小鼠骨髓间充质干细胞的纯化、扩增和基于流式细胞术的表型

摘要

本方案描述了一种经济高效的方法来纯化、扩增和表征小鼠高度均匀的骨髓间充质干细胞 （BMSC）。这种方法有助于获得大量具有高增殖和分化潜力的 BMSC，支持小鼠模型并推进临床前研究。

摘要

间充质干细胞 （MSC） 是一组可以自我更新并分化为多个细胞谱系的干细胞。其中，在骨髓中发现的 MSCs，称为骨髓间充质干细胞 （BMSC），在成骨、造血支持、归巢/迁移和免疫抑制中起着至关重要的作用。BMSCs 因其具有细胞治疗策略的潜力，以及它们易于获得、遗传稳定性和低免疫原性，因此被广泛用于细胞生物学和组织工程研究。造血干细胞 （HSC） 和 BMSCs 共存于骨髓中，但具有不同的祖细胞。从骨髓中提取细胞时，通常会获得多种细胞类型，这可能导致细胞群的异质性，从而可能导致偏倚且不符合高实验标准。因此，开发有效的技术来提高体外 BMSCs 的均一性和产量至关重要。本研究提出了对从 BALB/c 小鼠获得的 BMSCs 进行纯化、扩增和基于流式细胞术的表型分析的详细方案。使用流式细胞术表征第三代 BMSCs 的均一性和干细胞表型，显示 CD29 、 CD44 和 Sca-1 阳性，CD45 和 CD31 阴性，并证实其成骨和成脂分化能力。这种具有成本效益的方案提供了一种简单有效的方法来获得足够数量的具有高增殖和分化潜力的均相 BMSC，这对于推进小鼠模型研究和广泛的临床前研究至关重要。

引言

骨髓间充质干细胞 （BMSC） 以其多能特性而闻名，由于其自我可再生、分化和免疫调节特性，被广泛用于治疗各种疾病 ^1,2。BMSCs 易于获得，能够广泛扩增，表现出免疫抑制特性，并且不会立即引发免疫反应³，这使得它们对组织工程应用和细胞治疗的有效载体具有吸引力。

在骨髓中，两个主要的干细胞群及其后代，造血干细胞和 BMSC，是主要居民⁴。传统上，BMSCs 是通过靶向骨髓穿刺获得的，并在 体外被鉴定为塑料贴壁细胞。然而，这种方法不足以区分 BMSCs 与其他骨髓亚群，包括内皮细胞、周细胞、白细胞和造血干细胞⁵。因此，需要一种简单有效的分离 BMSCs 的方案。

目前的工作详细介绍了通过物理粘附在塑料细胞培养板上来分离和纯化 BMSC。流式细胞术实验是使用表面标记CD29、CD44和Sca-1对第三代BMSCs进行的，如国际细胞与基因治疗协会（ISCT）间充质细胞（MSC^{）委员会6}所述。根据 ISCT 标准，小鼠 MSC 的特征是 CD29、CD44 和干细胞抗原 1 （Sca-1） 阳性，而造血细胞标志物 CD45 和内皮细胞标志物 CD31 阴性。此外，BMSC 应该是多能的，证明三系分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。在该实验中，在提取的 BMSC 中诱导成骨，第 7 天进行 ALP 染色，第 21 天进行茜素红 S 测定以评估分化。还诱导分离和纯化的 BMSCs 的成脂分化，在第 21 天进行油红 O 染色以评估脂肪生成。

方案

根据上海中医药大学实验动物伦理指南（伦理批准号：PZSHUTCM2211070009）批准了动物处理。本研究使用 8 周龄雌性 BALB/c 小鼠 （SPF 级，20 ± 1 g 体重）。该方案概述了小鼠来源的 BMSC 的纯化、传代、基于流式细胞术的表型分析以及成骨和成脂分化。使用的试剂和设备列在 材料表中。

1. 动物处理

1. 在无特定病原体 （SPF） 条件下的家鼠在单独通风的笼子里，每个笼子有 5 只小鼠。提供 SPF 级饲料和无菌水。保持 12 小时的光照/黑暗循环。
   注：该方法已经过测试，发现在 BALB/c 和 C57BL/6 小鼠品系中均可行。本文主要以 BALB/c 为例。

