本方案概述了一种通过显微手术将磁性微珠植入发育中斑马鱼心脏的方法，从而实现对机械力的操控 体内 并触发心内膜细胞中机械刺激依赖性的钙离子内流。
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本文内容
摘要
摘要
机械力持续为心脏瓣膜形态发生程序提供反馈。在斑马鱼中，心脏瓣膜的发育依赖于心脏收缩以及由心跳产生的物理刺激。由血流驱动的心内血流动力学成为塑造胚胎心脏发育的基本信息。本文介绍了一种有效调控机械力的方法 体内 通过将直径为30 µm至60 µm的磁性微珠植入心脏腔内实现。微珠的植入通过显微手术在麻醉的幼体中进行，且不干扰心脏功能，从而可人工改变边界条件，进而调节系统内的流体作用力。结果表明，微珠的存在增强了内皮细胞所经历的机械力，并可直接触发机械刺激依赖性的钙离子内流。该方法有助于研究调控心脏发育的机械转导通路，并可为机械力在心脏瓣膜形态发生中的作用提供见解。
引言
自20世纪70年代末引入以来1，斑马鱼（Danio rerio）已成为研究心脏发育及先天性心脏病复杂机制的强有力模型系统。与包括小鼠和鸡胚在内的大多数脊椎动物不同，后者依赖功能性的心血管系统，无法存活于早期心脏缺陷状态，而斑马鱼则具有独特优势，能够支持对严重心脏表型的研究。这得益于其体型微小，可通过被动扩散获得充足的氧气，从而即使在缺乏心脏收缩和主动血液循环的情况下也能存活2,3,4。此外，斑马鱼众多显著特性之一是其胚胎具有光学透明性，使得对发育中心脏的无创监测成为可能5,6,7,8。
机械力持续为心脏瓣膜形态发生程序提供反馈9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22，异常血流被广泛认为是多种心血管疾病中的共同因素23,24。在斑马鱼中，心脏瓣膜的发育依赖于心脏收缩以及跳动心脏所产生的机械力。多种斑马鱼突变体已证实了心脏产生的机械刺激在瓣膜形成过程中的重要性。值得注意的是，在silent heart（sih）突变体中，由于cardiac troponin T（tnnt2）基因突变导致心脏完全丧失收缩能力，进而造成血流缺失，这会致使在早期形态发生阶段无法出现组织汇聚和心内膜细胞（EdC）聚集25。
心脏内血流动力学及血液流动产生的机械力作为表观遗传的重要组分，影响着斑马鱼胚胎心脏的发育。大量研究表明，斑马鱼心脏的正常形态发生需要特定的血流刺激，生理血流模式的偏离可导致心脏瓣膜发育缺陷10,13,14,22,26. 本文介绍了一种改进自Fukui等人报道的有效方法。13，以操控机械力 体内 通过在发育中的斑马鱼跳动心脏内植入直径为30 µm至60 µm的磁性微珠。该技术包括在不干扰心脏功能的情况下，对麻醉后的幼鱼进行显微手术，将微珠插入心腔。微珠的存在可放大内皮细胞所受的机械力，直接引发依赖机械刺激的钙离子内流13该方法能够研究调控心脏形态发生的机械转导通路，并为深入理解机械力在瓣膜形成中的作用提供途径。
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方案
本方案中所述的斑马鱼胚胎操作程序遵循欧盟指令 2010/63/EU 以及项目许可证 PP6020928 下的英国内政部指南。
1. 获取用于珠粒移植的斑马鱼胚胎
- 交配相关的斑马鱼品系，并将胚胎置于Danio's培养基中，在28.5 °C条件下培养。有关斑马鱼品系交配的更详细操作步骤，请参考JoVE科学教育数据库27。
- 从受精后24小时（hpf）开始，使用含0.003% 1-苯基-2-硫脲（PTU）的Danio's培养基处理胚胎，以抑制色素形成。
- 若使用荧光标记品系，在开始微珠移植前，先在荧光体视显微镜下观察胚胎，挑选出10–20个荧光信号强且健康的胚胎。在体视显微镜下用镊子小心去除已选定胚胎的绒毛膜，注意避免损伤胚胎。
2. 斑马鱼胚胎的固定
- 准备含有 0.02% 三卡因的 20 mL Danieau 培养基。
