方法文章

成像与分析用于量化玉米（Zea mays）非生物胁迫表型

DOI：

10.3791/67619

⸱

2025年3月28日

 ,  , 
1Donald Danforth Plant Science Center

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种低成本的植物成像方法，用于测量表型，并提供了图像采集的最佳实践以及量化植物性状的图像分析流程。这些方法已应用于测量玉米（Zea mays）在高温、干旱以及复合非生物胁迫条件下的表型。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

测量植物的定量表型或性状对于理解植物对生物和非生物胁迫等环境因素的响应至关重要。然而，传统的植物测量方法可能耗时较长、准确性较低，并且具有破坏性，尤其是在对生物量和株高等性状进行个体水平评估时。基于图像的分析方法能够减少人力投入，提高准确性和精确度，并实现对同一植株在多个时间点的重复测量。尽管高通量表型平台提供了一种解决方案，但其成本通常过高，且在全球范围内的可及性有限。本文描述了一种利用低成本单板计算机和数码相机在摄影棚环境中采集植物图像的方法，并结合基于免费开源软件 PlantCV 的图像分析流程。该方法提供了一套快速且准确的图像采集、标记与传输方案，同时包含了确保高质量图像获取的最佳实践。通过图像分析，可对实验中所有图像同时量化超过 10 种表型，包括植株大小、株高和颜色等性状。这些方法已被用于表征玉米自交系 B73（Zea mays）在高温、干旱以及高温与干旱复合非生物胁迫条件下的响应特征。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

测量植物性状（即表型）对于回答植物科学中的基础与应用问题至关重要。例如，若研究人员希望了解某个基因突变对植物大小的影响，则需要定量测量植物的高度和叶面积1。若研究人员施加生物胁迫（如细菌、病毒或真菌感染）或非生物胁迫（如干旱、高温、低温或营养耗竭），则需考察胁迫对植物颜色或"绿色程度"的影响，以评估叶片失绿现象2,3。

尽管测量这些性状对于基础植物生物学和应用植物育种至关重要，但人工测量这些性状可能耗时较长、精度较低且结果不准确4,5,6,7例如，测量植物高度通常需要在炎热或潮湿的环境条件下逐株手动使用刻度尺进行，且容易因测量者的视角不同以及对植株测量起点的判定差异而产生误差 "顶部" 植物的生物量和色素含量等测量具有破坏性，由于测量过程中必须毁坏植株，因此无法对同一植株进行随时间变化的连续观测或多次取样。4,5,6,7这些测量过程耗时且容易出错，阻碍了植物表型和生理应激反应评估工作的进展。

对植物进行成像并从图像中测量定量性状，为解决上述问题提供了有效方案4,5,6,7。图像分析可提高测量的准确性和精确性，同时减少研究人员进行测量所需的时间；由于性状量化过程具有非破坏性，同一植株可被多次成像或用于其他取样分析4,5,6,7。此外，图像可在实验结束后长期保存，并在植物材料已被处理后重新进行分析4,5,6,7。图像分析既可使用低通量的图像编辑工具（如 ImageJ（Fiji）8）单独完成，也可借助计算机视觉与机器学习技术，利用 PlantCV 等平台实现高通量分析9。PlantCV 是一个免费、开源的图像分析平台，可帮助研究人员首先将植物或其他目标物体从图像背景中分割（或分离）出来，并对目标物体的大小、形态、颜色等性状进行定量测量9。通过模块化工作流程，研究人员首先利用样本图像构建由多个模块组成的灵活流程（或称分析管线），随后将剩余图像批量导入该高通量流程中处理，无需对每张图像进行单独操作9。最终输出定量性状数据，并进行统计分析以识别组间显著差异。在获取足够数量的图像并使用适当的性状测量值或元数据完成标注后，可进一步开发深度学习分析管线，实现高效、自动化的图像分析 10。

"高通量" 表型分析可加快数据采集和/或数据分析的速度，并减少人工劳动4,5,6,7高通量表型分析设施已实现受控环境中图像采集的自动化，植物通过传送带移动 通过 机器人将植物送至成像站，并自动标记与该植物相关联的名称（即带有元数据的标签）6,11,12,13,14尽管这些传送带或机器人驱动的设施能够无需人工干预地捕获和标记大量图像，但全球范围内此类设备数量稀少，且建造成本高达数百万美元，使许多研究人员难以获得。为了以较低成本实现自动化成像的概念，树莓派（以下简称单板计算机，SBC）作为一种低成本计算机（每台价格低于35美元），已被用于在受控环境中拍摄植物图像，并完成图像的命名、存储和传输。这些装置通过最多达72台树莓派组成的阵列，以自动化、定时的方式采集图像。12,15,16尽管比成本高达数百万美元的传送带系统更具成本效益，但先前描述的SBC生长室主要适用于自上而下观察小型植物的生长，且仍需要大量SBC15在田间环境中，龙门架、无人机系统（UAS）以及卫星均可采集用于植物性状分析的图像17,18田间系统和高通量受控环境设施在前期成本、维护费用以及构建和维护系统所需的专门知识方面可能具有较高门槛，同时图像分析也需要专业知识17,18单独使用手机和数码相机进行植物摄影时，图像的传输和命名附带元数据的过程较为耗时，而元数据对于后续的图像分析至关重要。