2. 从小鼠后肢采集股骨和胫骨

1. 按照道德准则 ，通过 CO₂ 窒息，然后颈椎脱位⁷ 对动物实施安乐死。
2. 将小鼠浸泡在 75% 乙醇中 5 分钟（图 1A）。
   注：安乐死后 30 min² 内收获干细胞，整个过程，包括骨髓冲洗、过滤和接种到培养板中，在 2 小时内完成，以确保最佳细胞活力。
   注：使用成年小鼠 （≥8 周龄） 以获得最佳 BMSC 产量;8-12 周龄的小鼠是理想的⁸.
3. 用无菌解剖剪刀在跟腱后肢切开约 1 厘米（图 1B）。
4. 用无菌剪刀在跟腱后肢周围做一个圆形切口，以露出远端胫骨（图 1C）。
5. 从切口向臀部剥皮，将其从两个后肢上去除（图 1D）。
6. 沿髂骨切割，将股骨头与髋骨分开（图 2A）。
   注意：解剖时避免损伤股骨双侧关节，以防止骨髓流失。
7. 将收集的股骨和胫骨放入含有 2% 青霉素/链霉素的无菌预冷 PBS 的 60 毫米培养皿中（图 2B）。
8. 使用无菌手术刀从胫骨和腓骨上尽可能多地切断肌腱和肌肉，以方便以后冲洗（图 2C）。
9. 将处理过的骨头放回含有 2% 青霉素/链霉素的 PBS 中，并将它们转移到无菌罩中进行后续的分离步骤。

3. 小鼠 BMSCs 的纯化和培养

1. 通过在 αMEM 中补充 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素，制备用于 BMSC 培养的完全 MEM α 修饰 （αMEM） 培养基。
   注：选择 αMEM 培养基，因为它含有 1000 mg/L 葡萄糖，这是一种相对较低的浓度。这有助于防止在高葡萄糖环境中可能发生的细胞增殖抑制⁹
2. 取一个 50 mL 注射器并连接注射器随附的针头。
3. 将 20 mL αMEM 培养基吸入 50 mL 注射器中，然后用 1 mL 注射器随附的针头更换针头。
   注：使用 1 mL 注射器针头以适应骨骼大小并最大限度地减少细胞损伤。50 mL 注射器可有效冲洗骨髓，降低重复插入导致细胞污染的风险。
4. 在无菌罩中用剪刀剪掉分离的股骨或胫骨的两端。
5. 将针头沿切割边缘插入骨骼中，将骨髓冲洗到含有完整 αMEM 培养基的 100 mm 培养皿中（图 2D）。
6. 反复冲洗骨腔，直到骨块看起来苍白，以确保大部分骨髓已被提取（图 2E）。
7. 用移液器吸头轻轻上下移液 40 次，以尽可能分散聚集的细胞。
8. 通过 40 μm 细胞过滤器将细胞悬液过滤到 50 mL 离心管中，以去除碎片、组织碎片和未分散的团块。
9. 将过滤后的细胞悬液转移至 100 mm 细胞培养皿中，并添加完整的 αMEM 培养基，使每个培养皿的最终体积为 15 mL。
   注：将每只小鼠的股骨和胫骨收集的所有骨髓细胞在一个 100 mm 培养皿中培养，以促进细胞生长。根据以前的实验，可以从 8 周龄的小鼠（来自两个股骨和两个胫骨）中分离出大约 1 ×^{10 7} BMC。将这些细胞以 1.8 × 10⁵ 个细胞/cm² 的密度接种到 100 mm 培养皿中，用于原代培养。
10. 用双手握住培养皿，以 8 字形运动轻轻旋转 15 次，以确保细胞在培养皿中均匀分布。
11. 将培养皿置于 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中并培养 5 天（图 3A）。
    注意：在此期间避免移动培养皿，以确保细胞均匀生长。

