评估缺血性脑卒中大鼠模型中细胞死亡信号通路的免疫荧光方法

摘要

大鼠 体内 模型是研究缺血性脑卒中病理机制和治疗靶点不可或缺的工具。本研究将介绍在大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）后，对梗死脑组织切片进行免疫荧光染色的操作方法。

摘要

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因。大多数脑卒中病例为缺血性脑卒中，由大脑中动脉（MCA）闭塞引起。目前针对缺血性脑卒中的药物治疗手段有限，因此迫切需要开发能够有效提供神经保护、对抗脑卒中后缺血性损伤的新型疗法。在缺血性脑卒中后的脑组织中，缺血半暗带区域具有可挽救性，但存在进展为不可逆损伤的风险。围绕梗死核心的半暗带区域是神经保护的概念性靶区。由于半暗带区域的血流部分维持，该区域的神经元和非神经元细胞在脑卒中后可短暂存活，这些仍具活力的细胞可能通过适当的医学干预得以挽救。理解半暗带的病理生理学对于开发神经保护疗法至关重要，因为缺血半暗带中激活的细胞死亡通路可能提示潜在的治疗靶点，例如 RUNX1 和组织蛋白酶（cathepsins）。这些作为程序性细胞死亡介质的蛋白靶点可在转化研究中进一步加以利用。由于大鼠脑体积适中且与人类大脑具有相似性，大脑中动脉闭塞（MCAO）的in vivo大鼠模型可模拟人类缺血性脑卒中，为研究半暗带病理、分析细胞死亡信号通路以及评估在MCAO背景下潜在靶点的作用提供了可行的工具。本文中，我们描述了如何在大鼠中诱导MCAO，以及如何在MCAO后的大鼠脑组织中进行免疫荧光染色以检测细胞死亡信号通路。

引言

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因¹。脑卒中高发的死亡率和致残率给公共卫生系统带来了巨大负担，并造成严重的社会经济后果。尽管脑卒中的发病率和死亡率保持稳定，但数十年来脑卒中患者人数及相关死亡人数持续增加^2,3。脑卒中可分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中。大多数脑卒中病例为缺血性脑卒中，由主要脑动脉闭塞引起⁴。迄今为止，组织型纤溶酶原激活剂（tPA）是唯一经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗缺血性脑卒中的药物，但其应用因治疗时间窗狭窄、并发症及禁忌证而受到极大限制^5,6,7。因此，迫切需要开发具有更宽治疗时间窗的新型治疗手段，以减轻脑卒中的危害。

实验动物模型是研究缺血性脑卒中病理生理学的有用工具。在大多数人类患者中，缺血性脑卒中是由大脑中动脉（MCA）阻塞引起的⁸。因此，已开发出模拟人类脑梗死的啮齿类动物大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。尽管在小型动物研究中有多种MCAO方法，但最广泛使用的是经腔缝线模型，该方法是将尼龙细....

方案

本方案及所报告的实验已获得四川大学医学伦理委员会批准。动物的护理和使用均符合当地及国际伦理标准。

注意：本研究使用体重为250-280 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠。大鼠饲养于标准环境条件下（温度20-22 °C，12小时光照/黑暗循环），饲喂标准大鼠配方饲料和高纯度水。手术操作在无菌条件下进行。

1. 大鼠MCAO模型

1. 使用1 L/min氧气流速下4%异氟烷诱导初始麻醉。通过足部夹捏反应监测麻醉深度。在达到麻醉状态的同时，涂抹眼膏以防止角膜干燥。皮下注射1 mL生理盐水以补充体液容量，并给予5 mg/kg卡洛芬和0.1 mg/kg布托啡诺作为术前镇痛。手术过程中先将异氟烷浓度降至3.5%，随后逐渐降至2%。
2. 将大鼠置于仰卧位，使用带有直肠温度探头监测的温控加热垫维持体温在36.5 ± 0.1 °C。用碘伏消毒液对颈部皮肤进行剃毛和消毒。
3. 在颈部做一条2 cm长的正中切口，牵开软组织以暴露颈动脉。使用镊子分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。
4. 使用缝线结扎近端右侧CCA，并在起始处用微型夹夹闭右侧ICA和ECA。
5. 通过一个小切口将带有圆形硅胶头的尼龙单丝线插入CCA管腔，并在CCA处打结以防止出血和尼龙线移位。
6. 打开右侧....

结果

大鼠在MCAO期间接受120分钟缺血，随后进行22小时再灌注。MCAO手术期间死亡率极低，再灌注期间死亡率约为25%。MCAO组出现显著脑损伤，而假手术组大脑未观察到梗死（梗死面积占全脑面积总和：24.87 ± 1.21% vs. 0%；MCAO [n = 3] vs. 假手术组 [n = 3]） P < 0.001; 图1A,B）。在MCAO组中，组织蛋白酶B的免疫反应性显著增强（图2缺血核心中的组织蛋白酶B强度（以假手术组为基准的倍数表示）：1.53 ± 0.02 vs. 1.00 ± 0.11；核心组 [n = 3] vs. 假手术组 [n = 3]， P < 0.01; 图 2A,C)和缺血半暗带皮层（组织蛋白酶B强度以假手术组为倍数表示：1.73 ± 0.14 vs. 1.00 ± 0.21；缺血半暗带 [n = 3] vs. 假手术组.......

讨论

脑动脉闭塞导致氧气和营养供应中断，进而引发活性氧物质的激活、细胞内钙超载、谷氨酸释放以及炎症反应的诱导¹⁵。这一系列事件最终导致梗死脑组织中的细胞死亡和不可逆的组织损伤。缺血半暗带在适当的治疗时间窗内通过医学干预可能得以挽救¹⁶。目前唯一被批准用于缺血性卒中的治疗方法是静脉注射tPA进行溶栓治疗¹⁷；然而，tPA治疗的应用仅限于所有患者中的约5%，主要原因是其治疗时间窗较窄（卒中后最多4.5小时）¹⁸。因此，迫切需要开发具有更宽治疗时间窗的有效治疗方法。

动物疾病模型是研究缺血性脑卒中发病机制不可或缺的工具，也是开发新疗法的基础。大多数实验性脑卒中研究是在小型动物中进行的，其中大鼠是最常用的动物之一。大鼠脑血管结构与人类相似¹⁹，且其适中的体型便于开展外科手术操作。由于人类缺血性脑卒中最常受累的血管是大脑中动脉（MCA）及其分支

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Akoya Vectra Polaris	Akoya Biosciences	N/A	Vectra Polaris 多光谱成像系统
无水乙醇	成都金山化学试剂有限公司	N/A
布托啡诺	中国四川大学华西医院	N/A
卡洛芬	中国四川大学华西医院	N/A
组织蛋白酶B抗体	Abcam	Ab214428
冷冻切片机	LEICA	LEICA CM 1950
数码相机	OLYMPUS	TG-7
山羊抗大鼠IgG（H+L）（FITC标记）	Elabscience	E-AB-1021
山羊血清	Solarbio	SL038
GraphPad Prism 10 软件	N/A	https://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
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免疫组化笔	Biosharp	http://www.biosharp.cn/index/product/details/language/zh/product_id/2828.html
InForm 软件	Akoya Biosciences	版本 2.6.0	多光谱成像系统的系统软件
碘伏消毒液	华天科技产业有限公司	N/A
异氟烷	RWD Life Science Co.	https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
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