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延时落射荧光显微成像 铜绿假单胞菌 和 Staphylococcus aureus 异质性表型

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DOI：

10.3791/67617

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2025年2月14日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology & Biophysics, UConn Health, 2School of Dental Medicine, UConn Health, 3Richard D. Berlin Center for Cell Analysis and Modeling, UConn Health

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在本论文中，我们提供了一套全面的实验方案，用于评估铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗生素存活能力，通过将质粒转化至铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）中构建报告菌株，并利用延时落射荧光 显微镜观察 表型变异体（如持留菌）。

摘要

抗生素耐受性是指在遗传上易感的细菌群体中，有少数细菌细胞能够在杀死其他遗传相同细胞的抗生素处理下存活的现象。一旦抗生素治疗结束，这些耐受性细菌可以恢复复制，通常被认为与临床治疗失败有关。  近年来，研究人员利用延时荧光显微镜技术取得了进展，该技术通过使用荧光转录报告基因、翻译报告基因和/或针对多种细胞特征的染料对细菌进行标记，使我们对大肠杆菌（Escherichia coli）耐受菌的理解超越了仅通过群体水平抗生素存活实验所能获得的信息。相较于整体群体检测，此类单细胞研究方法对于阐明耐受菌形成机制、损伤应答及存活过程至关重要。然而，在其他重要致病菌物种中，仍缺乏在如此精细水平上研究耐受菌的有效方法。

本研究提供了一种可调节的方法，用于在抗生素处理及恢复期间对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，一种革兰氏阴性杆菌）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，一种革兰氏阳性球菌）进行延时成像。 我们讨论了将荧光报告基因引入这些细菌的分子遗传学方法。利用这些报告基因以及染料，我们能够追踪单个细胞在抗生素处理下的表型变化、形态特征及其命运。此外，我们还能观察到持留菌个体在治疗后复苏过程中的表型。总体而言，本研究为关注临床重要病原体中单个抗生素处理细胞（包括持留菌）在治疗期间及治疗后存活情况和基因表达动态的研究者提供了有价值的参考资源。

引言

细菌病原体可通过两种主要机制逃避抗生素的作用：一种是涉及遗传改变的抗生素耐药性，另一种是涉及非遗传改变的表型耐受性。抗生素耐药性是一种由基因编码的现象，赋予特定细菌细胞在抗生素存在条件下不仅存活而且进行复制的能力1。表型耐受性包括对抗生素耐受或持留的细菌，其发生在细胞能够经受杀菌性抗生素处理，但并未获得在抑制浓度抗生素存在下复制的能力时1,2。耐受性与持留性的区别在于，耐受性指的是整个菌群具有在治疗中存活的能力，而持留性则指在一个基因型相同但表型异质的菌群中，有一小部分亚群能够在抗生素治疗中存活。当对克隆培养物使用杀菌性抗生素，并将培养物中存活下来的细菌数量随时间以对数-线性标度作图时，若存在持留菌，通常会观察到双相曲线。在这些曲线上，第一阶段显示大部分菌群被相对较快地杀死，第二阶段则表明抗生素持留亚群被杀死的速度更慢，甚至完全不被杀死1,2。

抗生素耐受性对全球医疗系统构成了重大负担。例如，本文重点关注的Staphylococcus aureus和Pseudomonas aeruginosa耐受菌，被认为可导致对抗生素治疗不敏感的感染，包括囊性纤维化患者中反复发作的呼吸道感染以及慢性伤口感染3,4。因此，进一步阐明耐受细胞的生物学特性及其表型调控程序至关重要。尽管在理解耐受菌的形成与复苏机制方面已取得进展，但关于单个细胞中代谢重编程与分子事件协调运作以维持耐受性的关键知识仍存在空白5,6,7,8。

有效研究持留现象已被证明是一项技术上的挑战。由于持留现象仅在细菌群体的一小部分亚群中可被观察到，因此那些针对整体细菌群体进行取样的技术往往无法捕获相关的生物学信息1,2,8,9,10。此外，由于导致持留的表型变化是短暂的且不可遗传，追踪持留细胞命运的过程可能十分复杂1,8,9,10,11。一旦细菌持留细胞恢复生长，它们可以分裂并产生持留和非持留两种子代细胞，这使得通过培养手段无法富集得到纯的持留细胞群体。这些挑战凸显了对满足以下两个条件的技术需求：1）能够获取活体单个细胞的生物学信息；2）能够与荧光染料、探针、传感器和报告系统联合使用，以便随时间推移对异质群体中单个细胞的表型进行检测。

单细胞技术的最新进展为有效研究细菌异质性以及克服持久性研究中的这些障碍提供了途径12,13。其中一些技术包括荧光显微镜、流式细胞术/荧光激活细胞分选、微流控技术以及单细胞RNA测序12,13。本文描述了利用转录或翻译报告菌株进行落射荧光延时显微镜观察，以阐明单细胞持久性生理特性的实验方案。荧光显微镜是一种强大的技术，能够满足研究持久性表型的关键标准，即识别在大量细胞群体中，哪些单个细胞在抗生素去除后能够继续增殖，从而被定义为持久性细胞。随着自动成像技术和恒温培养腔的引入，活体细菌细胞的动态观察已在微生物学领域广泛普及。尤为重要的是，延时显微镜能够在数小时甚至数天的时间内实时观察单个细胞，从而实现对抗生素处理前、处理中和处理后细菌行为的连续追踪14,15,16。利用延时显微镜开展的这些研究有望深入揭示持久性生物学的复杂机制。

方案

1. 通过转化和转导构建  S. aureus 的荧光报告菌株

注意：报告菌株携带一种荧光蛋白，用于指示目的基因或蛋白的表达情况。转录报告系统在目的基因上游引入其天然启动子序列的重复拷贝，并将其连接至荧光蛋白，从而使荧光强度随目的基因表达水平的升高而增强。翻译报告系统则通过一段柔性肽连接子将荧光蛋白与目的蛋白的开放阅读框连接在一起。利用活细胞显微镜观察报告菌株，可揭示特定目的基因/蛋白是否与特定的细胞形态或细胞命运相关（图1、补充视频1 和 补充游戏副本2）。应选择在 S. aureus 中经过密码子优化的荧光蛋白。本研究使用了由 Alexander Horswill 博士提供的 pCM29 质粒中的 sGFP，而内布拉斯加转座子突变文库遗传工具包中则包含携带密码子优化的 sGFP、eYFP、eCFP、DsRed.T3 和 eqFP650 的质粒17,18。

