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评估缺血性脑卒中大鼠模型中细胞死亡信号通路的免疫荧光方法

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DOI：

10.3791/67606

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2025年1月3日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Physiology, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

大鼠 体内 模型是研究缺血性脑卒中病理机制和治疗靶点不可或缺的工具。本研究将介绍在大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）后，对梗死脑组织切片进行免疫荧光染色的操作方法。

摘要

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因。大多数脑卒中病例为缺血性脑卒中，由大脑中动脉（MCA）闭塞引起。目前针对缺血性脑卒中的药物治疗手段有限，因此迫切需要开发能够有效提供神经保护、对抗脑卒中后缺血性损伤的新型疗法。在缺血性脑卒中后的脑组织中，缺血半暗带区域具有可挽救性，但存在进展为不可逆损伤的风险。围绕梗死核心的半暗带区域是神经保护的概念性靶区。由于半暗带区域的血流部分维持，该区域的神经元和非神经元细胞在脑卒中后可短暂存活，这些仍具活力的细胞可能通过适当的医学干预得以挽救。理解半暗带的病理生理学对于开发神经保护疗法至关重要，因为缺血半暗带中激活的细胞死亡通路可能提示潜在的治疗靶点，例如 RUNX1 和组织蛋白酶（cathepsins）。这些作为程序性细胞死亡介质的蛋白靶点可在转化研究中进一步加以利用。由于大鼠脑体积适中且与人类大脑具有相似性，大脑中动脉闭塞（MCAO）的in vivo大鼠模型可模拟人类缺血性脑卒中，为研究半暗带病理、分析细胞死亡信号通路以及评估在MCAO背景下潜在靶点的作用提供了可行的工具。本文中，我们描述了如何在大鼠中诱导MCAO，以及如何在MCAO后的大鼠脑组织中进行免疫荧光染色以检测细胞死亡信号通路。

引言

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因1。脑卒中高发的死亡率和致残率给公共卫生系统带来了巨大负担，并造成严重的社会经济后果。尽管脑卒中的发病率和死亡率保持稳定，但数十年来脑卒中患者人数及相关死亡人数持续增加2,3。脑卒中可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中。大多数脑卒中病例为缺血性脑卒中，由主要脑动脉闭塞引起4。迄今为止，组织型纤溶酶原激活剂（tPA）是唯一经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗缺血性脑卒中的药物，但其应用因治疗时间窗狭窄、并发症及禁忌证而受到极大限制5,6,7。因此，迫切需要开发具有更宽治疗时间窗的新型治疗手段，以减轻脑卒中的危害。

实验动物模型是研究缺血性脑卒中病理生理学的有用工具。在大多数人类患者中，缺血性脑卒中是由大脑中动脉（MCA）阻塞引起的8。因此，已开发出模拟人类脑梗死的啮齿类动物大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。尽管在小型动物研究中有多种MCAO方法，但最广泛使用的是经腔缝线模型，该方法是将尼龙细丝从颈外动脉或颈内动脉插入大脑中动脉，从而导致血流的暂时性或永久性阻断4,9。该模型可产生较大体积的脑梗死，并允许利用免疫荧光技术检测梗死脑组织中的细胞死亡信号通路。

梗死核心周围的区域被称为半暗带，是潜在卒中治疗的靶区10,11。由于半暗带区域的血流部分得以维持，该区域中受损的神经元和非神经元细胞可能通过抑制细胞死亡信号通路的激活而被挽救。靶向细胞死亡通路可能是卒中后神经保护的一种有前景的策略12。因此，评估细胞死亡信号通路对于实验性卒中研究至关重要。近年来，溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B（cathepsin-B）被发现参与介导卒中后的程序性细胞死亡，并在神经科学领域受到广泛关注13。组织蛋白酶B是一个值得进一步研究的潜在神经保护靶点。

本文演示了如何在大鼠中采用血管内缝线法诱导大脑中动脉闭塞（MCAO）。我们还展示了如何进行2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色以确定梗死体积，并利用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色检测凋亡细胞。

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方案

本方案及所报告的实验已获得四川大学医学伦理委员会批准。动物的护理和使用均符合当地及国际伦理标准。

注意：本研究使用体重为250-280 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠。大鼠饲养于标准环境条件下（温度20-22 °C，12小时光照/黑暗循环），饲喂标准大鼠配方饲料和高纯度水。手术操作在无菌条件下进行。