本文所述方法为其他系统尚未解决的植物成像挑战提供了一种低成本的解决方案。通过将植物逐个运送至摄影工作室的拍摄设置，可高效测量各种尺寸花盆中的植物。该方法利用连接数码相机的单板计算机（SBC），首先实现图像的标准化采集、命名与传输。在图像采集过程中，使用键盘或二维码/条形码扫描仪对图像进行命名，避免了在图像采集并存储后通过元数据重新命名所带来的时间消耗和人为错误。图像构图及推荐的相机设置对于后续图像分析的可行性至关重要，本文对此提供了详细指南。最后，提供了一个基于 PlantCV 的图像分析流程，用于从采集的图像中提取定量性状，例如叶面积、植株高度、宽度和颜色。

与传送带系统相比，该方法成本较低，且仅需一个单板计算机（SBC）。本文所述的表型分析装置旨在消除传送带或机器人系统的限制和成本——由于该装置可与生长空间分离，因此可测量任意大小的植株，仅需一个单板计算机，并且支持多种类型的相机，具有最大的灵活性和经济性。与此类似的方法包括 PhenoBox 或 PhenoRig12,19。与人工测量相比，该方法节省时间、减少误差，且不会破坏植株4,12,15,19。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案中所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 拍摄工作室的准备

  1. 从墙壁或天花板悬挂黑色摄影级布料，用于侧视成像。将布料至少垂至地面 0.5 m，使植物放置在布料上方（图 1）。
    注意：布料应比待成像植物至少高 100 cm 且宽 100 cm。
  2. 将色卡放置在背景布上，并依靠盒子等物体支撑，使其在画面中可见（图 1）。对于高度或宽度大于 30 cm 的植物，使用宽度至少为 20 cm 的色卡；对于高度或宽度小于 30 cm 的植物，使用宽度为 4–8 cm 的色卡。
  3. 将 SD 卡插入笔记本电脑或台式计算机。从网站软件部分下载 Raspberry Pi Imager（https://www.raspberrypi.com/software/），并将提供的 raspberrypi-image-capture.img.gz 文件（https://github.com/danforthcenter/photo-maize-paper）下载到 笔记本电脑或台式计算机。
  4. 通过打开已下载的 Imager（.exe）文件启动程序。点击 选择操作系统 按钮，然后在底部选择 使用自定义 按钮。选择 image-capture.img.gz 文件。
    1. 接着，点击 选择存储 按钮，并选择插入计算机的 SD 卡。点击 写入 按钮。
      注意：请确保已选择正确的 SD 卡，因为此过程将删除卡上所有数据。
  5. 使用 USB 线将最新版本的单板计算机（SBC）连接至键盘，使用 HDMI 线连接至外接显示器，并使用带开关的电源线连接至电源插座。使用显示器附带的电源线将显示器连接至电源插座。将 SD 卡插入 SBC。参见 图 1 中标注的装置示意图。
  6. 通过按下电源插座上的开关打开电源插座，使用显示器上的按钮打开显示器，然后将电源线上的开关拨至 "on" 位置以开启 SBC。
  7. 使用 WIFI 或以太网电缆将 SBC 连接到本地网络。
  8. 若需将照片直接传输至服务器或云存储：
    1. 在 SBC 上编辑文件 "CAPTURE-PHOTO.py"，填入完整的文件路径以完成传输。
    2. 在终端中使用以下命令编辑 win-credentials 文件，填入服务器或云存储的路径和密码：sudo nano /etc/win-credentials。
      注意：请联系网络系统管理员，确保该文件夹具有文件传输权限。
  9. 根据条形码扫描仪附带的制造商说明，使用 USB 或蓝牙将无线条形码扫描仪连接至 SBC。
  10. 通过点击屏幕左上角的 Raspberry Pi 按钮，点击注销，然后点击 关机 安全关闭 SBC。关机后，将电源线上的 SBC 电源开关由 "on" 拨至 "off"，并将电源插座关闭至 "off" 状态。

2. 植物生长与胁迫处理

注意：任何植物均适用于本表型分析方法；这些植物培养方法适用于本文所展示的代表性结果。

  1. 从种质资源中心获取B73或其他玉米品种的种子。
  2. 准备土壤基质和生长条件：
    1. 使用体积比为1:1的Turface MVP与Berger BM7-35混合基质，并添加每立方码3磅的缓释肥料14-14-14（N-P-K），装入3.5英寸（0.7 L）花盆中。将花盆置于带孔托盘内，并用反渗透（RO）水充分浇透。
    2. 设定生长室环境条件：白天30 °C、夜间20 °C，光照周期16小时，相对湿度60%，白天光照强度在花盆位置达到500 mmol·m-2·s-1。另设一个生长室，除高温胁迫组设置为白天38 °C、夜间28 °C外，其余条件相同。
  3. 将20粒玉米种子分别种植于3.5英寸花盆中，每粒种子埋入土壤约2 cm深，并用挖出的土壤覆盖。用反渗透（RO）水充分浇水后，将花盆放入对照生长室中。每天使用液体肥料（按制造商说明配制；参见材料表）进行浇灌。
    注：为弥补发芽率低及在胁迫处理开始前植株生长不均的问题，应多种植一些备用植株。不同品种的发芽率可能存在差异。
  4. 生长21天后，从中选取长势最一致的16株植株（每处理组n = 4株），移栽至装有相同混合基质（预先用RO水润湿）的3.79 L花盆中。将植株放回对照生长室继续培养。
  5. 在第25天（移栽后第4天），于光照开启时将一半植株（n = 8）转移至高温胁迫生长室。同时停止对两个生长室中的干旱胁迫组植株（每室n = 4）进行浇水。
    注：为确保干旱胁迫植株能够存活至实验结束，可能需要适量补水；本实验中，干旱处理组分别在第31天和第37天补充了含肥料的水。
  6. 在第38天（胁迫处理开始后第13天），将植株从生长室中取出进行成像分析。