  1. 将报告基因质粒转化至 S. aureus RN4220
    注意：以下实验方案部分改编自内布拉斯加大学医学中心“葡萄球菌遗传学与代谢基础”研讨会19,20.
    1. 首先，制备电转感受态细胞 S. aureus RN4220。通过混合2 g酪蛋白氨基酸、5 g酵母提取物和2 mL 10% K2HPO4，pH 7.5，50%葡萄糖溶液2 mL，NaCl 5 g。用无菌超纯水定容至100 mL。37 °C下短暂混匀以溶解组分，使用瓶顶滤器（孔径0.22 µm）过滤除菌。
    2. 接种 S. aureus 从-80 °C保存于25%甘油中的冻存菌种RN4220接种至250 mL带挡板的三角瓶中的30 mL B2液体培养基中，于30 °C、125 rpm振荡培养18 h。
    3. 将两个250 mL带挡板的锥形瓶各装入50 mL B2肉汤，于37 °C过夜培养，以预热次日使用的培养基。
    4. 第二天，测定OD值600 过夜培养物。向每个含有50 mL B2培养基的锥形瓶中加入足量的过夜培养物，使终末OD值达到指定范围。600 0.25
    5. 37 °C、250 rpm 振荡培养，直至 OD600 达到 0.35-0.4。
      注意：检测 OD600 传代培养后约30分钟，以确保培养物的OD值不超过0.35–0.4。如果OD600 若传代培养1小时内吸光度未达到0.35–0.4，则应中止实验，于次日重新尝试。细菌很可能在前一晚过度生长，已过早进入稳定期。
    6. 当培养物进入对数中期时，将每瓶培养物倒入无菌的50 mL锥形管中，于4,000 × g离心收集细胞沉淀 x g 10 分钟
    7. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL无菌的室温（RT）水中。将细胞转移至微量离心管中。
    8. 再次以21,000离心细胞 x g 30秒后，弃上清，加入1 mL无菌室温水重悬。重复离心、弃上清及用1 mL水重悬步骤两次，共洗涤三次。
    9. 离心细胞，去除上清液，然后将细胞重悬于 1 mL 无菌室温 10% 甘油（溶于水）中， 经无菌过滤后，室温放置15分钟。
    10. 通过离心在21,000 × g下沉淀细胞 x g 静置30秒，弃上清，将细胞重悬于另1 mL无菌、室温的10%甘油溶液中。此时细胞已具备电转感受态。
    11. 将70 µL电转感受态细胞分装至带盖微型离心管中，于-80 °C保存以备后续使用。
    12. 将电转感受态细胞进行转化 S. aureus RN4220，将一份细胞在冰上解冻。向细胞中加入1 µg质粒DNA，轻弹混匀，冰上孵育5分钟。随后对细胞进行电穿孔转化，然后在390 μL B2培养基中于37 °C、225 rpm振荡培养1–2小时使其恢复生长，最后将转化子涂布于选择性胰蛋白胨大豆琼脂平板上培养。
      注意：本研究中使用的大多数穿梭载体均带有氨苄青霉素抗性盒，用于在大肠杆菌中进行筛选 E. coli （100 µg/mL）和用于筛选的氯霉素抗性盒（10 µg/mL）或红霉素抗性盒（Erm，10 µg/mL） S. aureus 许多 S. aureus 实验室常规使用的菌株具有红霉素抗性。在使用特定穿梭载体前，需确保目标菌株与所选抗生素筛选系统相容。添加至细胞的DNA体积应尽量最小化（即 <5 µL）以防止电穿孔过程中因样品导电性过高而产生电弧。从高浓度（≥300 ng/µL）质粒DNA中纯化时 E. coli 有助于保持体积较小。
  2. 在转化菌中扩增噬菌体 S. aureus RN4220
    注意：以下实验方案部分改编自 Krausz 和 Bose 的方法21 和 Olson22最常用的两种噬菌体 S. aureus 转导是 φ11 和 80α。这两种噬菌体的收获步骤相同，只是φ11来源于 S. aureus RN451 和 80α 来自 S. aureus RN10359。φ11 已成功用于常见菌株 JE2 以及HG003等，并在本方案中使用23,24然而，这些噬菌体可能无法高效转导具有不同噬菌体抗性的临床分离株。请参考 Krausz 和 Bose 的相关文献。21 和 Olson22 用于制备φ11及测定噬菌体滴度的方法。
    1. 为了转导报告质粒，准备六块含 5 mM CaCl₂ 的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板2 以及选择性抗生素的适当浓度。划线接种 S. aureus 将含有报告质粒的RN4220转化菌接种于含选择性抗生素但不含CaCl的TSA平板上2 并在4℃孵育过夜。
    2. 第二天，将培养箱或水浴锅调至 56 °C。标记六个 5 mL 带盖离心管，分别标注为 1 x 104 通过 1 x 109，分装 40 µL 的 500 mM CaCl₂2 到每个带盖螺帽管中。
    3. 在微波炉中融化软性TSA培养基（含0.5%琼脂），瓶盖需松开以防止压力积聚，同时保持无菌状态。随后，将4 mL培养基分装至各旋盖试管中。颠倒试管以混匀，然后置于56 °C培养箱中，防止软琼脂凝固。
    4. 将噬菌体原液稀释至1 ×1010 PFU/mL 于胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）+ 5 mM CaCl₂2. 加入100 µL的1 ×1010 PFU/mL 噬菌体加入含有 900 µL TSB + 5 mM CaCl 的微量离心管中2 最终浓度为 1 × 109 PFU/mL。然后，依次稀释至含有 900 µL TSB + 5 mM CaCl 的其他微量离心管中2 直至浓度达到1 ×104 PFU/mL。标记六个TSA + 5 mM CaCl2 + 含系列稀释的抗生素选择性琼脂平板：1 × 104  通过 1 ×109 PFU/mL
    5. 重悬过夜培养的菌体 S. aureus 含质粒的RN4220，置于1 mL TSB + 5 mM CaCl中2. 移除109 从培养箱中取出带盖螺帽管并迅速 加入10 µL含有质粒的重悬RN4220菌液和100 µL的1 × 109 PFU/mL 噬菌体稀释液，颠倒混匀，将内容物倾注至相应的含 5 mM CaCl₂ 的 TSA 培养基上2 + 选择性抗生素琼脂平板
    6. 对剩余的噬菌体稀释液执行此操作步骤 各自的培养皿中。让软琼脂在培养皿中凝固，然后将培养皿倒置（软琼脂面向上），于37 °C孵育过夜。
    7. 次日，确保平板上可见噬菌斑（细菌菌苔上出现的透明区域）图2A）。噬菌斑代表噬菌体成功感染RN4220后产生的裂解区域，部分噬菌体已携带目标质粒。选择噬菌体原液稀释度最低且裂解区域接近融合的平板（示例：1 × 109 PFU/mL 噬菌体）以及接受低于该稀释度两个梯度的平板（在此情况下，1 ×108 PFU/mL 和 1 ×107 PFU/mL，两者均应接近完全裂解。
    8. 加入 3 mL 含 5 mM CaCl 的 TSB2 到这些平板中最不稀释的（1 x 109 PFU/mL（以本示例为准）。使用无菌的L型细胞刮铲轻轻将软琼脂层从普通琼脂上刮下（图2B）。使用细胞涂布器尽可能打散琼脂，以促进噬菌体从软琼脂中释放。
    9. 一旦第一块平板上的软琼脂被彻底打散，轻轻将软琼脂与肉汤的混合物倒入下一块平板（此处为1） ×108 PFU/mL）。刮取并搅碎该平板上的软琼脂，然后将所得的混悬液倒入最终平板中，并重复此操作。
    10. 从三个培养皿中制备软琼脂悬液后，轻柔地将悬液倒入50 mL圆锥形离心管中。用移液器轻轻吹打以进一步分散软琼脂，但避免产生气泡。切勿涡旋振荡，以免损伤噬菌体并降低滴度。
    11. 将软琼脂浆液在4,000离心 x g 室温下静置10分钟。将上清液缓慢倒入连接有0.45 µm滤器的注射器中。
      注意：倾倒时务必轻柔，避免将琼脂碎片倒入滤器中。这些碎片会堵塞滤器，阻碍剩余上清液的过滤，从而降低滴度。
    12. 使用野生型 RN4220 测定所得噬菌体裂解液的滴度21.
  3. 将报告基因质粒导入 S. aureus 通过转导获得目标菌株。
    1. 准备8个含有500 µg/mL柠檬酸钠及适当浓度选择性抗生素的TSA平板。将目标受体菌密集划线接种 S. aureus 接种于普通TSA平板，37 °C过夜培养。
    2. 第二天，用拭子刮取平板，将受体菌株重悬于 1 mL TSB + 5 mM CaCl 中2.
    3. 将含有目标报告质粒的噬菌体原液稀释至 1 × 1010 PFU/mL
    4. 混合 1.5 mL TSB + 5 mM CaCl2，0.5 mL 重悬的感受态菌株，以及 0.5 mL 稀释的噬菌体原液 在50 mL锥形管中，37 °C、225 rpm振荡孵育20分钟。
      注意：不建议延长孵育时间，因为噬菌体可能开始裂解受体细胞，从而降低转导效率。
    5. 立即向锥形管中加入 1 mL 经无菌过滤的预冷至冰浴温度的 0.02 M 柠檬酸钠溶液（溶于水），并在 4,000 x g 4 °C下离心10分钟。然后，将沉淀重悬于1 mL预冷的0.02 M柠檬酸钠溶液中。
    6. 将100 µL菌液分别涂布于六块含有500 µg/mL柠檬酸钠及适当浓度选择性抗生素的TSA平板上，以筛选转导子。37 °C过夜培养。
    7. 第二天，从转导平板上挑取单菌落，划线接种至另外两个含有 500 µg/mL 柠檬酸钠及适当浓度选择性抗生素的 TSA 平板。37 °C 过夜培养。
      注意：在额外的柠檬酸钠平板上进行此传代步骤有助于降低转导细胞周围噬菌体的滴度，防止细胞裂解22.
    8. 从划线平板上挑取单菌落，将细胞在含有选择性抗生素的TSB培养基中培养至对数生长期，然后于-80 °C条件下保存在25%甘油中，以备后续使用。