1. 大鼠MCAO模型

  1. 使用1 L/min氧气流速下4%异氟烷诱导初始麻醉。通过足部夹捏反应监测麻醉深度。在达到麻醉状态的同时，涂抹眼膏以防止角膜干燥。皮下注射1 mL生理盐水以补充体液容量，并给予5 mg/kg卡洛芬和0.1 mg/kg布托啡诺作为术前镇痛。手术过程中先将异氟烷浓度降至3.5%，随后逐渐降至2%。
  2. 将大鼠置于仰卧位，使用带有直肠温度探头监测的温控加热垫维持体温在36.5 ± 0.1 °C。用碘伏消毒液对颈部皮肤进行剃毛和消毒。
  3. 在颈部做一条2 cm长的正中切口，牵开软组织以暴露颈动脉。使用镊子分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。
  4. 使用缝线结扎近端右侧CCA，并在起始处用微型夹夹闭右侧ICA和ECA。
  5. 通过一个小切口将带有圆形硅胶头的尼龙单丝线插入CCA管腔，并在CCA处打结以防止出血和尼龙线移位。
  6. 打开右侧ICA的微型夹，将尼龙单丝线经ICA残端插入右侧大脑中动脉（MCA），直至硅胶头阻塞MCA起始部（约18–20 mm）。
  7. 剪除暴露在外的尼龙单丝线部分，并缝合颈部正中切口。
  8. 在MCA闭塞2小时后，重新打开颈部切口，解开CCA处的结扎线，随后撤出尼龙单丝线以实现MCA再灌注。结扎远端右侧CCA，并使用连续或间断缝合法关闭颈部切口。
  9. 术后每8小时皮下注射一次布托啡诺，剂量为0.03 mg/kg。将大鼠置于配备温控加热垫的加热笼中，全程观察其从麻醉中恢复的情况。为促进进食，可在笼内放置含磨碎饲料的培养皿。术后每笼单独饲养一只大鼠。
  10. 假手术组大鼠接受相同操作，但不插入单丝线。
    注：每组共使用9只动物，用于梗死体积测量（n = 3）、免疫荧光分析（n = 3）和凋亡检测（n = 3）。
  11. 在MCAO后2小时及再灌注后22小时，采用Zea-Longa行为评分量表（0–5分制）评估神经功能14。排除评分为0或4的动物。

2. 梗死面积的测量（图1）

  1. 在深度麻醉（4% 异氟烷）下通过断头法处死大鼠，并小心地从颅骨中分离出完整的大脑。
  2. 将大脑在 -20 °C 下冷冻 20 分钟，用切片刀将冷冻的大脑切成六片冠状切片，每片间隔 2 mm。在避光条件下，于 37 °C 用 2% TTC 染色 15 分钟。
  3. 用 4% 多聚甲醛在室温（RT）下固定脑切片 24 小时。使用数码相机以近摄自动模式拍摄染色后的切片照片。
  4. 将照片传输至计算机，使用 ImageJ 测量梗死面积。以六片中梗死区域总面积与相同切片中全脑总面积之比表示梗死大小。数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。

3. 脑冷冻切片的免疫荧光分析（图2）

  1. 使用4%异氟烷和1 L/min氧气诱导麻醉。切开皮肤和皮下组织以暴露心脏。
  2. 去除心包膜，并在右心房上做一小切口。通过左心室灌注200 mL生理盐水，随后灌注200 mL 4%多聚甲醛。
  3. 打开颅骨并取出完整的大脑。
  4. 将大脑在4%多聚甲醛中室温固定超过24小时。然后将其置于10%、15%和30%浓度的蔗糖溶液梯度中脱水，直至组织下沉，每个浓度约6–8小时。
  5. 将大脑包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并去除可能存在的气泡。随后在液氮中快速冷冻大脑，并储存于-80 °C超低温冰箱中。
  6. 使用冷冻切片机将大脑切成5 µm厚度的切片。在整个切片过程中，确保切片机柜温度维持在-18 °C至-20 °C之间。根据模型部位和实验条件标记切片位置。将切片储存于冰箱中。
  7. 让冷冻切片在室温下平衡约30分钟，以进行免疫荧光染色。然后用无菌PBS浸泡切片，每次5分钟，共3次。
  8. 使用免疫组织化学笔勾画组织轮廓。在室温下用20 µg/mL蛋白酶K（无RNase）和0.3% Triton X-100孵育10分钟。
  9. 用无菌PBS浸泡切片，每次5分钟，共3次。在已勾画区域滴加3% BSA，室温孵育1小时以进行封闭。
  10. 封闭后，吸除封闭液，加入适当的一抗（兔来源重组单克隆组织蛋白酶B抗体，1:200），于4 °C避光孵育过夜。
  11. 去除一抗后，用含0.1% Tween-20的无菌PBS洗涤切片，每次5分钟，共3次。
  12. 加入适当的二抗（山羊抗大鼠IgG [H+L] [FITC标记]，1:200）及所需荧光染料，在湿盒中室温避光孵育1小时。
  13. 二抗孵育后，用含0.1% Tween-20的无菌PBS洗涤切片，每次5分钟，共3次。用含DAPI的封片剂封片，并加盖盖玻片。
  14. 使用荧光显微镜拍摄图像，设置如下：激发波长488 nm，发射波长520 nm，曝光时间500 ms。将切片避光保存于4 °C，用于长期储存。

