使用磁珠操纵发育中的斑马鱼心脏中的机械力

Summary

该协议概述了一种通过显微外科手术将磁珠嫁接到发育中的斑马鱼心脏的方法，能够在 体内 操纵机械力并触发心内膜细胞中机械刺激依赖性的钙内流。

Abstract

机械力不断向心脏瓣膜形态发生程序提供反馈。在斑马鱼中，心脏瓣膜的发育依赖于心脏收缩和跳动的心脏产生的物理刺激。由血流驱动的心内血流动力学成为塑造胚胎心脏发育的基本信息。在这里，我们描述了一种通过在心脏管腔中嫁接直径为 30 μm 至 60 μm 的磁珠来操纵 体内 机械力的有效方法。珠子的插入是通过显微外科手术在麻醉的幼虫中进行的，不会干扰心脏功能，并且可以人为地改变边界条件，从而改变系统中的流力。因此，磁珠的存在放大了心内膜细胞所承受的机械力，并可以直接触发机械刺激依赖性的钙内流。这种方法有助于研究控制心脏发育的机械转导途径，并可以深入了解机械力在心脏瓣膜形态发生中的作用。

Introduction

自 1970 年代后期¹ 问世以来，斑马鱼 （Danio rerio） 已成为研究心脏发育和先天性心脏病复杂性的强大模型系统。与大多数脊椎动物（包括小鼠和雏鸡胚胎）不同，它们依赖于功能性心血管系统，无法在早期心脏缺陷中存活，斑马鱼通过能够研究严重的心脏表型提供了独特的优势。这是由于它们的体积小，通过被动扩散促进了充足的氧气供应，即使在没有心脏收缩和活跃血液循环的情况下也能存活 ^2,3,4。此外，斑马鱼的许多重要特征之一是其胚胎的光学透明性，这使得能够对发育中的心脏进行无创监测 5,6,7,8。

机械力不断向心脏瓣膜形态发生程序提供反馈 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18....

Protocol

本协议中描述的处理斑马鱼胚胎的程序符合欧洲指令 2010/63/EU 和内政部在项目许可 PP6020928下的指导方针。

1. 获取斑马鱼胚胎进行珠子嫁接

1. 穿过相关的斑马鱼线，并在 28.5 °C 的 Danieau 培养基中培养胚胎。 有关穿越斑马鱼线的更详细说明，请参阅 JoVE 科学教育数据库²⁷。
2. 在Danieau培养基中使用浓度为0.003%PTU的受精后24小时（hpf）用1-苯基-2-硫脲（PTU）处理胚胎以抑制色素形成。
3. 如果使用荧光标记的线，请在开始珠子嫁接之前在荧光立体镜下检查胚胎，并选择 10-20 个表现出明亮荧光的健康胚胎。使用镊子在立体显微镜下轻轻地去绒毛膜化预选的胚胎，确保胚胎不受损伤。

2. 斑马鱼胚胎的镶嵌

1. 制备 20 mL 含有 0.02% 三卡因的 Danieau's 培养基。
2. 在 2 mL 微量离心管中制备 2 mL 等分试样，其中包含 0.02% 三卡因的 1% 低熔点 （LMP） 琼脂糖。将试管置于 38 °C 加热块中，以保持 LMP 琼脂糖处于液态。
   注:1% LMP 琼脂糖....

Results

成功的珠子接枝示例如图 3、 视频 3 和 视频 4 所示。磁珠正确定位在斑马鱼心脏的心房内，允许血流畅通无阻，没有观察到出血。此外，心脏壁保持了其结构完整性而没有塌陷（图 3 和 视频 3）。24 小时后，胚胎没有显示心包水肿的迹象，进一步证实了移植手术的成功（视频 4）。

这些指标对于评估微珠植入的成功和确定样本是否适合纳入相关研究至关重要。应排除不符合这些标准的鱼，以确保研究结果的准确性和可靠性。

Discussion

协议中的关键步骤和故障排除

斑马鱼胚胎的镶嵌

用于安装胚胎的琼脂糖的数量很重要。形成的圆顶不应过大，因为这会阻碍珠子从表面到胚胎的操作。相反，它不应该太小;琼脂糖上有多个珠子，靠近胚胎及其卵黄，可能会引起混淆。建议体积约为 350 μL，以充分覆盖胚胎，同时在胚胎上方留出几毫米的空间。如果琼脂糖溢出玻璃杯，则表明添加过多。

胚胎应直接放在玻璃上。如果胚胎没有完全浸没在琼脂糖中，例如当它的一部分漂浮时，请吸取大约 200 μL 的 LMP 琼脂糖。轻轻吸出胚胎，然后释放它，确保琼脂糖完全包围它。

多个胚胎可以安装在单个玻璃底培养皿上。要一次有效地安装多个胚胎，请在进行下一步之前对所有胚胎执行安装过程的每个步骤，例如旋转和倾斜。换句话说，避免在开始下一个胚胎之前完美地定.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>材料
斑马鱼饲养、繁殖和胚胎收集
玻璃底培养皿（35毫米x 15 mm）	VWR International	734-2905
加热块	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers 镊子	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5，L 4 1/4 英寸，不锈钢合金
微量离心管 2 mL	Eppendorf	30120094
巴斯德移液器
培养皿
体视显微镜
<强>试剂
4 mg/mL 三卡因储备液
Danieeau 培养基（60x 储备溶液）
PureCube 谷胱甘肽 MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU（1-苯基-2-硫脲）	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure 低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520-050
Danieau's 培养基（60x 储备溶液）
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl 2 ·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 克 MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
将成分溶解在 H 2 O 中，最终体积为 2 L。使用 NaOH 将 pH 值调节至 7.2，然后高压灭菌。
<强>4 mg/mL 三卡因储备液
400 mg 三卡因粉末（3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL 双蒸 H 2 O
2.1 mL 1 M Tris （pH 9）
将 pH 值调节至 7，然后分装并储存在 -20 °C。