通过接合生成  P. aeruginosa 的荧光报告菌株

注意：将报告质粒从大肠杆菌（E. coli）克隆菌株转移至铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）可通过三亲杂交法实现25。该过程需要三种菌株：携带目标质粒的E. coli供体菌株（该质粒应含有用于接合转移的oriT序列）、辅助菌株E. coli HB101 + pRK2013（用于促进接合反应，pRK2013质粒需使用50 µg/mL卡那霉素维持），以及将接收该质粒的P. aeruginosa受体菌株。以本实验为例，目标质粒带有四环素（Tet）抗性标记，因此含有该质粒的E. coli培养物需添加10 µg/mL四环素进行筛选，而含有该质粒的P. aeruginosa则需添加75 µg/mL四环素进行筛选26。

  1. 从保存在 -80 °C 含 25% 甘油的冻存菌种中接种细菌至含适当抗生素的胰蛋白胨肉汤（LB）培养基中，于 37 °C、225 rpm 振荡培养过夜。
  2. 次日，取每种过夜液体培养物 200 µL 涂布于含相应选择性抗生素的 LB 琼脂平板上。根据需要进行的转化接合反应数量，为辅助菌株和供体菌株涂布更多平板。建议每个转化反应使用一个辅助菌/供体菌平板。于 37 °C 培养过夜，以获得各菌株密集的菌苔。
  3. 次日，用无菌棉签擦拭每个平板表面收集菌苔，并将棉签在微量离心管内壁上涂抹以转移细胞。短暂离心（脉冲离心 5 秒）使细胞沉淀至管底。将每个细胞沉淀重悬于 200 µL LB 培养基中。
    注意：重悬液应显得非常浓稠、不透明，且无团块。
  4. 为每组接合反应准备新的微量离心管，加入 5 µL 受体菌 P. aeruginosa 菌株、160 µL 携带目标质粒的供体 E. coli 菌株以及 160 µL 辅助菌 E. coli HB101 + pRK2013。轻轻混匀，通过移液器吹打数次，然后取 50 µL 混合液点样于预先干燥的 LB 琼脂平板上。同时，将每种单独菌株各取 20 µL 点样于 LB 琼脂平板作为对照。待液滴完全干燥后，于 37 °C 培养 3–6 小时。
    注意：预先干燥 LB 琼脂平板可防止 50 µL 液滴在表面扩散，从而迫使细胞在较小区域内相互作用。
  5. 培养后，用移液器吸头轻轻刮取接合反应点，将部分细胞转移至新的微量离心管中。短暂离心使细胞沉淀至管底。用 200 µL LB 重悬细胞沉淀，并将全部重悬液涂布于含 Irgasan（Igr；25 µg/mL）和 Tet（75 µg/mL）的 LB 琼脂平板上。
    注意：P. aeruginosa 对 Irgasan 具有天然抗性，而目标质粒含有 Tet 抗性标记，因此只有成功转化的 P. aeruginosa 能在 LB + Irgasan + Tet 平板上生长。根据转化效率，若将整个接合点重悬并涂布，次日可能形成致密菌苔。为获得单菌落，可选择：(i) 将整个接合点重悬于更大体积的 LB 中，再取 200 µL 涂布；或 (ii) 仅转移接合点的一小部分至微量离心管，用 200 µL LB 重悬后涂布。
  6. 对于各单独菌株的对照点，用移液器吸头轻轻刮取部分浓密菌斑，转移至新的微量离心管，用 200 µL LB 重悬，然后点样 50 µL 至 LB + Irgasan + Tet 琼脂平板（多个对照点可置于同一平板上）。待液滴完全干燥。所有平板于 37 °C 培养 16–20 小时过夜。
    注意：对照点的目的是验证抗生素平板对 P. aeruginosa 转化子具有选择性。若对照点在 LB + Irgasan + Tet 平板上浓度过高，则次日难以判断选择是否有效，因为会出现死亡细胞形成的晕圈，可能被误认为生长。
  7. 次日，通过观察各单独菌株对照点无细胞生长，确认 LB + Irgasan + Tet 平板的抗生素选择性。
    注意：在三亲接合 LB + Irgasan + Tet 平板上出现的菌落为携带目标质粒的 P. aeruginosa 转化子 。
  8. 可选步骤：挑取并划线分离菌落至 LB + Irgasan + Tet 琼脂平板，过夜培养以去除接合混合物中残留的死亡 E. coli。
  9. 挑取单菌落，在含 Tet（75 µg/mL）的液体 LB 培养基中培养 3–6 小时，直至明显浑浊，随后制备冻存菌种（500 µL 菌液 + 500 µL 水中 50% 甘油，终浓度为 25% 甘油）。通过菌落 PCR 及 Sanger 测序或全质粒测序验证克隆是否成功转化。