3. 植物成像

  1. 启动SBC（参见 图2):
    1. 使用电源插座上的开关打开电源插座。
    2. 使用显示器上的按钮打开显示器。
      注意：如果在显示器开启之前先开启单板计算机（SBC），则其将无法正常启动。
    3. 打开SBC电源线上的开关 "开启".
      注意：这将启动单板计算机（SBC），它将在显示器上启动并运行；没有 "在" 仅接通单板计算机的电源线，不要打开单板计算机本身的电源。
  2. 将相机放置在三脚架或稳定的桌面上。
    注意：整个植株和比色卡应完整显示在相机画面中。相机应与地面垂直，并正对植株中心，无任何角度倾斜。相机必须兼容 gphoto2 软件包，兼容设备列表可在此处找到： http://www.gphoto.org/proj/libgphoto2/support.php 
  3. 为相机供电 通过 使用相机附带的电源线或电池。通过相机上的按钮打开相机。
  4. 使用相机附带的数据传输线，将相机连接到单板计算机（SBC）的USB端口。
  5. 将植物放置于摄影装置中：
    1. 在用于拍摄的织物上，于花盆将要放置的位置贴上一块深色胶带，以确保每株植物的位置一致。确保色卡与胶带对齐。
      注意：将色卡放置在距离植株边缘至少10 cm的位置。在后续的PlantCV工作流程质量控制过程中，应能够对图像进行裁剪，仅保留植株和花盆部分，而不包含色卡，以确保色块不会被纳入最终的性状提取分析中。参见 图2 高质量和低质量图像的示例。
    2. 将花盆放在胶带位置上。对于在平面上生长的植物，例如玉米（玉米（Zea mays））和高粱（高粱（Sorghum bicolor）），将植物最宽的角度面向相机。对于非平面生长的植物，需分别拍摄植物0度和90度角度的图像，并在图像分析完成后对所得定量测量结果取平均值。
  6. 在显示器上显示的 SBC 桌面界面中，通过点击打开终端 末端 左上角菜单栏上的按钮
  7. 如果要直接保存到服务器或云存储，请通过编辑以下命令中的云存储路径（如下示例中的 cloud-storage-path）和密码，将存储挂载：在打开的终端窗口中输入该行代码，然后按回车 进入 在键盘上。如果未更改出厂设置，用户ID（UID）将为 "π".
    注意：
    sudo mount -t cifs -o credentials=/etc/win-credentials,uid=pi //cloud-storage-path /mnt/cloud-storage
  8. 在终端中输入以下代码，然后按回车 进入 在键盘上操作。将出现一个新窗口。
    ./RUN-PHOTOSTUDIO-SHELL.sh
    注意： RUN-PHOTOSTUDIO-SHELL.sh 文件会调用 CAPTURE-PHOTO.py 文件，如果树莓派是通过上述方法加载系统，则这些文件已预先载入。或者，这些脚本也可在 GitHub 上获取，以便写入现有的树莓派 SD 卡中。 
  9. 图形用户界面窗口将打开。输入图像名称，或使用条形码扫描仪扫描植物的条形码或二维码。
  10. 选择将图像保存到本地或挂载的服务器/云存储。
  11. 点击 单击此处拍照！ 按钮。
  12. 如果选择了本地存储，请打开 照片 在桌面上打开文件夹以查看图像。如果选择了服务器或云存储，请在相应位置打开图像。
  13. 如有必要，可先将相机从单板计算机（SBC）断开，根据制造商说明调整其设置，然后再重新连接至SBC。
    注意：曝光、亮度、对比度等设置可能需要根据房间内的光照条件和被成像物体进行调整。常见的错误是图像过度曝光。为检查测试图像的曝光情况，需将测试图像导入PlantCV图像分析工作流程，该流程包含针对曝光的质量控制检查步骤。根据需要调整相机设置，以降低或提高曝光，直至直方图分布适当。
  14. 在完成所有图像采集后，通过首选方法（如U盘存储、互联网浏览器或SSH传输）将图像从SBC传输至本地计算机或云存储。