4. 通过TUNEL染色检测细胞凋亡（图3）

注意：TUNEL染色使用商用TUNEL检测试剂盒。该TUNEL试剂盒包含DNase I缓冲液工作液、脱氧核苷酸末端转移酶（TdT）平衡缓冲液、标记工作液和DAPI工作液。

  1. 采用与上述相同的方法（步骤 3.2–3.3）灌注并分离脑组织。将脑组织浸入 4% 多聚甲醛中固定 3–4 小时。
  2. 从脑的头端至尾端，将脑组织切成约 2 mm 厚的冠状切片，并浸入 4% 多聚甲醛中继续固定 12 小时。固定完成后，用流水冲洗脑切片 1 小时。
  3. 依次将脑切片浸入 50%、70%、80%、90%、95% 和 100% 的乙醇溶液中，每种浓度处理 35–50 分钟，以完成脱水。
  4. 用 TO 型透明生物试剂 I 处理脑切片 35–50 分钟，随后用透明试剂 II 处理 35–50 分钟，直至组织完全透明。
  5. 将脑切片依次浸入包埋介质 I 中 60 分钟、包埋介质 II 中 60 分钟、包埋介质 III 中 60 分钟、包埋介质 IV 中 60 分钟。
  6. 将脑切片放入包埋盒中，密封盒体，清晰标记，并置于低温环境中使其凝固。
  7. 将切片机初始厚度设为 10 µm，用于修整组织块；随后调整切片厚度至 5 µm 进行切片。
  8. 将水浴锅加热至 45 °C，将组织切片漂浮于水面后捞取至载玻片上。约 30 秒后取出载玻片，在室温下干燥，并存放在干燥箱中。
  9. 将储存的脑组织切片浸入透明剂中，处理 2 次，每次 10 分钟，以完成脱蜡。
  10. 为使切片复水，将其浸入无水乙醇中 5 分钟，重复 3 次；转移至 90% 乙醇中 3 分钟；再浸入 80% 乙醇中 3 分钟；最后浸入 70% 乙醇中 3 分钟。
  11. 用 PBS 漂洗样本 3 次，每次 5 分钟。用滤纸轻轻吸去多余水分。
  12. 向每个样本加入 100 µL 1× 蛋白酶 K 工作液，在 37 °C 孵育 20 分钟。通透处理后，用 PBS 漂洗样本 3 次，每次 5 分钟。
  13. 准备阳性对照样本。
    1. 向通透处理后的样本中加入 100 µL 1× DNase I 缓冲液工作液（TUNEL 检测试剂盒），在室温下平衡 5 分钟。用吸水纸小心吸去样本上多余液体。
    2. 向样本中加入 100 µL 稀释的 DNase I 工作液（200 U/mL），在 37 °C 孵育 10–30 分钟。随后用 PBS 漂洗样本 3 次，每次 5 分钟。
  14. 准备阴性对照样本。
    1. 向通透处理后的样本中加入 100 µL 1× DNase I 缓冲液工作液，在室温下平衡 5 分钟。将阴性对照样本在 37 °C 下用 DNase I 缓冲液孵育 10–30 分钟，确保不添加 DNase I 酶。随后用 PBS 漂洗样本 3 次，每次 5 分钟。
  15. 向每个样本加入 100 µL 末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）平衡缓冲液（TUNEL 检测试剂盒），在湿润孵育盒中 37 °C 孵育 10–30 分钟。然后用吸水纸吸去 TdT 平衡缓冲液。
  16. 向每个样本加入 50 µL 标记工作液（TUNEL 检测试剂盒），在湿润、避光的孵育盒中 37 °C 孵育 60 分钟。若信号强度较低，可考虑延长 DNA 标记反应时间。随后用 PBS 漂洗样本 3 次，每次 5 分钟。
  17. 吸去多余水分后，加入 DAPI 工作液（TUNEL 检测试剂盒），在室温避光条件下孵育 5 分钟，以对细胞核进行复染。然后用 PBS 漂洗 4 次，每次 5 分钟。用吸水纸吸去多余液体，使用抗荧光淬灭封片剂封片。
  18. 使用 Vectra Polaris 多光谱成像系统扫描染色后的载玻片，并利用系统软件进行数据分析。