3. 确定用于持留菌检测的抗生素剂量

注意：为了选择用于处理细菌群体以进行持留菌实验的某种抗生素剂量，首先需要测定该抗生素对目标菌株的最小抑菌浓度（MIC）。可通过肉汤微量稀释法（临床与实验室标准协会（CLSI）推荐的方法）或Epsilometer试验（E-test，使用含有抗生素剂量梯度的试纸条）来完成测定27。确定MIC后，选择至少五种抗生素浓度用于细胞处理，浓度范围应为1至100倍MIC。

  1. 从保存在 -80 °C 含 25% 甘油的冷冻菌种中接种细菌至 2 mL 阳离子调节的肉汤培养基（CA-MHB）或其他营养丰富的培养基中。在 37 °C、250 rpm 振荡条件下培养约 4 小时，随后将 125 µL 菌液转移至装有 25 mL 新鲜化学成分明确培养基的 250 mL 带挡板锥形瓶中。在 37 °C、250 rpm 振荡条件下继续培养 16 小时（至稳定期）。
    注意：通常使用以琥珀酸为唯一碳源的基础盐培养基（BSM）进行 P. aeruginosa 实验，而富含营养的化学成分明确培养基 通常用于 S. aureus 实验28,29,30,31。
  2. 次日早晨，配制所需超 MIC 浓度范围的 100 倍抗生素母液（使用相应的溶剂），并将每种稀释液各 10 µL 加入单独的试管中。
  3. 测定过夜培养菌液的 OD600 以确认其处于稳定期的浊度。取 10 µL 菌液进行系列稀释，并将各稀释液涂布于营养性琼脂平板（如 LB 琼脂、CA-MHB 琼脂或 TSA 琼脂）上，以确定抗生素处理前的菌落形成单位（CFU）。
  4. 进行抗生素处理时，将 1 mL 菌液分装至含有 10 µL 100 倍浓度抗生素的各试管中。在 37 °C、250 rpm 振荡条件下孵育一定时间，以确保杀灭群体中非持留菌，仅保留具有菌落形成能力的持留菌。
    注意：处理时间可根据具体实验和测试菌株的不同而有所调整。通常 S. aureus 处理 5 小时或 7 小时，而 P. aeruginosa 处理 7 小时或 24 小时。一般而言，时间依赖性存活实验第二相中的任意时间点均可用于分析，因为该阶段剩余的细胞预期为持留菌。
  5. 抗生素处理后，将 100 µL 菌液从试管转移至含有 900 µL 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的微量离心管中。在室温下以 21,000 x g 离心 3 分钟收集菌体。弃去上清液 900 µL，将菌体沉淀重悬于 900 µL 无菌 PBS 中。至少重复洗涤一次，以将残留抗生素浓度降低至 MIC 以下水平。
  6. 将菌液进行 10 倍系列稀释（共 6 次），取每种稀释液 10 µL 涂布于营养性琼脂平板上。在 37 °C 下过夜培养。
    注意：使用未经处理的圆底 96 孔板进行系列稀释，并使用多通道移液器将菌液点样至方形琼脂平板上。
  7. 次日，计数各抗生素浓度下的菌落数。以对数-线性坐标绘制存活率（处理结束时的 CFU / 处理前的 CFU）随抗生素浓度变化的曲线。为后续持留菌实验选择药物浓度时，应选取双相曲线第二相中的浓度（图 3）。