4. 从图像中提取性状

  1. 将以下文件下载到本地计算机或服务器："photo-studio-SV-notebook.ipynb"、"workflow.py" 和 "photo-studio-SV-config.json"。所有文件均可在 GitHub 上获取（https://github.com/danforthcenter/photo-maize-paper）。
  2. 按照说明（https://plantcv.readthedocs.io/en/latest/installation/）在本地计算机或服务器上安装 PlantCV。 
  3. 使用首选的代码编辑器（如 JupyterLab 或 Visual Studio Code）打开文件 photo-studio-SV-notebook.ipynb。
  4. 逐块运行代码，并根据代码块中指定的参数进行必要的修改，以获得仅包含图像中植株的清晰掩膜。
  5. 当对样本图像的分析结果满意后，在首选代码编辑器中打开文件 workflow.py。将 "photo-studio-SV-notebook.ipynb" 中更改过的参数更新至该文件并保存。
  6. 打开文件 photo-studio-SV-config.json，并根据文件中的提示编辑文件路径，指向输入图像文件夹、期望的输出文件夹等。
  7. 打开终端并运行以下代码以激活 PlantCV。在终端中输入代码 conda activate plantcv ，然后按键盘上的 Enter 键。
  8. 将以下代码行修改为 "photo-studio-SV-config.json" 文件的实际路径（这是下述代码中唯一需要更改的部分）。
    1. 在终端中输入修改后的代码，然后按键盘上的 Enter 键。这将对实验中采集的所有图像运行工作流程。
      注意：
      plantcv-run-workflow --config /Users/USERNAME/photo-studio-SV-config.json
  9. 检查输出图像，判断代码是否适用于所有图像。
    注意：植株的蓝色和粉色轮廓应准确贴合植株边缘，图像中不应包含其他物体。如有必要，返回到 "photo-studio-SV-analysis.ipynb" 文件，测试存在问题的图像，并修改代码（特别是掩膜步骤和降噪处理），以获得理想结果。参见 图3 中高质量、可接受及低质量图像分割的示例。
  10. 输出文件将以 .json 格式生成。返回终端（确保已执行 conda activate plantcv），输入以下代码，然后按 Enter 键，将文件转换为 .csv 格式以便后续统计分析，并将文件路径替换为 "results-photo-studio.json" 文件的实际路径。
    plantcv-utils json2csv -j /Users/USERNAME/results-photo-studio.json -c /Users/USERNAME/results-photo-studio.csv
    注意： 若需将测量值从像素转换为标准单位（如 cm），请使用 PlantCV 工作流程中 find_color_card 函数提供的转换系数。
  11. 对输出的定量性状进行统计分析，以确定不同植物物种、品种、处理方式和时间点对植物表型的影响差异。
    注意：R Studio 中的 pcvr 软件包已专门设计用于分析 PlantCV 输出结果的统计显著性并绘制图表20。参见 图4 中所收集性状的汇总信息及可视化表示。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为建立该方法，对B73玉米植株在对照温度、高温、充分供水和干旱条件下，以及这些条件的组合下，共四种处理，进行了数量性状表型的评估。B73是一种著名的玉米自交系品种，具有丰富的遗传数据21。

PlantCV 中的图像分析成功地对图像进行了颜色校正，将定量结果与植物的元数据进行关联，并将植物与背景分割（即分离）开来，如图3所示。分析失败时，输出的图像将不会显示植物外围的蓝色轮廓或粉红色形状，而是包含额外的噪声或植物部分缺失（图3，低质量示例）。为了在掩膜中尽可能包含更多的植物区域，必须采用双通道阈值法（参见“photo-studio-SV-notebook.ipynb”中的替代单通道策略）。然而，某些植物（尤其是具有紫色茎的植物）的分割效果并不完美，但已足以满足后续分析的要求（图3）。

PlantCV 分析提供了 16 个定量的单值性状，如图 4所示。单值性状为每株植物提供一个数值——例如叶面积、株高、宽度和色调圆周均值。叶面积通过“analyze.shape”函数（图 4）进行计算，并涵盖整株植物。然而，株高和宽度则使用“analyze.bound_horizontal”函数进行计算，并在植株与土壤交界处绘制边界线。这是因为倾斜于花盆边缘的植株若以整体为对象计算高度会偏大，而应仅从植株基部与土壤接触的位置开始测量。除了单值性状外，PlantCV 还输出多值性状，即直方图，特别是颜色值的直方图，表示植株的每一个像素。色调圆周均值是一个单值性状，代表整株植物的平均色调值。

为确定哪些性状最具研究价值，利用 R Studio 中 pcvr 软件包的 "frem" 函数，计算了每个性状由处理因素解释的方差以及不同性状之间的相关性。20 (图 5A）。选择叶面积、株高、叶宽和色调圆均值进行后续分析，因为这些性状能够解释由处理引起的超过50%的变异，且分别反映了植物生长（面积、高度和宽度）和健康状况（色调）的相关指标。具有最大和最小叶面积的植株代表性图像展示了本实验所采集表型的变异情况（图5B，C，分别为）。叶面积最大的植株其平均色调值也最高，该植株为B73基因型，在充分供水且受热胁迫条件下的植株（图 5B）。叶面积最小时，其平均色调值也最小（图5C），是一株B73，在干旱和高温胁迫条件下的植株。