5. 统计分析

  1. 使用 GraphPad Prism 10 软件（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）以均值 ± 标准误表示实验结果，并采用学生 t 检验进行两组间数据比较分析。
  2. 将 p 值小于 0.05 视为具有统计学差异。

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结果

大鼠在大脑中动脉阻塞（MCAO）期间经历120分钟缺血，随后进行22小时再灌注。MCAO手术期间死亡率极低，在再灌注期间约为25%。MCAO组观察到显著的脑损伤，而假手术组（Sham组）的大脑中未观察到梗死（梗死面积占全脑面积总和：24.87 ± 1.21% vs. 0%；MCAO [n = 3] vs. Sham [n = 3]，P < 0.001；图1A、B）。在MCAO组中，组织蛋白酶B（cathepsin-B）的免疫反应性在缺血核心区域明显升高（图2）（以Sham组为基准的相对强度：1.53 ± 0.02 vs. 1.00 ± 0.11；Core [n = 3] vs. Sham [n = 3]，P < 0.01；图2A、C），在半暗带皮层也显著升高（以Sham组为基准的相对强度：1.73 ± 0.14 vs. 1.00 ± 0.21；P...

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讨论

脑动脉闭塞导致氧气和营养供应中断，进而引发活性氧物质的激活、细胞内钙超载、谷氨酸释放以及炎症反应的诱导15。这一系列事件最终导致梗死脑组织中的细胞死亡和不可逆的组织损伤。缺血半暗带在适当的治疗时间窗内通过医学干预可能得以挽救16。目前唯一被批准用于缺血性卒中的治疗方法是静脉注射tPA进行溶栓治疗17；然而，tPA治疗的应用仅限于所有患者中的约5%，主要原因是其治疗时间窗较窄（卒中后最多4.5小时）18。因此，迫切需要开发具有更宽治疗时间窗的有效治疗方法。

动物疾病模型是研究缺血性脑卒中发病机制不可或缺的工具，也是开发新疗法的基础。大多数实验性脑卒中研究是在小型动物中进行的，其中大鼠是最常用的动物之一。大鼠脑血管结构与人类相似19，且其适中的体型便于开展外科手术操作。由于人类缺血性脑卒中最常受累的血管是大脑中动脉（MCA）及其分支

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披露

作者无任何披露信息。

致谢

Simiao Wu 获得了科学基金的资助 &中国四川省科学技术厅（2024YFHZ0330）和四川大学华西医院。何卫红得到了科学 &四川省科技厅（2023YFS0297）和四川大学。我们感谢四川大学华西医院研究核心设施的Yi Zhang和Yue Li在TUNEL成像与分析方面提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Akoya Vectra PolarisAkoya BiosciencesN/AVectra Polaris 多光谱成像系统 
无水乙醇成都金山化学试剂有限公司N/A
布托啡诺中国四川大学华西医院N/A
卡洛芬中国四川大学华西医院N/A
组织蛋白酶B抗体AbcamAb214428
冷冻切片机LEICA LEICA CM 1950
数码相机OLYMPUSTG-7
山羊抗大鼠IgG（H+L）（FITC标记）Elabscience E-AB-1021
山羊血清SolarbioSL038
GraphPad Prism 10 软件N/Ahttps://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
ImageJN/Ahttps://imagej.net/ij/
免疫组化笔Biosharphttp://www.biosharp.cn/index/product/details/language/zh/product_id/2828.html
InForm 软件Akoya Biosciences版本 2.6.0多光谱成像系统的系统软件 
碘伏消毒液华天科技产业有限公司N/A
异氟烷RWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
含DAPI的封片剂SolarbioS2110
尼龙单丝RWD生命科学公司https://www.rwdstco.
最佳切割温度（OCT）包埋剂EprediaN/A
多聚甲醛BiosharpN/A
磷酸盐缓冲液（PBS）SolarbioN/A
PrismGraphPad 版本 10
蛋白酶KTiangenRT403-02
生理盐水科伦公司N/A
Sprague-Dawley 大鼠华福康公司N/A
蔗糖BioFroxx1245GR500
手术器械RWD Life Science Co.N/A
TO型透明生物制剂  北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司http://www.solarbio.net/
氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液SolarbioG3005
Triton X-100BioFroxx1139ML100
TUNEL试剂盒Elabscience E-CK-A321

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