PBS 以 1:3 比例混合配制）固定细胞，并于 4 °C 避光过夜保存，以备后续流式检测。 - 使用空白对照组调节流式细胞仪电压，确保细胞自发荧光信号控制在坐标轴范围的约 1/4–1/3 区间内。依次上样 CD29 同型对照、CD29、CD44 同型对照、CD44、Sca-1 同型对照、Sca-1、CD31 同型对照、CD31、CD45 同型对照和 CD45 组的细胞样本。在 FSC/SSC 图中设定 P1 门，采集 10,000 个细胞，以中等流速运行。
注意：确保流式细胞仪配备适当的检测通道，例如本实验中常用的 FITC、PE、PerCp-Cy5.5、PE-Cy7 和 APC 通道，或其他与荧光偶联抗体相匹配的通道。
8. BMSCs 的成骨分化
- 用完全αMEM培养基重悬P3代BMSC细胞团，并调整细胞浓度至1 × 105 个细胞/mL。
- 向24孔细胞培养板中每孔加入1 mL含1 × 105 个细胞的完全αMEM培养基，接种P3代BMSC细胞。
- 将P3代BMSC细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中培养3–5天，直至细胞融合度超过90%。每隔2天更换一次新鲜的完全αMEM培养基。
- 将不同孔均等地分为两组：阴性对照组（不进行成骨诱导分化）和成骨诱导分化组。
- 通过在完全αMEM培养基中添加10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L L-抗坏血酸和10-8 mol/L 地塞米松，配制成骨诱导分化培养基。
- 弃去细胞培养液，用1 mL PBS洗涤P3代BMSC细胞。
- 向成骨诱导分化组各孔中加入成骨诱导分化培养基（1 mL/孔），以诱导成骨分化。
- 向对照组各孔中加入完全αMEM培养基（1 mL/孔）。
- 将P3代BMSC细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中培养7天或21天，每隔3天更换一次新鲜的成骨诱导分化培养基或完全αMEM培养基。
注：培养7天的细胞用于碱性磷酸酶（ALP）染色，培养21天的细胞用于茜素红S染色检测。
9. 通过ALP染色鉴定分化的成骨细胞
- 用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 24 孔板中每个孔的细胞一次。
- 加入 0.5 mL 10% 缓冲福尔马林溶液固定细胞，并于室温孵育 20 分钟。
- 再次用 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤每个孔中的细胞一次。
- 向每个孔中加入 0.5 mL 碱性磷酸酶染色试剂 1-Step NBT/BCIP，用铝箔包裹避光，于 37 °C 孵育 30 分钟。
- 弃去染色液，用 1 mL 蒸馏水洗涤每个孔中的细胞一次，然后将培养板晾干。
- 使用相机观察并采集染色克隆的图像，以鉴定呈现黑色-紫色沉淀物的碱性磷酸酶（ALP）阳性细胞。
注意：碱性磷酸酶（ALP）染色试剂 1-Step NBT/BCIP 与 ALP 反应后可产生强效、不溶性的黑色-紫色沉淀物，易于观察。
10. 通过茜素红S染色法鉴定分化的成骨细胞
- 用 1 mL PBS 将 24 孔板中每个孔的细胞洗涤一次。
- 通过加入0.5 mL 10%缓冲福尔马林固定细胞 溶液并孵育20分钟。
- 用 1 mL PBS 将 24 孔板中每个孔的细胞洗涤一次。
- 每孔加入0.5 mL 0.1%茜素红S溶液（溶于0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.3），37 °C孵育30–60分钟。
- 弃去溶液，用1 mL蒸馏水洗涤每孔一次，然后将培养板晾干。
- 使用相机观察并采集染色菌落的图像，以鉴定茜素红S阳性细胞。
注意：茜素红S检测可显示间充质干细胞向成熟矿化骨细胞的分化，其原理是形成茜素红S-钙复合物，产生肉眼可见的亮红色染色。
11. 骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基A的制备