4. 替代 αMEM 培养基用于 BMSC 培养

1. 在显微镜下观察细胞以确定它们是否达到 80% 汇合。如果没有，请在^第 5 天继续更换培养基。
2. 用无菌巴斯德移液管吸取 3 mL PBS，并从培养皿上方 1 cm 的高度分配至不同位置。
   注：避免将液体从培养皿的一侧分配，因为这可能会因冲击力过大而去除贴壁细胞，并阻止有效去除不需要的细胞。
3. 加入 3 mL PBS 后，轻轻摇动培养皿以彻底清洗细胞，然后用移液管从培养皿中取出 PBS。再次重复洗涤过程，以确保细胞被彻底洗涤。
4. 用无菌巴斯德移液管吸取 15 mL 完整的 αMEM 培养基，并从培养皿上方 1 cm 的不同位置分配。
5. 将培养皿放回培养箱中并监测，直到细胞达到 80% 汇合，然后再进行传代培养（图 3B）。

5. BMSC 的通过

1. 用 PBS 洗涤 80% 的汇合细胞两次（图 3C）。
   注：消化前用 PBS 洗涤细胞有助于去除残留的培养基和细胞分泌物，并减少 MSC 对培养皿的粘附。
2. 用 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育 2-3 分钟，消化细胞。
3. 通过向细胞悬液中加入 4 mL 完全 αMEM 培养基来中和胰蛋白酶。
4. 使用 1 mL 移液器吸头从培养皿中吸出细胞悬液，然后轻轻冲洗培养皿底部以分离所有贴壁细胞。
5. 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，并在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
6. 使用移液器弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 2 mL 完整 αMEM 培养基中。
   注：对于传代培养，发现大约 4 × 10⁴ 个细胞/cm² 的接种密度最适合持续生长和增殖。
7. 以 1：1-1：2 的比例将细胞分液到新的 100 mm 细胞培养皿中（这构成^第 1 代，P1）（图 3D）。
8. 当细胞达到 80% 汇合时，大约每三天以 1：1.5 的比例分流细胞，以产生 BMSC 的第二次传代 （P2）（图 3E）和第三次传代 （P3）（图 3F）。

6. 准备用于表型鉴定和成骨分化的 P3 BMSCs

1. 丢弃细胞培养基。
2. 用 3 mL PBS 洗涤 P3 BMSCs 两次。
3. 当 P3 BMSCs 达到 80% 汇合度时，用 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 在 5% CO₂ 培养箱中于 37 °C 孵育 2-3 分钟，以消化 P3 BMSC。
4. 通过向细胞悬液中加入 4 mL 完全 αMEM 培养基来中和胰蛋白酶。
5. 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   注意：此处制备的 P3 BMSC 沉淀将用于通过流式细胞术 进行 表型鉴定以及评估成骨或成脂分化。