水分处理对叶面积（F(1,13) = 226.5，p = 1.32 × 10-9）、株高（F(1,13) = 21.1，p = 0.0005）、叶宽（F(1,13) = 75.5，p = 8.92 × 10-7）以及色调圆均值（F(1,13) = 27.8，p = 0.0002）具有显著影响，采用线性回归模型分析处理效应，并在 R Studio 中进行双因素方差分析（完整结果见表1）。温度处理对株高有显著影响（F(1,13) = 5.94，p = 0.03），但对叶面积、叶宽和色调圆均值无显著影响（p > 0.05，表1）。温度与水分状态之间的交互作用在所测定的任何性状中均不显著（p > 0.05，表1）。

接下来，使用线性回归和事后检验（估计边际均值），并采用Sidak法进行多重比较校正，将各个处理组与对照组以及彼此之间进行比较（图6）。在两种温度条件下，与充分供水的植株相比，干旱胁迫植株的叶面积、株高、株宽和色调圆周均值均显著降低（p < 0.05，图6）。在充分供水条件下施加热胁迫仅导致株高降低（p < 0.05，图6），但对叶面积、株宽或色调圆周均值无显著影响。这种色调的差异可通过分析多值颜色性状“色调”进一步探究，该性状以直方图形式展示于图7中，而非仅依赖平均值。干旱导致的平均色调降低主要源于像素颜色由绿色向黄色转变，即已知的黄化现象（chlorosis）（图7）。尽管热胁迫在平均色调上未表现出显著差异，但其同时表现出黄色化（黄化）和绿色加深的现象，呈现出降低与升高的双重变化趋势（图7）。

成像后，将植物在根茎交界处剪断，记录地上部分组织的重量。根部用纸巾轻轻擦洗并吸干后称重，以计算整株植物的生物量（亦称重量），并与所述基于图像的表型分析方法进行比较。所测得的叶面积 通过 图像分析与植物生物量高度相关（R2 = 0.84, 图8).

用于植物分析的光谱学装置示意图，突出显示设备及光学激发过程。
图1：用于采集植物图像的摄影棚装置示意图，各组件已标注。（A）专业摄影用布料，（B）色卡，（C）用于统一摆放花盆的胶带标线，（D）数码相机，（E）单板计算机，（F）显示图像采集过程的显示器。请点击此处查看该图的放大版本。

植物摄影装置示意图；树莓派、质量控制、元数据输入、图像采集过程。
图 2：成像工作流程概览。 提供了一张代表性“高质量”和“低质量”图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

植物图像分析流程图；Jupyter Notebook 工作流程；植物大小、颜色分割。
图 3：PlantCV 中图像分析工作流程的概述。展示了“高”、“可接受”和“低”质量分割的代表性图像；PlantCV 性状使用粉红色轮廓表示整株植物的形状，使用蓝色轮廓表示植物区域。请点击此处查看此图的放大版本。

包括面积、凸包、质心、示意图在内的植物形态测量方法。
图 4：分析所获取的形态性状的总结与可视化表示。 PlantCV 中的形态分析功能。紫色框表示在计算中不依赖其他性状的性状，橙色框表示在计算中利用了其他性状的性状；箭头指示这些计算中所使用的性状。请点击此处查看该图的放大版本。

实验设置中基于植物成像分析的相关性矩阵与方差图。
图 5：基于图像的表型分析可捕获表型变异及性状间的相关性。（A）处理因素所解释的性状方差（右），以及性状之间的相互相关性（左）。每个性状均标注其名称及其测量单位；“NA”表示该测量无量纲。（B）具有最大叶面积和最高色相圆周均值（度）的植株图像。（C）具有最小叶面积和最低色相圆周均值（度）的植株图像。请点击此处查看此图的放大版本。

植物生长分析：叶面积、株高、宽度、色调与水分/温度的关系；箱线图比较。
图6：处理对植物表型影响的箱线图比较。比较干旱、高温以及二者复合胁迫对叶面积（A）、株高（B）、宽度（C）和色调圆周均值（D）的影响。n = 4。字母表示不同处理间具有统计学显著性差异（p < 0.05）；采用线性回归和事后检验（估计边际均值），并使用Sidak法对多重比较进行校正。请点击此处查看该图的放大版本。

色调分布图；温度与干旱对植物的影响，可视化色调变化。
图 7：每种处理组合下所有像素的颜色（色调）直方图，按该处理组合中的总像素数进行归一化。直方图根据色调角度的颜色值着色。请点击此处查看该图的放大版本。

植物重量与叶面积的散点图，显示线性回归，R²=0.84。
图8：基于图像测量的叶面积与整株生物量的相关性。每个黑色点代表一株植物。粉红色线表示叶面积（X）与生物量（Y）之间的线性相关关系。请点击此处查看该图的放大版本。

性状因素自由度F 值p 值
叶面积 (cm^2)温度10.53720.4766
叶面积 (cm^2)水分1226.53181.32E-09
叶面积 (cm^2)温度:水分12.15260.1661
叶面积 (cm^2)残差13
株高 (cm)温度15.94260.0298935
株高 (cm)水分121.1070.0005029
株高 (cm)温度:水分12.17520.1640545
株高 (cm)残差13
宽度 (cm)温度12.24950.1575
宽度 (cm)水分175.54748.92E-07
宽度 (cm)温度:水分10.08390.7766
宽度 (cm)残差13
色调圆周均值 (度)温度10.91540.3561432
色调圆周均值 (度)水分127.79880.0001509
色调圆周均值 (度)温度:水分13.47920.0848724
色调圆周均值 (度)残差13