- 在 2 mL 微量离心管中分装 2 mL 含有 0.02% 三卡因的 1% 低熔点（LMP）琼脂糖。将试管置于 38 °C 的加热块中，以保持 LMP 琼脂糖处于液态。
注意：1% LMP 琼脂糖可提前配制，供包埋和微珠移植当天使用。 - 将 3–6 个去壳胚胎转移至含有添加了 0.02% 三卡因的 Danieau 培养基的培养皿中。
- 当胚胎麻醉后，将其转移至含少量培养基的 35 mm × 15 mm 玻璃底培养皿中。迅速加入 300–400 µL 含三卡因的 1% LMP 琼脂糖，形成穹顶状。用镊子调整胚胎位置，使其平直贴附于玻璃表面，腹面朝上，如图 1所示。等待约 4 分钟，使琼脂糖凝固。
注意：用于胚胎包埋的琼脂糖用量非常关键。目标为约 350 µL 的穹顶体积，既能充分覆盖胚胎，又在其上方保留数毫米空间。对于初学者，建议每次包埋较少数量的胚胎，以提高操作安全性。
3. 微珠移植
- 琼脂糖凝固后，取约 0.5 µL 磁珠置于其表面。
注意：使用 10 µL 移液枪头转移磁珠。由于磁珠在悬液中浓度较高，无需精确量取 0.5 µL。离心后仅需将枪头插入管中，即可获取足量磁珠。 - 在琼脂糖和磁珠表面滴加一滴含 0.02% 三卡因的 Danieau 培养基。
- 选择合适的磁珠。
注意：此步骤至关重要。磁珠直径可能存在轻微差异，范围约为 30 µm 至 60 µm，因此需根据样本及心脏大小，通过肉眼选择合适尺寸的磁珠。 - 选定合适磁珠后，使用镊子将其放置于卵黄表面（图 2A 和 视频 1）。
- 使用镊子的一臂在卵黄中心制造一个卵黄损伤或“孔洞”（图 2B 和 视频 2）。
注意：损伤深度不宜过深，应大致与主静脉水平相当。所形成的孔洞直径将与镊子臂尖端直径一致。确保损伤位于卵黄内，并避免接触主静脉，操作时应瞄准其下方。制造孔洞时通常会有少量卵黄溢出。 - 将磁珠置入第 3.5 步制造的损伤处，并轻轻向前推动，直至到达静脉极。此处心脏收缩将产生负压，使磁珠被吸入心腔内（图 2 和 视频 2）。
注意：插入磁珠时会穿透静脉壁，而卵黄的高密度有助于减少大量出血。卵黄损伤通常在磁珠植入后数分钟内愈合。部分胚胎在磁珠移植后 20–24 小时可能出现心包水肿。
4. 斑马鱼胚胎的卸载
- 将磁珠植入所有固定好的胚胎后，在玻璃底培养皿中加入 1–2 mL 含 PTU 的 Danieau's 培养基。
- 使用镊子轻轻打碎低熔点琼脂糖，并小心取出斑马鱼，确保鱼体上无残留琼脂糖。
- 用巴氏吸管将胚胎转移至含有含 PTU Danieau's 培养基的新培养皿中，于 28.5 °C 下孵育，使其恢复并继续发育。
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结果
成功的珠粒移植示例见图3、视频3和视频4。磁性珠粒被准确地置于斑马鱼心脏的心房内，血流未受阻碍，且未观察到出血现象。此外，心脏壁保持了结构完整性，未发生塌陷（图3和视频3）。移植后24小时，胚胎未出现心包水肿迹象，进一步证实了移植操作的成功（视频4）。
这些指标对于评估微珠植入的成功与否以及确定样本是否适合纳入相关研究至关重要。不符合这些标准的鱼类应予以剔除，以确保研究结果的准确性和可靠性。
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讨论
方案中的关键步骤与故障排除
斑马鱼胚胎的固定
用于固定胚胎的琼脂糖用量非常重要。形成的琼脂糖 dome 不应过大，否则会妨碍将琼脂珠从表面移动至胚胎的操作；但也不应过小，若在琼脂糖表面放置多个琼脂珠，且位置靠近胚胎及其卵黄，则可能造成混淆。建议使用约 350 µL 的体积，以充分覆盖胚胎，同时在其上方保留几毫米的空间。若琼脂糖溢出玻璃皿，则表明添加量过多。
胚胎应直接贴附在玻璃上。如果胚胎未完全浸没在琼脂糖中，例如部分胚胎漂浮，可吸取约 200 µL 的低熔点琼脂糖。轻轻吸起胚胎后重新释放，确保琼脂糖完全包裹胚胎。
可在同一个玻璃底培养皿上放置多个胚胎。为了高效地同时安装多个胚胎，在进入下一步操作前，应对所有胚胎依次完成每一步安装步骤（例如旋转和倾斜）。换句话说，应避免在开始处理下一个胚胎之前将一个胚胎完全调整到位。如果琼脂糖凝固过...