注意：根据说明书，通常使用小鼠骨髓间充质干细胞成脂分化试剂盒（见材料表）进行骨髓间充质干细胞（BMSCs）的脂肪细胞分化。
- 将胎牛血清（试剂盒组分，以下简称血清）置于 4 °C 冰箱中，至少 6 小时，直至完全解冻。
- 将添加剂 A-I（试剂盒组分）在使用前至少 30 分钟置于 4 °C 冰箱中；将添加剂 A-II（试剂盒组分）置于室温下，直至完全解冻。
- 轻轻颠倒或轻弹试剂管，以混匀管内内容物。
- 将添加剂 A-II 试剂管在室温下以 300 × g 离心 30 秒，确保试剂沉降至管底，便于取用。
- 用 75% 医用酒精彻底清洁所有组分的外包装，并在生物安全柜内打开。
- 将血清、添加剂 A-I 和添加剂 A-II 加入培养基中。
注意：为确保充分溶解，建议将基础培养基（试剂盒组分）预热至 37 °C，否则添加剂 A-II 可能因低温而析出沉淀。 - 用少量基础培养基冲洗每个瓶和管，确保将所有组分完全转移至基础培养基中。
- 拧紧基础培养基瓶盖，轻轻摇晃，充分混匀。
- 用石蜡膜密封瓶口，再用铝箔包裹，并贴上标签注明名称、配制日期及其他相关信息。
12. 骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基B的制备
- 将胎牛血清置于 4 °C 冰箱中至少 6 小时，直至完全解冻。
- 将试剂盒组分 Supplement B 置于 4 °C 冰箱中，至少放置 30 分钟直至完全解冻，再进行配制。
- 倒置或轻轻敲击试剂管，以混匀管内内容物。
- 对 Supplement B 管进行离心，使试剂集中于管底，便于吸取。
- 用 75% 医用酒精彻底清洁所有组分的外包装，并在生物安全柜中打开。
- 将血清和 Supplement B 加入基础培养基中。
- 取少量基础培养基冲洗每个瓶子和试管，确保所有组分完全转移至培养基中。
- 拧紧基础培养基瓶盖，轻轻振荡以充分混匀。
- 用封口膜密封瓶口，包裹铝箔，并贴上标签注明名称、配制日期及其他信息。
13. BMSCs 的脂肪细胞分化
- 向六孔板中每孔加入 1 mL 0.1% 明胶，轻轻摇动使孔底均匀覆盖。
- 将涂有 0.1% 明胶的六孔板置于无菌操作台或 CO2 培养箱中，静置至少 30 分钟。
- 吸除明胶溶液，六孔板即可用于细胞接种；或在 30 分钟后等待孔内干燥后再进行接种。
- 以 4 × 104 个细胞/cm2 的密度将 P3 代 BMSCs 接种至六孔板各孔中，每孔加入 2 mL 完全培养基。
- 将细胞置于 37 °C、5% CO2 及饱和湿度的 CO2 培养箱中培养。
- 当细胞达到 100% 汇合时，小心吸除培养基，每孔加入 2 mL 成脂分化诱导培养基 A。
- 诱导 3 天后吸除培养基 A，每孔加入 2 mL 成脂分化维持培养基 B。
- 培养基 B 培养 1 天后吸除，并切换回培养基 A 继续诱导。
- 交替使用培养基 A 与 B，并每日观察细胞状态；若在使用培养基 A 诱导期间出现细胞收缩或死亡现象，应及时切换至培养基 B。
- 重复诱导与维持过程，直至出现足够数量且大小合适的脂滴，随后准备进行染色。
14. 油红O（ORO）染色
注意：所有操作步骤均应尽可能轻柔，以避免脂滴脱落。
- 脂肪向诱导分化完成后，从6孔板中吸除诱导分化培养基，用1×PBS轻轻洗涤2–3次。
- 每孔加入2 mL 10%中性缓冲福尔马林 ，室温固定20分钟。
- 按3:2比例将Oil Red O储备液与蒸馏水混合，配制Oil Red O工作液。混合后，在250 × g 条件下离心4分钟，取上清液使用。
- 吸除固定液，用PBS轻轻洗涤2–3次，确保彻底去除残留固定液。
- 每孔加入0.8 mL Oil Red O染色液，室温孵育30分钟。
- 吸除染色液，用1 mL 75%乙醇洗涤两次。
- 每孔加入1 mL苏木精复染液，复染2分钟，然后吸除。
- 每孔加入2 mL PBS，于显微镜下观察脂肪向分化染色结果。
- 用封口膜密封染色后的6孔板，并于4 °C保存。
注意：请 勿保存超过1周，否则脂滴可能发生融合，导致染色状态丢失。
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结果