7. 通过流式细胞仪对 BMSCs 进行表型鉴定

1. 用 1.5 mL 含有 2% FBS 的 PBS 溶液重悬 P3 BMSCs 的细胞沉淀，并将浓度调节至 5 × 10⁶ 个细胞/mL。
2. 将 100 μL 细胞悬液分装到 11 个试管中，每个试管中 5 × 10^{个 5} 个细胞。准备以下组：标记空白、CD29 同种型对照、CD29、CD44 同种型对照、CD44、Sca-1 同种型对照、Sca-1、CD31 同种型对照、CD31、CD45 同种型对照和 CD45。
   注：在本研究中，使用了以下荧光染料：CD29-FITC、CD29 同种型-FITC、CD44-APC、CD44 同种型-APC、Sca-1-PECy7、Sca-1 同种型-PECy7、CD45-PerCPcy5.5、CD45 同种型-PerCPcy5.5、CD31-PE 和 CD31 同种型-PE（如材料表所示）。这些荧光染料可以根据不同流式细胞仪的配置进行修饰。
3. 对于每组，添加以下试剂：2 μL PBS 到标记空白组中，2 μL CD29 同种型到 CD29 同种型对照组（1：50 稀释），2 μL CD29 同种型到 CD29 组（1：50 稀释），0.5 μL CD44 同种型到 CD44 同种型对照组（1：200 稀释），0.5 μL CD44 到 CD44 组（1：200 稀释）， 0.5 μL Sca-1 同种型（1：200 稀释），0.5 μL Sca-1 同种型（1：200 稀释），CD31 同种型对照组 2 μL CD31 同种型（1：50 稀释），CD31 组 2 μL CD31（1：50 稀释），CD45 同种型对照组 2 μL CD45 同种型（1：50 稀释）， 以及 CD45 组的 2 μL CD45（1：50 稀释）。
   注：根据制造商的流式细胞术优化建议使用抗体。初步实验证实了靶细胞的最佳染色和特异性。请参阅制造商的剂量指南，并根据需要进行滴度预测试。
4. 轻轻混合，使用手掌离心机离心，并在 4 °C 下避光孵育 30 分钟。
5. 向每个试管中加入 900 μL PBS，倒置混合，并在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。 弃去上清液以去除多余的抗体。
6. 用 300 μL PBS 重悬每管中的细胞沉淀，并使用流式细胞仪进行分析。
   注：如果流式细胞仪检测可在 1-2 小时内完成，则无需用 2.5% 中性甲醛固定细胞。如果无法在 1-2 小时内进行分析，则用 2.5% 中性缓冲福尔马林固定细胞（通过将 10% 中性缓冲福尔马林与 PBS 以 1：3 的比例混合制备），并在 4 °C 下避光储存过夜，以备以后流式细胞仪测定。
7. 使用标记空白组调整流式细胞仪电压，以确保细胞自发荧光在坐标轴的大约 1/4–1/3 范围内。依次加载来自 CD29 同种型、CD29、CD44 同种型、CD44、Sca-1 同种型、Sca-1、CD31 同种型、CD31、CD45 同种型和 CD45 组的细胞。将 P1 门（如 FSC/SSC 图中定义）设置为捕获 10,000 个细胞，以中等速度运行。
   注：确保流式细胞仪配备适当的通道，例如实验中常用的通道：FITC、PE、PerCp-Cy5.5、PE-Cy7 和 APC，或对应于抗体偶联荧光素的其他通道。

8. BMSCs 的成骨分化

1. 将 P3 BMSC 沉淀重悬于完整的 αMEM 培养基中，将浓度调节至 1 × 10⁵ 个细胞/mL。
2. 通过向每个孔中加入 1 mL 含有 1 × 10⁵ 个细胞的完整 αMEM 培养基，将 P3 BMSC 接种到 24 孔细胞培养板中。
3. 在 37 °C 下，在 5% CO₂ 培养箱中培养 P3 BMSCs 3-5 天，直至汇合度超过 90%。每 2 天用新鲜培养基更换完整的 αMEM 培养基。
4. 将不同的孔平均分为两组：阴性对照组（无成骨分化诱导）和成骨分化组
5. 通过在 αMEM 完全培养基中补充 10 mmol/L β-甘油磷酸酯、50 mg/L L-抗坏血酸和 ^10-8 mol/L 地塞米松来制备成骨分化诱导培养基。
6. 丢弃细胞培养基，用 1 mL PBS 洗涤 P3 BMSC。
7. 将成骨分化诱导培养基添加到成骨分化组的孔中，用于成骨分化诱导 （1 mL/孔）。
8. 将完整的 αMEM 培养基添加到对照组的孔中 （1 mL/孔）。
9. 在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中培养 P3 BMSCs 7 或 21 天，每 3 天用相同的新鲜培养基替换成骨分化诱导培养基或完整的 αMEM 培养基。
   注：具有 7 天诱导的细胞用于碱性磷酸酶 （ALP） 染色。诱导 21 天的细胞用于茜素红 S 测定。

9. 用 ALP 染色鉴定分化的成骨细胞

1. 用 1 mL PBS 洗涤 24 孔板每个孔中的细胞一次。
2. 通过加入 0.5 mL 10% 缓冲福尔马林溶液并孵育 20 分钟来固定细胞。
3. 用 1 mL PBS 再次洗涤每个孔中的细胞一次。
4. 向每个孔中加入 0.5 mL 碱性磷酸酶染色试剂 1 步法 NBT/BCIP，并在 37 °C 下用铝箔包裹孵育 30 分钟以避光。
5. 丢弃溶液，用 1 mL 蒸馏水洗涤每个孔中的细胞一次，然后让板干燥。
6. 使用相机观察和获取染色集落的图像，以识别带有黑紫色沉淀的 ALP 阳性细胞。
   注：碱性磷酸酶 （ALP） 染色试剂 1 步法 NBT/BCIP 在与 ALP 反应时产生强烈的不溶性黑紫色沉淀，可以很容易地观察到。