4. 抗生素处理或恢复期间对细胞进行成像

  1. 制备琼脂糖垫和细胞样品用于延时成像
    注意：以下样品制备方案是作为传统琼脂糖凝胶电泳的一种用户友好、成本效益高的替代方法而开发的 "三明治" 方法14,16使用可更换盖玻片培养皿可避免使用 messy 的油脂或指甲油来密封样品，从而进一步限制样品的通气。琼脂糖被直接注入已装好盖玻片的可更换盖玻片培养皿中，相较于手工制备的琼脂糖垫，能够形成更可靠且平整的琼脂糖表面。总体而言，该方法实现了在整个视野范围内更佳的聚焦成像效果，并因稳定的保湿环境而支持更长时间的成像观察。本文所述方法用于在抗生素处理期间对细菌进行可视化观察图4, 补充视频 3，以及 补充视频 4). 为观察持留菌在抗生素处理后复苏和重新活化的过程（图5, 补充视频 5，以及 补充视频 6），使用新鲜培养基制备琼脂糖垫，而非使用过的培养基，并且不要向琼脂糖垫中添加抗生素（用于质粒维持或抗生素筛选的除外）。
    1. 将一个无菌的30 mm盖玻片（#1.5厚度）放入可换盖玻片培养皿的不锈钢底座底部"腔室"将聚碳酸酯插入件轻轻插入底座中，使30 mm盖玻片构成培养腔的底部，并通过压缩附带的硅胶O型圈将其密封固定。重复此步骤以制备第二个相同的培养腔。
      注意：建议每个实验设置重复样本，以防某个腔室的制备效果不理想。将定制的3D打印分隔器紧贴30 mm盖玻片放置，以防止运动性细胞如 P. aeruginosa 防止交叉污染，并为样品位置提供定位标记。用于3D打印的STL文件可在 补充文件 1。
    2. 在50 mL锥形管中，使用选定的培养基配制1.5%琼脂糖溶液，轻柔混匀。
      注意：在处理过程中对静止期细胞进行成像时，使用静止期过夜培养物的无细胞培养上清作为基础培养基。通常，琼脂糖培养基的制备方法为将0.105 g琼脂糖溶于7 mL培养基中，用于制备两个微室；每个微室需要2 mL琼脂糖培养基，多余部分有助于在移液时避免产生气泡。
    3. 将50 mL锥形管放入玻璃烧杯或微波炉安全支架中（确保管盖松动）。高火微波加热，每3-4秒暂停一次，摇动并混匀。需频繁暂停并混合，以防止琼脂糖溶液沸腾溢出。
      1. 加热约1分钟后，检查是否出现 任何可见的琼脂糖 未融化的物质完全消失，混合物呈均匀透明状态后，将琼脂糖培养基短暂冷却至约60 °C，再加入其他药物或染料。轻轻摇动混匀，避免产生气泡。
        注意：碘化丙啶（16 µM，用于 P. aeruginosa 或 1.6 µM S. aureus）可以被 用于指示细胞活力丧失的情况。
    4. 为防止琼脂糖培养基凝固，迅速将2 mL琼脂糖培养基移液至带有30 mm盖玻片的腔室中。在顶部腔室开口的琼脂糖培养基上轻轻覆盖一片无菌的25 mm盖玻片（#1.5厚度），以防止琼脂糖垫脱水，并确保琼脂糖表面平整，利于获得优质的相差显微图像。静置1–2小时，使琼脂糖垫完全凝固。
    5. 在垫层凝固后，用 PBS 将待成像细胞稀释至适当稀疏的密度，以便观察单个细胞。此处，细胞被稀释至 OD600 0.01-0.05.
    6. 在25 mm盖玻片上，使用细头永久性记号笔标记垫片上每个样品的位置/编号。将培养室倒置，使不锈钢底环朝上，同时用手小心托住下方的聚碳酸酯插入件，旋开底座。将不锈钢底座放置在一旁。小心地将30 mm盖玻片从垫片上滑下并弃去。
      注意：通过水平滑动移除30 mm盖玻片，注意不要压陷琼脂糖表面。同时，避免在暴露的琼脂糖表面区域上方操作：任何落入其上的灰尘都会影响成像质量，并可能污染凝胶垫。
    7. 根据25 mm盖玻片上的标记进行定位，将5 µL稀释后的细胞悬液点加到琼脂糖垫的相应位置。每个位置点加3个5 µL的液滴（可根据需要调整，例如改为4个4 µL的液滴等）。待液滴完全干燥后，将一片新的无菌30 mm盖玻片轻轻置于琼脂糖垫中央。
    8. 一只手握住聚碳酸酯插入件，另一只手缓慢将不锈钢底座重新旋回，覆盖在新的盖玻片上。旋紧至仅用手感达到适度紧固即可，足以压紧硅胶O型圈并密封腔室。
      注意：切勿过度拧紧——若30 mm盖玻片受到不锈钢底座压迫并反复扭转，细胞可能呈放射状扩散，从而导致样本交叉污染。
    9. 一旦密封腔室，观察琼脂糖是否接触到30 mm盖玻片的表面；此时通常会存在部分接触，但尚未完全贴合。使用镊子的钝端或类似工具轻轻按压25 mm盖玻片，直至琼脂糖在整个表面均匀地与30 mm盖玻片接触。
      注意：如果用力过大，此步骤可能导致25 mm盖玻片破裂。
    10. 一旦琼脂糖被充分压紧在30 mm盖玻片上且无明显气泡残留时，即可用于成像。
  2. 设置显微镜并进行成像。
    1. 准备显微镜和成像室环境控制系统。将载物台顶部培养箱和大型培养室的温度设置为 37 °C，并开启培养室加湿器。将一块琼脂糖垫样品放入载物台顶部培养箱中，并关闭培养室，使样品达到平衡。此时载物台顶部培养箱的加湿盖保持打开状态，以避免培养室的 25 mm 盖玻片上产生冷凝水。
      注意：由于温度变化导致的琼脂糖垫收缩或膨胀，可能引起不同时间点之间的漂移，超出自动对焦算法的扫描范围。成像前必须将琼脂糖垫平衡至稳定温度，通常至少需要15分钟。充分预热还可防止在加装保湿盖时冷凝水积聚于顶部盖玻片上。成像系统的硬件组件为（材料表：活细胞培养孵育室、配备 Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27 物镜的倒置显微镜、Spectra 7 LED 光源系统以及 sCMOS 相机（像素尺寸为 6.5 μm）。显微镜的电动组件控制及图像采集均通过显微成像分析软件完成。
    2. 准备图像采集软件。在进行多维采集时，将 MetaMorph（显微镜分析软件）内置的自动对焦算法设置为使用相差通道。
      1. 在 阶段 标签，为每个样本设置多个阶段位置，目标是选择细胞密度分布均匀的视野。在 延时摄影 标签页中，设置所需图像采集的持续时间与频率（时间间隔）。在 波长 选项卡中，设置所需的采集通道，并根据样品信号强度调整曝光时间。
        注意：每个位置的图像每10分钟拍摄一次，持续最长24小时。对于本文中提及的染料/荧光团的荧光成像，使用的光源激发设置如下：碘化丙啶（Cy3；555/15 nm）和GFP（GFP/FITC；470/24 nm）。通常使用的荧光激发曝光时间为100 ms。碘化丙啶使用滤光片组15（分光镜FT580，发射光长通滤光片LP590），GFP使用滤光片组44（分光镜FT500，发射光带通滤光片530/50）。
    3. 琼脂糖垫在培养室内升温后，将加湿盖子安装到载物台培养箱上。这有助于防止成像过程中垫片脱水和移位。
    4. 盖上加湿盖后，切换至微分干涉差（DIC）模式，并调节显微镜的聚光镜和孔径光阑，以获得适当的科勒照明。
    5. 调整完毕后，切换回相位模式。依次导航至每个视野位置，调节焦距，并将载物台位置重置至新的焦平面。此时所有设置已完成，可开始成像。
      注意：在开始采集之前，务必重新检查每个载物台位置，以确保凝胶垫未发生位移。若在特定载物台位置重新定位时细胞失焦，需重新对焦并覆盖先前的载物台位置。自动对焦算法的设置以最后一次时间点的焦平面z位置±3 µm作为搜索范围，因此若凝胶垫位移超过3 µm，算法将无法正确对焦。
    6. 通过点击启动多维采集 获取 按钮。
    7. 实验结束后，使用 MetaMorph 或 ImageJ 将各通道的单张图像合并为图像序列，以便作为视频观看或进行其他分析。
      1. 使用 MetaMorph（首选）整合图像， 多维数据综述 应用程序中，选择感兴趣的通道/波长，并选择给定阶段位置的所有时间点。点击 加载图像每个通道/波长将弹出相应的窗口。将每个合成图像以其对应的通道名称保存为 .tiff 文件。
      2. 在 ImageJ 中进行合并时，打开同一视野位置和同一通道的所有时间点文件，然后进行合并。 图像堆叠.