小鼠来源的骨髓间充质干细胞（BMSCs）被分离并培养约2周，以获得第3代（P3）BMSCs（图3）。如图所示 图3A，从骨髓中 freshly 提取的细胞保持单核状态，并可见脂滴。培养皿中出现纺锤形细胞，在第5天达到60%–80%融合度th 培养天数 (图3B,C）。从P1-P3（图3D-F），BMSCs 呈细长的梭形，以单层方式生长，并形成细胞集落网络。细胞通常保持适当的间距，胞质清晰，无明显凋亡迹象，细胞核未见异常碎片。
流式细胞术分析显示，骨髓间充质干细胞表面标志物 CD29（
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讨论
干细胞治疗因其在再生医学领域的革命性潜力而受到广泛关注。临床前研究已提供了大量证据，支持干细胞尤其是骨髓间充质干细胞（BMSCs）的临床应用13。然而，细胞产量低、污染风险以及生长缓慢等挑战限制了其临床应用。因此，亟需开展针对BMSC制备流程标准化的研究，以提高细胞产量和功能，从而拓展其临床应用范围2。
该方法在骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离与培养中具有多项显著优势。首先，通过在无任何操作条件下持续培养5天，最大限度地减少了对新鲜分离骨髓细胞的干扰，使造血细胞能够为BMSCs提供营养支持和维持环境。此外，通过采用换液和连续传代等技术对BMSCs进行纯化，并采用低比例（1:1–1:2）的慢速传代方法，既促进BMSCs的增殖，又提高其纯度。其次，该技术操作简便且干扰最小，能够使间充质干细胞（MSCs）保留在其天然微环境中，维持关键的基质细胞、细胞外基质成分及分泌因子14。这种保留有助于MSC的自我更新与分化能力，对其功能发挥至关重要。第三...
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披露
作者声明本研究不存在利益冲突。
致谢
本工作获得了国家重点研发计划项目资助&中国国家重点研发计划（2020YFE0201600）和国家自然科学基金（82174408 和 82374477）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL注射器（22G针头） | KINDLY GROUP（KDL） | 60017031 | |
| 1-步法 NBT/BCIP | Pierce Biotechnology, Inc. | 34042 | 碱性磷酸酶染色 |
| 10%中性缓冲福尔马林 | Wexis | 5200250 | 细胞固定 |
| 6孔板 | Labselect | 11110 | 细胞培养 |
| 24孔板 | Labselect | 11310 | 细胞培养 |
| 40 μm细胞筛 | 科尼格 | 352340 | 过滤以去除团聚物 |
| 50 mL 注射器 | KINDLY GROUP(KDL) | 60017040 | |
| 75% 乙醇 | 上海年悦生物科技有限公司 | 31009001 | 对小鼠皮肤进行消毒 |
| 茜素红S | Sigma-Aldrich | A5533 | 钙沉积与钙化结节检测 |
| APC 标记 CD44 单克隆抗体（克隆号：IM7） | eBioscience | 17-0441-82 | 流式细胞术 |
| APC 标记大鼠 IgG2b κ 同型对照（克隆：eB149/10H5） | eBioscience | 17-4031-82 | 流式细胞术 |
| 高压灭菌 | 日本平山公司 | HVE-50 | 手术器械灭菌 |
| CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技（中国）有限公司 | 300583057 | 细胞培养 |
| Cytoflex 流式细胞仪 | Beckman Coulter | A00-1-1102 | 流式细胞术 |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902 | 骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| 培养皿（100 mm） | 康宁 | 430167 | 细胞培养 |