表1：线性回归模型和双因素方差分析结果，用于检验水处理、温度处理及其交互作用对植物性状的影响。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基于图像的表型分析可对植物表型进行准确、快速且定量的测量4,5,6,7。与使用直尺手动记录植株高度，或通过可能与健康状况相关的植物颜色特征进行定性评估相比，该方法显著更快、更精确、更准确，并能提供更多的测量参数4,5,6,7。本研究及先前研究10均发现，叶面积与植物生物量之间存在强相关性（图8），表明该指标可可靠地替代耗时、破坏性且易出错的整株生物量手动称重过程。虽然仅使用相机即可完成图像采集，但增加低成本的单板计算机（SBC）可通过自动化图像采集及附加必要的元数据进行图像标注，从而提高通量15。该方法适用于每天成像一次（或更少频率）的1至约300株植物。对于实验中植株数量更大的情况，基于传送带、 overhead gantry 或机器人驱动的成像系统更为合适，因为逐个移动植株进行成像所需的时间可能超过一个工作日11,13。对于更频繁的时间点采集（例如每小时成像一次，而非每天一次或更少频率），在生长箱内设置相机系统更为合适，因其可自动采集图像，但受限于植株大小，且需要额外的SBC15。

尽管本文以 PlantCV 作为图像分析方案进行介绍，但其他软件也可使用。ImageJ（Fiji）是一款免费的图像分析软件包，可通过图形用户界面（GUI）用于植物图像分析8；然而，该软件并非专为整株植物图像分析而设计，在高通量计算方面的适应性较差，且相比 PlantCV 等已有成熟流程的工具，其在新图像上的重复应用难度更高9。深度学习方法（如 BioDock，见材料表）和 Segment Anything22因其能够便捷地将植物从背景中分割出来而具有吸引力，可用于本文所述的分割任务。然而，这些深度学习模型无法提供本文所描述的植物表型测量结果10，若需实现更复杂的定量表型测量，则可能需要大量训练图像（通常超过 10,000 张）以及超出普通笔记本电脑或台式计算机能力的计算资源10。此外，这些模型还需要大量的计算机内存和处理能力，而许多研究人员并不具备此类条件10。

该实验方案最关键的步骤是布置植物成像装置，并确保目标植物周围没有其他物体（例如其他植物、色卡或植物残渣）14。如果图像拍摄不当，或未使用色卡，后续将无法进行分析，因为缺乏标准化依据。尽管本方案无需进行校准，但在图像处理过程中必须进行颜色校正和尺寸标准化。务必确保整个色卡完整出现在画面中，且不与植物重叠（图2）。另一个常见问题是光照不均，可能导致阴影或局部过曝；我们建议使用明亮、均匀的顶光源，并遮蔽房间内的窗户以避免光照不均（图2）。如果顶灯造成阴影，可在正对植物的角度增加额外灯具。由于后续将使用色卡进行颜色校正，因此灯泡类型无需特别考虑。模糊的图像无法用于分析——应使用相机的自动对焦功能，或按照制造商的说明进行手动对焦，以确保图像清晰。

同样，确保图像不过度曝光（一种常见错误）才能进行适当的分析（图2）；在图像分析过程中，过度曝光的图像无法通过颜色校正修复，因为像素值已超出当前设置下相机的检测范围14。为防止过度曝光，可使用本文所述的PlantCV工作流程评估测试图像的颜色直方图或RGB值（图3），若曝光测试结果显示图像过度曝光，则应降低相机的亮度设置。RGB值（以及相应的直方图）不应出现0或255的值，因为该值域表明这些值可能超出检测范围，相机只能记录最小值或最大值，而非真实值。应始终使用这些方法评估测试图像是否存在过度曝光（图2和图3）；我们建议使用本出版物中提供的PlantCV曝光质量控制方法进行检查，该方法将每个颜色通道中像素值为0或255的比例低于5%的图像判定为质量合格。作为经验法则，相机和分析软件提供的直方图应具有对称且完整的尾部；若直方图在0以下（曝光不足）或255以上（过度曝光）被截断，则应调整相机设置后重新拍摄。我们建议选择一个具有明亮、均匀人工光源且无窗户的场所进行照明，因为窗户可能导致光线过强、不均匀，并频繁改变空间内的光照条件。图像应呈现均匀照明效果，色卡上的灰色方块不应呈现白色，否则提示存在过度曝光。

根据用户所在机构的IP地址和安全设置，图像采集代码可能需要进行故障排查。如需排查问题，请联系IT部门解决网络连接和文件传输问题。常见错误包括为单板计算机（SBC）使用了错误尺寸的SD卡，或在所连接的显示器开启前就启动了SBC。为解决故障，请严格遵循上述方案，并重新加载SBC软件。当使用gphoto2时，在线论坛是排查问题和查找所选特定相机解决方案的优质资源。为排查PlantCV图像分析问题并使用最新版本，请访问文档页面（https://plantcv.readthedocs.io/en/latest/），或在GitHub上提交问题（https://github.com/danforthcenter/plantcv/issues）。特别是当本方案中的阈值分割方法无法充分将植物与背景分离时，可使用“photo-studio-SV-notebook.ipynb”文件中或文档页面上提供的其他阈值分割方法。