5. 使用 Fiji/ImageJ 创建延时视频

注意：Fiji（Fiji is just ImageJ）是一款免费的图像处理与分析软件，可在此处下载："https://imagej.net/software/fiji/downloads32"32。本文所述的图像处理方法使用了 Fiji/ImageJ2 1.54f 版本。 

  1. 使用 BaSiC33 对相差通道图像堆栈进行明暗场校正。在 Fiji 中打开所需的相差图像堆栈，然后从 插件 选项卡中选择 BaSiC。校正后的堆栈将显示在标题为 Corrected:ImageName 的独立窗口中。
    注意：BaSiC.jar 可从此处下载： "https://github.com/marrlab/BaSiC33"33。请按照开发者的说明将 BaSiC 正确安装到 Fiji 中。
  2. 使用 图像 > 颜色 > 合并通道 将明暗场校正后的相差通道堆栈与其他通道/波长合并。使用 图像 > 调整 > 亮度/对比度 调整每个通道的背景和信号强度。将合并后的文件保存为 .tiff 格式。
  3. 接着使用 Correct 3D Drift 对图像进行稳定化处理。选中明暗场校正后的堆栈，进入 插件 > 配准 > Correct 3D Drift。在弹出的对话框中，将用于配准的通道设置为对应于相差堆栈的通道编号。校正后的结果堆栈将被命名为 registered time points。裁剪至所需的视野范围后，将校正后的文件保存为 .tiff 格式。
    注意：如果使用 MetaMorph 生成合并的图像堆栈，则需额外进行一步处理：进入 图像 > 属性，交换 Slices (z) 和 Frames (t) 字段中的数值。这样漂移校正才能正确地将每一帧识别为时间点，而非 z 堆栈中的切片。经过明暗场校正和漂移校正的 .tiff 文件可用于后续的图像分析。目前有许多可用的软件包可用于测量荧光信号强度、量化形态学特征、追踪单个细胞的命运等。两种常用程序是 Fiji 的 MicrobeJ 插件和 Oufti34,35。
  4. 使用 图像 > 堆栈 > 标注 在堆栈上添加时间戳和文本标签。
  5. 要添加比例尺，首先需了解相机的像素尺寸和显微镜 物镜的放大倍数。通过将像素尺寸除以放大倍数来计算像素与微米的比值。在 分析 > 设置比例尺 对话框中，将该像素:微米比值输入 已知距离 字段。然后使用 分析 > 工具 > 比例尺 向堆栈添加比例尺。
    注意：显微镜的精确比例应使用载物台测微尺进行校准。然而，所使用的显微镜物镜和相机也可提供大致的比例估计。例如，此处使用的 PCO sCMOS 相机像素尺寸为 6.5 × 6.5 µm2，成像时使用 63 倍物镜，因此像素尺寸除以放大倍数为 6.5/63 = 每像素 0.1032 µm。在 设置比例尺 对话框的 已知距离 字段中输入 0.1032。
  6. 要将最终的图像堆栈导出为可在 QuickTime Player、Microsoft PowerPoint 等软件中播放的视频，请将其保存为 .avi 文件。

结果

将报告质粒成功导入铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）的标志是在相应的选择性抗生素培养基上生长，可通过菌落PCR和/或测序进一步确认。应通过使修饰后的菌株处于已知可诱导目标基因表达的条件下，验证其作为表型报告菌株的特性，并通过流式细胞术、分光光度法或落射荧光显微镜检测其产生的荧光信号（图1）。

为便于选择后续实验所用的抗生素剂量，需进行浓度依赖性抗生素持留菌检测 P. aeruginosa 或 S. aureus 感兴趣的菌株。浓度依赖性实验通常会产生双相曲线，在较低抗生素浓度下呈现陡峭的初始斜率，而在较高浓度下则趋于平缓或斜率减小。然而，对于某些抗生素-物种组合，可能不会出现明显的双相曲线。例如，以下曲线 S. aureus d依拉法洛沙星曲线明显呈双相图3A），但 P. aeruginosa 左氧氟沙星曲线不是（图3B)15在此情况下，我们应选择至少为 MIC 的 10 倍浓度（例如， 5 µg/mL，约为 MIC 的 15 倍 P. aeruginosa)15然而，由于15倍左氧氟沙星MIC仅导致约0.001% P. aeruginosa 幸存者，我们使用 1 µg/mL 左氧氟沙星处理，以便在对细胞于无抗生素琼脂糖垫上恢复时进行成像观察持留菌补充视频 6）；否则，成像多个持留细胞所需的视野数量将变得过多而不切实际。

成像开始时，理想的样品和琼脂糖垫制备应在整个视野中保持平整，无大块碎屑、褶皱或气泡，并且单细胞分布均匀。获得分布良好的单细胞可能需要优化样品稀释倍数或重悬条件。对于 S. aureus细胞倾向于形成小团簇，因此在接种至琼脂糖垫前需充分涡旋混匀。图4 和 图5）。对于 P. aeruginosa细胞可能在悬浮液中形成被黏性细胞外基质包裹的聚集体；成像单个细胞前，必须充分吹打样品以彻底分散这些聚集体。

成像实验结束后，成功的时间序列图像应保持清晰对焦、照明稳定，并在整个实验过程中于x-y平面内漂移极小。补充视频7展示了一次理想的图像采集过程：t为补充视频4中在进行阴影或漂移校正前的相差通道图像。如果因湿度过高或样品预热不足导致冷凝，使水滴在顶部25 mm的盖玻片上形成，从而改变光线路径并使焦平面超出自动对焦算法的最大搜索范围，则可能发生失焦（见补充视频8）。照明不均通常表明成像时浸油不足。若载物台移动过快，物镜上的浸油可能滞后，在图像采集时仍未完全到位。可通过调整采集参数以降低移动速度，或在移动至下一位置后与图像采集之间增加暂停时间来缓解此问题。显著的样品漂移表现为视野中许多细胞呈条带状移动，而部分细胞保持原位（见补充视频9）。此类情况通常在实验后期出现，原因是琼脂糖垫因湿度控制不足而脱水。本文所介绍的琼脂糖垫制备方法旨在提高样品稳定性，但要实现最佳图像采集，仍需对样品及其周围环境进行充分的预热和加湿。