10. 茜素红 S 法鉴定分化的成骨细胞

1. 用 1 mL PBS 洗涤 24 孔板每个孔中的细胞一次。
2. 通过加入 0.5 mL 10% 缓冲福尔马林溶液并孵育 20 分钟来固定细胞。
3. 用 1 mL PBS 洗涤 24 孔板每个孔中的细胞一次。
4. 向每个孔中加入 0.5 mL 0.1% 茜素红 S 的 0.1 mol/L Tris-HCl （pH 8.3） 溶液，并在 37 °C 下孵育 30–60 分钟。
5. 丢弃溶液，用 1 mL 蒸馏水洗涤每个孔中的细胞一次，然后让板干燥。
6. 使用相机观察和获取染色菌落的图像，以识别茜素红 S 阳性细胞。
   注：用于 MSC 分化为成熟矿化骨细胞的茜素红 S 测定导致茜素红 S-钙复合物的形成，从而产生可目视观察到的亮红色染色。

11. BMSCs成脂诱导分化培养基A的制备

注：对于 BMSC 的脂肪细胞分化，通常根据指南使用小鼠骨髓间充质干细胞成脂分化试剂盒（参见 材料表）。

1. 在完全解冻之前，将胎牛血清（试剂盒的一种成分，称为血清）在 4 °C 冰箱中至少 6 小时。
2. 制备前至少 30 分钟将补充剂 A-I（试剂盒的组分）放入 4°C 冰箱中;将补充剂 A-II（试剂盒的组分）置于室温下，直至完全解冻。
3. 倒置或轻轻敲击试剂管以混合内容物。
4. 在室温下以 300 × g 离心 Supplement A-II 试剂管 30 秒，以确保试剂收集在底部以便于检索。
5. 用 75% 医用酒精彻底清洁所有组件的外包装，并在生物安全柜中打开它们。
6. 将血清、添加剂 A-I 和添加剂 A-II 添加到培养基中。
   注：为确保正确溶解，请将基础培养基（试剂盒的一个组分）预热至 37 °C，否则补充剂 A-II 可能会因寒冷暴露而沉淀。
7. 使用少量基础培养基冲洗每个瓶子和试管，确保将所有组分转移到基础培养基中。
8. 盖上 Basal 培养基瓶盖，轻轻摇晃以充分混合。
9. 用石蜡膜密封瓶子，用铝箔包裹，并贴上名称、制备日期和其他详细信息。

12. BMSCs成脂诱导分化培养基B的制备

1. 在完全解冻之前，将胎牛血清在 4 °C 冰箱中至少 6 小时。
2. 将补充剂 B（试剂盒的一个组分）放入 4 °C 冰箱中，直至完全解冻至少 30 分钟，然后再进行制备。
3. 倒置或轻轻敲击试剂管以混合内容物。
4. 离心补充剂 B 管，使试剂集中在底部，以便于收集。
5. 用 75% 医用酒精彻底清洁所有组件的外包装，并在生物安全柜中打开它们。
6. 将血清和补充剂 B 添加到基础培养基中。
7. 使用少量基础培养基清洗每个瓶子和试管，确保所有组分都完全转移到培养基中。
8. 盖上 Basal 培养基瓶盖，轻轻摇晃以充分混合。
9. 用封口膜密封瓶子，用铝箔包裹，并在标签上贴上名称、制备日期和其他详细信息。