| 培养皿（60 mm） | 康宁 | 430166 | 移植过程中的样本放置 |
| 消毒棉球 | 上海宏龙工业有限公司 | 20230627 | 对小鼠皮肤进行消毒 |
| 一次性无菌手套 | 上海宏龙工业有限公司 | YT21131 | 无菌操作 |
| 双狮辐照啮齿类动物饲料 | 苏州双实实验动物饲料科技有限公司 | GB 14924.3 | 动物饲料 |
| 胎牛血清 | 上海拜森生物科学&Tech 公司 | BS-0002-500 | 细胞培养 |
| FITC 豚鼠抗大鼠 CD29（克隆：Ha2/5） | BD 生物科学 | 555003 | 流式细胞术 |
| FITC 仓鼠 IgM λ1 同型对照（克隆号：G235-1） | BD 生物科学 | 553960 | 流式细胞术 |
| 明胶（0.1%） | OriCell | GLT-11301 | 增强细胞的黏附能力 |
| IVCs 小鼠笼具 | 苏州美诺克动物实验设备科技有限公司 | HH-MMB-2 | 动物屏障 |
| L-抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A8960 | 骨髓间充质干细胞成骨分化 |
| 记号笔 | Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. | YYST5 | 在培养皿上标记细胞信息 |
| MEM α 改良培养基（1×） | 上海年悦生物科技有限公司 | SH30265 | 细胞培养 |
| 小鼠骨髓间充质干细胞成脂分化试剂盒 | Cyagen | MUXMX-90031 | 骨髓间充质干细胞成脂分化 |
| 尼康Eclipse Ti2倒置显微镜 Synstem | 日本尼康公司 | Ti2-U | 观察细胞并拍照 |
| 眼科剪 | 上海年悦生物科技有限公司 | Y00030 JZ | 切开皮肤 |
| 眼科镊子 | 上海年悦生物科技有限公司 | BS-ZER-S-100 Biosharp | 获取小鼠骨组织。 |
| 巴斯德移液管 | 上海年悦生物科技有限公司 | BS-XG-03M | 吸除培养基 |
| PE 大鼠抗小鼠 CD31（克隆：Ha2/5） | BD 生物科学 | 553373 | 流式细胞术 |
| PE 大鼠 IgG2a， κ 同型对照（克隆：R35-95） | BD 生物科学 | 553930 | 流式细胞术 |
| PE-Cyanine7 Ly-6A/E (Sca-1) 单克隆抗体（克隆号：D7） | eBioscience | 25-5981-82 | 流式细胞术 |
| PE-Cyanine7 大鼠 IgG2a κ 同型对照（克隆：eBR2a） | eBioscience | 25-4321-82 | 流式细胞术 |
| 青霉素-链霉素 | 上海年悦生物科技有限公司 | 2585636 | 细胞培养 |
| PerCP-Cy5.5 大鼠抗小鼠 CD45（克隆：Ha2/5） | BD 生物科学 | 561869 | 流式细胞术 |
| PerCP-Cy5.5 大鼠 IgG2b κ 同型对照（克隆：A95-1） | BD 生物科学 | 550764 | 流式细胞术 |
| 手术刀 | 上海医疗器械（集团）有限公司外科器械厂 | J11010-10# JZ | 分离小鼠的后肢和躯干，并去除骨骼上的多余组织 |
| 无菌操作台 | 赛默飞世尔科技（中国）有限公司 | ECO0.9 | 手术操作台 |
| 无菌手术巾 | 河南华誉医疗器械有限公司 | 20160900 | 提供无菌手术区域 |
| 50 mL 离心管 | 上海拜赛生物科技有限公司 | BLD-BL2002500 | 储存过滤后的细胞悬液 |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200056 | 消化贴壁细胞 |
| β-甘油磷酸盐 | Sigma-Aldrich | G5422 | 骨髓间充质干细胞成骨分化 |
参考文献
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