该方法可应用于任何能够被运送至所述组装式摄影装置的植物种类及处理方式。例如，该方法不适用于生长在田间的植物，因为若不将植物连根挖起，便无法将其转移至摄影装置。在此情况下，可将植物割下，随后使用本方案进行成像，但该测量方式具有破坏性。单张图像中可同时拍摄并分析多株植物，但操作者需注意避免植物之间相互接触（图2），并且每次均应将植物放置在背景布的相同位置，以确保整个图像集能够自动执行后续分析流程。对于拟南芥（Arabidopsis thaliana）等需要俯视成像的植物，可使用三脚架将相机移至放置在专业摄影布料上的植物上方；其余图像采集与分析步骤保持不变。

如本研究以玉米为例所示，该方法对于植物育种以及深入理解植物如何耐受非生物胁迫（如高温和干旱）均具有重要意义。全球范围内，高温与干旱胁迫共同导致玉米每年减产15%-20%23。随着全球气候变化，预计到2100年气温将上升1.4-4.4°C，产量损失预计将进一步加剧24。评估玉米在胁迫耐受性方面的遗传多样性，并阐明其表型、生理及分子层面的非生物胁迫耐受机制，是保障全球粮食安全的关键研究目标25。为回答这些问题，生理学、遗传学、育种学、分子生物学等各个相关领域的研究人员必须能够快速、有效地，且常常以非破坏性的方式，评估玉米植株在非生物胁迫下的表型特征25。本文展示的方法及示例结果正满足了这一需求，为研究人员应对现实农业挑战提供了重要工具。

根据大量先前研究推测，此处观察到的表型表现为：干旱胁迫会减小植株大小并降低绿色程度（通过色调圆周均值测定）26（图6、图7 和 表1）。在充分供水条件下，热胁迫的表型出乎意料地并未显著减少叶面积；尽管增加重复次数可更准确地进行统计评估，但株高如预期般降低（图6）。尽管热胁迫未改变色调圆周均值，但颜色分布确实发生了变化，表现为黄色和深绿色像素均有所增加，说明仅评估平均色调是不够的，应考虑颜色的多值性状直方图（图7）。这些表型变化描述了植物对环境的响应，还可结合气体交换测定、显微成像等其他技术，进一步评估植物在胁迫条件下发生的生理变化。该结果展示了精确量化测量的强大能力，而手动或定性评估植物健康状况的方法可能遗漏这些信息。这些见解对于培育和设计抗气候变化作物至关重要，因为气候变化已显著降低全球作物产量，并预计在未来几年进一步加剧。

致谢

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本研究在唐纳德·丹弗斯植物科学中心表型分析核心设施（Donald Danforth Plant Science Center Phenotyping Core Facility，RRID: SCR_019049）完成，该机构为 K.M.M. 和 J.G.D. 提供了资金支持。本研究还得到了唐纳德·丹弗斯植物科学中心 Enterprise Rent-A-Car 研究研究所资助项目的支持。D.S. 的研究由泰勒地理空间研究所区块资助（Taylor Geospatial Institute Block Grant）以及美国经济发展署农业技术与应用地理科学与技术中心（Center for AgTech and Applied Location Science and Technology, CATALST）资助项目（ED21HDQ0240072）提供经费支持。我们感谢 Kevin Reilly 和 Kris Haines（唐纳德·丹弗斯植物科学中心整合植物生长设施，Integrated Plant Growth Facility，RRID: SCR_024902）在植物培养方面的专业知识和协助。我们感谢 Noah Fahlgren、Malia Gehan 和 Haley Schuhl 在 PlantCV 使用方面提供的建议。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15W USB-C 电源适配器CanaKitDCAR-RSP-3A5-C
25604 UC-E6 USB 数据线Nikon18208256044
3.5 英寸花盆Hummert International13006000
Berger BM7 35% 树皮培养基Hummert International10121500
Biodock 2024AI 软件平台www.biodock.ai.
代码编辑软件Jupyterhttps://jupyter.org/install
代码编辑软件Visual Studio Codehttps://code.visualstudio.com/download
ColorChecker Classic 色卡CalibriteCCC
ColorChecker Passport 色卡CalibriteCCPP2
Conviron 人工气候室ConvironBDW80 型号
Dell 22 英寸显示器DellSE2222H
EH-67 交流电源适配器NikonAZ185
图像分析软件PlantCVhttps://plantcv.readthedocs.io/en/latest/installation/
Jack's 水溶性肥料 15-5-15Hummert International7590200液体肥料
键盘和鼠标Logitech1440638MK270 无线键盘和鼠标套装
玉米种子美国农业部农业研究服务局种质资源信息网络（GRIN）B73https://www.ars-grin.gov/
Micro HDMI 转 HDMI 数据线AmazonB07KSDB25X
Nikon Coolpix B500 相机Nikon
Nikon D7200 相机Nikon
Osmocote 14-14-14 缓释肥Hummert International7630000
摄影级布料Yayoya聚酯纤维黑色摄影背景布，适用于摄影、视频、演播室及电视制作
带散热片的树莓派 4 型外壳iUniker‎B07ZVKN262
树莓派 4 型 B 版本 1.1Raspberry Pi FoundationRP4B4GB_BP
树莓派 4 PiSwitch（USB-C）CanaKitRSP-PISWITCH-USBC
树莓派软件Raspberry Pi Imagerhttps://www.raspberrypi.com/software/
统计分析软件Rstudiohttps://posit.co/downloads/
三脚架K&F ConceptT255A3+BH-28L
Turface MVP 基质Hummert International10240000
无线条码扫描器NetumscanB08X4NMX2M1D 和 2D 条码扫描器