13. BMSCs 的脂肪细胞分化

1. 向六孔板中加入 1 mL 0.1% 明胶，摇动使其均匀涂布在每个孔的底部。
2. 将涂有 0.1% 明胶的六孔板置于无菌罩或 CO₂ 培养箱中至少 30 分钟。
3. 吸出明胶，板已准备好进行细胞接种，或等待孔干燥后 30 分钟后再接种。
4. 以 4 ×^{10 4} 个细胞/cm² 的密度接种 P3 BMSC，在 6 孔板的每个孔中，向每个孔中加入 2 mL 完全培养基。
5. 将细胞在 37 °C 的 CO₂ 培养箱中，5% CO₂ 和饱和湿度中孵育。
6. 小心吸出培养基，当细胞达到 100% 汇合时，向每个孔中加入 2 mL 成脂分化诱导培养基 A。
7. 诱导 3 天后从孔中吸出培养基 A，并加入 2 mL 成脂分化培养基 B。
8. 1 天后吸出培养基 B，然后换回培养基 A 进行进一步诱导。
9. 在培养基 A 和 B 之间交替，并每天观察细胞。如果在使用培养基 A 诱导期间发生细胞收缩或死亡，请立即改用培养基 B。
10. 重复诱导和维持过程，直到出现足够数量的适当大小的脂滴，然后准备染色。

14. 油红 O （ORO） 染色

注意：尽可能轻柔地执行所有程序，以避免脂滴脱落。

1. 成脂诱导分化完成后，从 6 孔板中吸出成脂诱导分化培养基，并用 1×PBS 轻轻洗涤 2-3 次。
2. 每孔加入 2 mL 10% 中性缓冲福尔马林，并在室温下固定 20 分钟。
3. 通过将 Oil Red O 原液与蒸馏水以 3：2 的比例混合来制备 Oil Red O 工作溶液。混合后，以 250 × g 离心 4 分钟并使用上清液。
4. 吸出固定剂并用 PBS 轻轻洗涤 2-3 次，确保彻底去除固定剂。
5. 向每个孔中加入 0.8 mL 红色 O 染色溶液，在室温下放置 30 分钟。
6. 吸出染色溶液，用 1 mL 75% 乙醇洗涤两次。
7. 向每个孔中加入 1 mL 苏木精复染剂 2 分钟，然后吸出。
8. 向每个孔中加入 2 mL PBS，并在显微镜下观察成脂染色结果。
9. 用封口膜密封染色的六孔板并储存在 4 °C。
   注意：请勿存放超过 1 周。脂滴可能会融合，失去染色状态。

结果

分离小鼠来源的 BMSCs 并培养约 2 周，以产生第三代 （P3） BMSC（图 3）。如图 3A 所示，从骨髓中新鲜提取的细胞仍然是单核细胞，带有可见的脂肪滴。纺锤形细胞出现在培养皿中，在^第 5 个培养日达到 60%-80% 汇合（图 3B，C）。从 P1-P3 （图 3D-F） 开始，BMSCs 表现出长纺锤形或梭形，以单层形式生长并形成细胞集落网络。细胞通常保持适当的间距，细胞质清晰，没有明显的细胞凋亡迹象，细胞核没有异常片段。

流式细胞术分析显示，BMSC 表面标志物 CD29 （

讨论

干细胞疗法因其彻底改变再生医学的潜力而引起了相当大的兴趣。临床前研究提供了大量证据支持干细胞的临床应用，尤其是 BMSCs¹³。然而，细胞产量低、污染和生长缓慢等挑战阻碍了它们的临床应用。因此，迫切需要研究 BMSC 制备过程的标准化，以提高细胞产量和功能，从而拓宽其临床用途²。