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
感谢Vermot实验室成员对本实验方案的讨论和意见。感谢伦敦帝国理工学院斑马鱼设施的所有工作人员。本项目获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的资助：资助号GA N°682939；同时获得Additional Ventures（资助编号1019496）、英国医学研究理事会（MRC，项目号MR/X019837/1）以及英国生物技术和生物科学研究所（BBSRC，项目号BB/Y00566X/1）的资助。CV-P获得了伦敦帝国理工学院生物工程系奖学金的支持。HF获得了日本学术振兴会科研费（JSPS KAKENHI，项目号23H04726和24K02207）、日本科学技术振兴机构（JST）FOREST计划（项目号23719210）、上原纪念基金会、细胞科学研究所、武田医学研究基金会以及诺华研究基金会的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>材料 | |||
| 斑马鱼饲养、繁殖和胚胎收集的关键设备 | |||
| 玻璃底培养皿（35 mm × 15 mm | VWR International | 734-2905 | |
| 加热块 | Eppendorf | EP5382000031 | Eppendorf ThermoMixer C |
| 珠宝匠镊子 | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | Dumont No. 5，L 4 1/4 英寸，Inox 合金 |
| 2 mL 微型离心管 | Eppendorf | 30120094 | |
| 巴斯德吸管 | |||
| 培养皿 | |||
| 体视显微镜 | |||
| <强>试剂 | |||
| 4 mg/mL 三卡因储存液 | |||
| Danieau's 培养基（60 倍浓缩液） | |||
| PureCube 谷胱甘肽磁珠 | Cube Biotech | 32201 | |
| PTU（1-苯基-2-硫脲） | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| UltraPure 低熔点琼脂糖 | Invitrogen | 16520-050 | |
| <强>Danieau's 培养基（60 倍浓缩液） | |||
| 34.8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 1.6 g KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 5.8 g CaCl₂·2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 9.78 g MgCl₂·6H2O | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| 将成分溶于 H2O 中，定容至 2 L。用 NaOH 调节 pH 至 7.2，然后高压灭菌。 | |||
| <强>4 mg/mL 三卡因储存液 | |||
| 400 mg 三卡因粉末（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐） | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 97.9 mL 双蒸水 | |||
| 2.1 mL 1 M Tris（pH 9） | |||
| 调节pH至7，然后分装并储存在-20 °C. |
参考文献
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