持留细胞显微镜观察；基因表达水平随时间变化的荧光焦点；示意图。
图1：荧光报告菌株用于显示目的基因的表达情况。（A）根据方案1，将S. aureus转导携带目的基因的GFP转录报告系统。报告菌株经抗生素处理24小时后，用PBS洗涤，随后接种于由CA-MHB琼脂糖垫（含碘化丙啶1.6 µM和氯霉素10 µg/mL，用于维持报告质粒）制成的载玻片上，用于恢复期间的成像观察（补充视频1）。（B）将携带与mScarlet连接的目的蛋白翻译报告系统的质粒转化至P. aeruginosa中26。报告菌株经抗生素处理5小时后，用PBS洗涤，随后接种于由BSM琼脂糖垫（含四环素Tet 75 µg/mL，用于维持报告质粒）制成的载玻片上，用于恢复期间的成像观察（补充视频2）。请点击此处查看该图的放大版本。

琼脂平板上的细菌生长、稀释系列、菌落观察、微生物实验设置。
图 2：噬菌体的扩增与收集。 （A）这六个平板显示了在金黄色葡萄球菌（S. aureus）RN4220 菌苔上接种的六种不同稀释浓度的噬菌体原液。红色轮廓标出了将被收集的三个平板，从溶菌斑最明显的平板（粗红轮廓；1×109 PFU/mL）开始，依次为接下来的两个稀释度（1×108 和 1×107 PFU/mL）。黑色箭头指向单个噬菌斑。（B）为从平板中收集噬菌体，需刮取软琼脂层（左），将悬液转移至下一个稀释度的平板（中），待将三个平板的软琼脂混合后，合并至锥形管中进行离心（右）。请点击此处查看该图的放大版本。

存活率与抗生素浓度关系图，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，药物疗效分析
图3代表性浓度依赖性持留菌检测实验。 浓度依赖性氟喹诺酮类药物在静止期的持续作用被评估（A) S. aureus （针对德拉沙星）和（B) P. aeruginosa （针对左氧氟沙星）。后续实验采用 5 µg/mL 德拉沙星（红色圆圈）因为 S. aureus 杀伤效应在此浓度下已达到平台期。剂量为 至少 1 µg/mL 左氧氟沙星（红色圆圈）将用于后续实验 P. aeruginosa请注意，细菌杀灭作用并未达到平台期 P. aeruginosa，但仍存在较平缓的双相曲线“第二相”，表明有持续存在的亚群。图3B经Hare等人许可改编。15. 请点击此处以查看此图的放大版本。

S. aureus 和 P. aeruginosa 的延时显微镜图像，显示随时间变化的PI+细胞情况。包含示意图。
图4：抗生素处理期间细菌表型的成像。将静止期的（A）S. aureus 和（B）P. aeruginosa 细胞接种到含有氟喹诺酮类抗生素的琼脂糖垫上，并在治疗过程中进行监测：S. aureus 使用5 µg/mL的德拉沙星（补充视频3），P. aeruginosa 使用5 µg/mL的左氧氟沙星（补充视频4）15。在琼脂糖垫中加入碘化丙啶（PI；P. aeruginosa 为16 µM，S. aureus 为1.6 µM）以标记死亡或即将死亡的细胞。S. aureus 细胞在氟喹诺酮存在下基本保持完整且存活，而大多数P. aeruginosa 细胞则经历显著的形态学变化，包括形成圆形的球状体，随后裂解并死亡。请点击此处查看该图的放大版本。

金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生长延时显微镜图像，细菌增殖。
图 5：恢复期间持留菌的追踪。 （A）S. aureus 和（B）P. aeruginosa 菌群在经氟喹诺酮类药物处理后（S. aureus 使用 5 µg/mL 德拉沙星，P. aeruginosa 使用 1 µg/mL 左氧氟沙星），接种于含新鲜培养基的琼脂糖垫上，并在治疗后恢复期间进行监测（补充视频 5 和 补充视频 6）。各图中前两帧所示的持留菌以绿色箭头标出，这些细胞在抗生素处理期间保持完整且具有活性。经过一段初始滞后期后，持留菌开始分裂并产生新的子代（以绿色圆圈标示）。请点击此处查看该图的放大版本。

盖玻片制备和细胞接种过程、显微镜研究的装置示意图及组件。
图6：显微镜样品制备。（A）使用可更换盖玻片培养皿（“腔室”）的样品制备流程示意图。 （B）拆解状态下的腔室及其各个组件的照片。（C）完全组装好的腔室照片。请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频 1：S. aureus持留菌。 该视频文件包含图 1A中的图像。简言之，携带目的基因GFP转录报告系统的S. aureus经抗生素处理24小时后，用PBS洗涤，随后接种至含有CA-MHB、碘化丙啶（1.6 µM）和氯霉素（10 µg/mL）的琼脂糖垫上，用于恢复期间的成像。请点击此处下载该视频。

补充视频 2：P. aeruginosa 持留菌。 该视频文件包含图 1B中的图像。简言之，携带与 mScarlet 融合的感兴趣蛋白翻译报告系统的 P. aeruginosa 经抗生素处理 5 小时，用 PBS 洗涤后，接种于含有 BSM 及 Tet（75 µg/mL）的琼脂糖垫上，用于恢复期间的成像26。请点击此处下载该视频。

补充视频 3： S. aureus 在抗生素治疗期间。 对数期培养物 S. aureus 在富含化学成分明确的培养基中培养的细胞被接种到由该培养物的无细胞条件培养基制成的琼脂糖垫上，并加入碘化丙啶（propidium iodide）1.6 μM）和德洛沙星（delafloxacin）5 μg/mL). 请点击此处下载该视频。

补充视频 4：P. aeruginosa在抗生素处理期间的图像。 将在 BSM 中培养至稳定期的 P. aeruginosa 接种到琼脂糖垫上，该琼脂糖垫由平行培养的 P. aeruginosa 在 BSM 中产生的无细胞条件培养基制备而成；琼脂糖垫中还含有碘化丙啶（16 µM）和左氧氟沙星（5 µg/mL）。本视频经 Hare 等人15许可改编。请点击此处下载该视频。

补充视频 5：S. aureus在抗生素处理后的恢复过程。S. aureus 在富含营养的化学成分明确培养基中培养至稳定期。将稳定期的菌液在试管中用 5 µg/mL 的德拉沙星处理 24 小时，随后用 PBS 洗涤，并接种到含有碘化丙啶（1.6 µM）且不含抗生素的 CA-MHB 琼脂糖凝胶垫上进行成像。请点击此处下载该视频。