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xiao, Q., Bai, X., Zhang, C., He, Y. Advanced high-throughput plant phenotyping techniques for genome-wide association studies: A review. J Adv Res. 35, 215-230 (2022).
  2. Mutka, A. M., et al. image-based phenotyping methods provide insight into spatial and temporal dimensions of plant disease. Plant Physiol. 172 (2), 650-660 (2016).
  3. Mutka, A. M., Bart, R. S. Image-based phenotyping of plant disease symptoms. Front Plant Sci. 5, 734(2014).
  4. Fahlgren, N., Gehan, M. A., Baxter, I. Lights, camera, action: High-throughput plant phenotyping is ready for a close-up. Curr Opin Plant Biol. 24 (2), 93-99 (2015).
  5. Das Choudhury, S., Samal, A., Awada, T. Leveraging image analysis for high-throughput plant phenotyping. Front Plant Sci. 10, 508(2019).
  6. Yang, W., et al. Crop phenomics and high-throughput phenotyping: Past decades, current challenges, and future perspectives. Mol Plant. 13 (2), 187-214 (2020).
  7. Omari, M. K., et al. Digital image-based plant phenotyping: A review. Korean J Agric Sci. 47 (1), 119-130 (2020).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biolFiogical-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. Gehan, M. A., et al. PlantCV v2: Image analysis software for high-throughput plant phenotyping. PeerJ. 5, e4088(2017).
  10. Murphy, K. M., Ludwig, E., Gutierrez, J., Gehan, M. A. Deep learning in image-based plant phenotyping. Annu Rev Plant Biol. 75 (1), 771-795 (2024).
  11. Fahlgren, N., et al. A versatile phenotyping system and analytics platform reveals diverse temporal responses to water availability in Setaria. Mol Plant. 8 (3), 1520-1535 (2015).
  12. Yu, L., et al. Development of a mobile, high-throughput, and low-cost image-based plant growth phenotyping system. bioRxiv. , (2023).
  13. Atefi, A., Ge, Y., Pitla, S., Schnable, J. Robotic technologies for high-throughput plant phenotyping: Contemporary reviews and future perspectives. Front Plant Sci. 12, 611940(2021).
  14. Berry, J. C., Fahlgren, N., Pokorny, A. A., Bart, R. S., Veley, K. M. An automated, high-throughput method for standardizing image color profiles to improve image-based plant phenotyping. PeerJ. 6, e5727(2018).
  15. Tovar, J. C., et al. Raspberry Pi-powered imaging for plant phenotyping. Appl Plant Sci. 6, e1031(2018).
  16. Jolles, J. W. Broad-scale applications of the Raspberry Pi: A review and guide for biologists. Methods Ecol Evol. 12 (5), 1562-1579 (2021).
  17. Watt, M., et al. Phenotyping: New windows into the plant for breeders. Annu Rev Plant Biol. 71 (1), 689-712 (2020).
  18. Xie, C., Yang, C. A review on plant high-throughput phenotyping traits using UAV-based sensors. Comput Electron Agric. 178, 105731(2020).
  19. Czedik-Eysenberg, A., et al. The "PhenoBox", a flexible, automated, open-source plant phenotyping solution. New Phytol. 219 (4), 808-823 (2018).
  20. Sumner, J., Fahlgren, N., Murphy, K. M. PCVR: An R package and tutorials for guided statistical analysis of plant phenotyping data. Authorea Preprints. , (2023).
  21. Schnable, P. S., et al. The B73 maize genome: complexity, diversity, and dynamics. Science. 326 (5956), 1112-1115 (2009).
  22. Segment Anything. Kirillov, A., et al. 2023 IEEE/CVF Int Conf Comput Vision, , 3992-4003 (2023).
  23. Gabaldón-Leal, C., et al. Modelling the impact of heat stress on maize yield formation. Field Crops Res. 198 (3), 226-237 (2016).
  24. Intergovernmental Panel on Climate Change. SYNTHESIS REPORT OF THE IPCC SIXTH ASSESSMENT REPORT (AR6). , https://report.ipcc.ch/ar6syr/pdf/IPCC_AR6_SYR_LongerReport.pdf (2023).
  25. Quiñones, A., et al. Optimized methods for applying and assessing heat, drought, and nutrient stress of maize seedlings in controlled environment experiments. Cold Spring Harb Protoc. , (2024).
  26. Murphy, K. M., et al. Maize abiotic stress treatments in controlled environments. Cold Spring Harb Protoc. , (2024).

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