该方法在 BMSC 的分离和培养方面具有几个显着优势。首先，通过保持连续培养 5 天而不进行任何作，最大限度地减少了对新鲜分离的骨髓细胞的干扰，使造血细胞能够支持 BMSC 的营养和维持。此外，采用换培养基和连续传代等技术纯化 BMSC，采用低比例 （1：1-1：2） 的慢传代方法，促进 BMSCs 的增殖和纯化。其次，该技术简单且干扰最小，可将 MSC 维持在其天然生态位中，保留必需的基质细胞、细胞外基质成分和分泌因子¹⁴。这种保存支持 MSC 的自我更新和分化，这对它们的功能至关重要。第三，培...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1mL注射器（22G注射器针头）	亲切集团（KDL）	60017031
一步法NBT/BCIP	皮尔斯生物技术公司	34042	碱性磷酸酶染色
10% 中性缓冲福尔马林	韦西斯	5200250	细胞固定
6 孔板	实验室选择	11110	细胞培养
24孔板	实验室选择	11310	细胞培养
40 &亩;m 细胞过滤器	科尼格	352340	过滤去除结块物
50 mL 注射器	亲切集团（KDL）	60017040
75%乙醇	上海年悦生物科技有限公司	31009001	对小鼠皮肤进行消毒
茜素红 S	西格玛-奥尔德里奇	A5533	钙沉积和钙化结节检测
APC CD44 单克隆抗体（克隆：IM7）	电子生物科学	17-0441-82	流式细胞术
APC大鼠IgG2b kappa同种型对照（克隆：eB149/10H5）	电子生物科学	17-4031-82	流式细胞术
高压 釜	日本平山公司	HVE-50型	灭菌手术器械
CO2培养箱	赛默飞世尔科技（中国）有限公司	300583057	细胞培养
Cytoflex 血流法	贝克曼·库尔特	A00-1-1102	流式细胞术
地塞米松	西格玛-奥尔德里奇	D4902	BMSCs成骨分化
盘子（100mm）	康宁	430167	细胞培养
盘子（60mm）	康宁	430166	移植过程中的样本放置
消毒棉球	Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd.	20230627	对小鼠皮肤进行消毒
一次性无菌手套	上海宏隆实业有限公司	YT21131	无菌作
双狮辐照啮齿动物饮食	苏州双石实验动物饲料科技有限公司	GB 14924.3	动物饲料
胎牛血清	上海Biosun Sci&科技股份有限公司	英国科学硕士-0002-500	细胞培养
FITC仓鼠抗大鼠CD29（克隆：Ha2/5）	BD生物科学	555003	流式细胞术
FITC 仓鼠 IgM，λ1 同型对照（克隆：G235-1）	BD生物科学	553960	流式细胞术
明胶 （0.1%）	欧瑞赛尔	GLT-11301型	增强细胞的粘附能力
IVCs小鼠笼	苏州孙悟空动物实验设备科技有限公司	HH-MMB-2型	动物屏障
L-抗坏血酸	西格玛-奥尔德里奇	A8960	BMSCs成骨分化
标记笔	斑马贸易（深圳）有限公司	YYST5	在培养皿上标记细胞信息
MEM Alpha 修改 （1X）	上海年悦生物科技有限公司	SH30265	细胞培养
小鼠骨髓间充质干细胞脂肪分化试剂盒	Cyagen	MUXMX-90031	BMSCs脂肪生成分化
尼康 Eclipse Ti2 倒置显微镜 Synstem	日本尼康公司	钛2-U	观察细胞并拍照
眼科剪刀	上海年悦生物科技有限公司	Y00030 JZ	切开皮肤
眼科镊子	上海年悦生物科技有限公司	BS-ZER-S-100 生物锐利	获取小鼠骨组织。
巴斯德移液器	上海年悦生物科技有限公司	BS-XG-03M	吸出培养基
PE大鼠抗小鼠CD31（克隆：Ha2/5）	BD生物科学	553373	流式细胞术
PE 大鼠 IgG2a，κ同型对照（克隆：R35-95）	BD生物科学	553930	流式细胞术
PE-Cyanine7 Ly-6A/E （Sca-1） 单克隆抗体（克隆：D7）	电子生物科学	25-5981-82	流式细胞术
PE-Cyanine7 大鼠 IgG2a kappa 同种型对照（克隆：eBR2a）	电子生物科学	25-4321-82	流式细胞术
青霉素-链霉素	上海年悦生物科技有限公司	2585636	细胞培养
PerCP-Cy5.5 大鼠抗小鼠 CD45（克隆：Ha2/5）	BD生物科学	561869	流式细胞术
PerCP-Cy5.5 大鼠 IgG2b，κ同型对照（克隆：A95-1）	BD生物科学	550764	流式细胞术
手术刀	上海医疗器械手术器械厂？集团有限公司	J11010-10# JZ	隔离小鼠的后肢和躯干，并去除骨骼中的外来组织
无菌罩	赛默飞世尔科技（中国）有限公司	生态0.9	手术台
无菌手术单	河南华宇医疗器械有限公司	20160900	提供无菌手术区
试管 （50 mL）	上海百赛生物科技有限公司	BLD-BL2002500	储存过滤后的细胞溶液
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	吉布科	25200056	消化贴壁细胞
&β;-甘油磷酸盐	西格玛-奥尔德里奇	G5422	BMSCs成骨分化