补充视频 6：P. aeruginosa在抗生素处理后的恢复过程。 将在 BSM 中培养至稳定期的 P. aeruginosa 菌液用 1 µg/mL 左氧氟沙星在试管中处理 7 小时，随后用 PBS 洗涤，并接种到含有碘化丙啶（16 µM）且不含抗生素的 BSM 琼脂糖凝胶垫上进行成像。请点击此处下载该视频。

补充视频 7：最佳图像采集示例。 本视频为补充视频 4在图像处理前的相差通道，用以展示一次理想的延时成像采集过程。请注意实验全程中漂移极小、照明稳定，并始终保持良好的聚焦状态。请点击此处下载该视频。

补充视频 8：由于冷凝导致图像采集不佳的示例。 本视频展示了一次实验的部分过程，其中图像采集受到焦点不良的影响，原因可能是样品加热不当和/或成像环境湿度过高，导致成像腔室内出现冷凝现象。所成像的样品为在BSM琼脂糖垫上进行抗生素后恢复期间的左氧氟沙星处理的P. aeruginosa。请点击此处下载该视频。

补充视频9：因漂移导致图像采集不理想的示例。 本视频展示了一次实验的部分过程，其中图像采集受到样本漂移的影响，原因可能是样本脱水以及琼脂糖垫从盖玻片上收缩或翘起。正在成像的样本为含有左氧氟沙星和碘化丙啶的琼脂糖垫上的P. aeruginosa。请点击此处下载该视频。

补充文件 1：25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl 请点击此处下载该文件。

讨论

我们发现，延时显微成像实验的成功取决于琼脂糖垫的质量及其在整个成像过程中的稳定性。由不锈钢腔室封装的琼脂糖垫制备相对简便，可获得始终平整的样品，能够在数十小时内稳定成像。这使得单次实验可对数万个细胞进行成像，提高了在细胞群体中检测到罕见表型变异体（如持留细胞）的可能性。

这种琼脂糖垫制备方法为此前发表的方法提供了一种易于实施的替代方案。本方案无需微流控装置制备所需的技术精度，也无需熟练操作琼脂糖"三明治"法，因而更易于实现批次间一致的样品制备14,16,36。此外，该系统具有成本效益。不锈钢培养室可高温灭菌并重复使用（不同于一次性塑料培养室），且整个装置无需特殊设备16,37。通过使用市售的载物台插入件，该培养室可轻松适配不同的显微镜系统。另外，由于细菌被固定在琼脂糖与盖玻片的界面处，我们已成功实现了对高度运动性细菌（如P. aeruginosa）的追踪，同时仍能观察其形态变化（图 4，补充视频 4）。其他单细胞成像技术，例如"母系机器"，将细胞限制在微通道内，因而无法观察除丝状化以外的其他形态变化36。

要成功实施本方案，需注意一些关键步骤和参数。在制备琼脂糖垫时，必须充分加热并完全融化琼脂糖，因为残留的琼脂糖晶体将引起光散射，影响成像质量。同样，在将琼脂糖移入成像腔室时，必须小心操作，避免引入气泡。为确保琼脂糖垫厚度一致并减少样品漂移，应在开始成像前，将琼脂糖垫置于加湿且温度可控的环境中平衡，通常为15分钟。另一个可能影响成像质量的因素是湿度控制：湿度过低会导致琼脂糖垫脱水收缩，而湿度过高（或腔室内样品加热不当）则可能导致暖空气在样品表面冷凝，从而干扰成像。因冷凝导致成像质量不佳的时间序列成像示例见 补充视频8。

当前设置的一个局限性在于无法更换培养基，这阻碍了在抗生素处理前、处理期间和处理后对单个细菌进行连续追踪。我们预计，将琼脂糖垫与允许培养基交换的流动池或微流控装置相结合，可实现对种群在营养或环境变化过程中的追踪。当前设计中另一个可改进的参数是样品的通气性。可更换盖玻片培养皿的O形圈密封、螺旋盖设计，相较于需要使用石蜡或油脂类密封剂来密封琼脂糖垫的装置，能够提供更好的样品通气性16。然而，密封腔室内的通气性可能仍然有限，或许无法支持专性需氧菌的生长，尽管这一点仍有待验证。

本文介绍的延时成像样品制备方案可实现对数千个细菌在应对或恢复抗生素处理过程中的动态追踪。该方法具有高度通用性，其应用范围远不止于持留菌生物学研究。例如，琼脂糖垫与分隔装置的设计允许接种空间上分离的细胞样品，同时通过琼脂糖垫的扩散作用实现细胞间的通讯。我们目前正在探索该装置在研究多种微生物群落中分泌产物交换如何影响细胞生长方面的潜力。我们预期，该方案将为新进研究人员开展延时显微镜研究提供较低的技术门槛，同时也为经验丰富的微生物学家提供无限的实验变体探索空间。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢康涅狄格大学健康中心细胞分析与建模显微镜设施的 Susan Staurovsky 女士在显微镜实验方面提供的帮助。感谢 Mona Wu Orr 博士以及葡萄球菌遗传学与代谢基础研讨会提供关于在 P. aeruginosa 和 S. aureus 中进行克隆的实验方案与建议。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH；资助号：DP2GM146456-01 和 1R01AI167886-01A1，授予 W.W.K.M.；1F30DE032598-01A1，授予 P.J.H.；1F31DK136259-01A1，授予 T.J.L.）的经费支持。资助方未参与本实验的设计或本稿件的撰写。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BaSiCGitHubhttps://github.com/marrlab/BaSiC
认证分子生物学琼脂糖Biorad1613101
Fiji-ImageJNIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
可更换盖玻片培养皿Bioptechs190310-35用于制备琼脂糖垫的35 mm ICD；配有30 mm（#1.5）盖玻片
Lumencor Spectra 7 LED光源系统Lumencorhttps://lumencor.com/products/spectra-light-engineSpectra 7 LED光源系统
MetaMorph分子设备公司Premier version 7.10.5
pco.edge 4.2 bi sCMOS相机Excelitashttps://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-camerasCMOS相机
PeCon活细胞培养室peConhttps://www.pecon.biz/
Thomas Scientific圆形盖玻片，#1.5厚度，25 mm，每包100片费希尔科技NC127277025 mm（#1.5）盖玻片
蔡司Axiovert 200M显微镜蔡司https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.html倒置显微镜，配备Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27物镜、Lumencor Spectra 7 LED光源系统和pco.edge 4.2 bi sCMOS相机（像素尺寸6.5 mm）

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延时落射荧光显微成像 铜绿假单胞菌 和 Staphylococcus aureus 异质性表型
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