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方法文章

兔连续长期脑电图/心电图监测的手术植入操作与布线配置

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DOI：

10.3791/67620

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2025年1月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Norton College of Medicine, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Pharmacology, SUNY Upstate Medical University, 3Department of Medicine-Cardiology, SUNY Upstate Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究概述了一种新型兔用连续脑电图/心电图记录系统的设计、制造及植入方案。该有线系统可通过头胸部九个独立电极实现连续的脑电图/心电图记录，从而全面评估脑部与心脏的电活动。

摘要

一种多系统方法，包括持续采集脑电图（EEG）和心电图（ECG）记录，有助于全面评估大脑和心脏的电活动，尤其是在 episodic 事件发生前后。在我们先前建立的可从清醒且固定状态的家兔中采集间歇性 EEG/ECG 记录的方案基础上，我们开发了一种从非固定家兔中采集连续 EEG/ECG 记录的新方案。该新方法可在饲养笼内实现高质量的全天候 24/7 记录，完整覆盖家兔正常的生理状态范围，并使其能够自由活动、进食、饮水和睡眠。该方法支持对 EEG/ECG 异常、癫痫发作、心律失常及猝死的发生率、发病率和易感性进行全面评估。该操作流程包括皮下电极的外科植入，以及设计和制造一套坚固的导线系统，确保其不会被家兔损坏。手术过程包含两个切口，并通过皮下隧道引导九根电极和导线，最终从一个定制端口引出。外部连接器连接至带有电旋转接头的导线束，使家兔在笼内活动时不受导线缠绕限制 。此外，导线被包裹在金属护套中，并通过悬吊自笼顶的回缩电缆进行固定。随后，导线连接至放大器/数字化仪，以获取高质量的连续 EEG/ECG 记录。

引言

我们先前开发了一种从家兔采集急性（< 5 h）视频/脑电图（EEG）/心电图（ECG）记录的方案。该方法包括使用九根皮下脑电图和心电图针状电极，将家兔置于固定装置中，并由研究人员在整个记录期间持续密切监测家兔1。尽管该系统可提供高质量的视频/脑电图/心电图记录，但仍存在若干局限性。心律失常、癫痫发作及其他脑电图/心电图异常可能由多种生理和环境因素诱发，因此在进行间歇性记录时可能遗漏这些事件。因此，该记录平台无法实现对家兔在全天不同时段、不同生理状态或正常饲养环境中的神经-心脏电活动进行全面且准确的评估。

持续的视频/脑电图（EEG）/心电图（ECG）监测对于评估各种生理状态下心脏和神经元的电活动功能具有重要意义。它有助于准确评估 癫痫样放电和心律失常的发生率与患病率，以及围绕发作性事件的多系统变化之间的一致性与进展过程。例如，自主神经功能的昼夜节律波动，以及由应激和活动介导的自主神经变化，会显著影响心率和心电图指标，并可能成为心律失常的诱发因素2,3。在某些类型的癫痫（如青少年肌阵挛性癫痫）中，癫痫发作更易发生在睡眠期间或觉醒后1-2小时内4。睡眠期间大脑电活动的动态变化可影响癫痫发作的易感性、起源及扩散5。

压力、活动以及运动性癫痫发作可能导致肌电伪迹并引起电极移位，从而影响记录的质量和稳定性。特别是在促惊厥研究中，兔子会出现肌阵挛性、阵挛性、强直性以及强直-阵挛性癫痫发作。其中强直期涉及颈部的不自主伸展，可能导致插针电极移位，进而在实验关键阶段中断信号。因此，采用插针电极的临时系统存在关键性局限，必须加以解决。此外，由于兔子被固定在束缚装置中，难以完整记录其全部运动表现。

因此，有必要建立一种在动物处于正常无束缚环境时，能够长期连续且稳定地进行多系统记录的电极植入方法。这将有助于在多种生理状态下以及对环境刺激作出反应时进行详细评估，同时也对捕捉罕见的发作性事件具有重要价值。由于该装置在记录过程中无需研究人员在场，因此可提高研究平台的效率和通量，并减少人员对兔子的干扰频率。最后，由于该方法允许动物在整个记录期间始终处于其自然饲养环境中，从而改善了兔子的生活质量，提升了整体动物福利。

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方案

本研究概述了一种新型兔用连续脑电图/心电图记录系统的设计、制造及植入方案。该方案已获得纽约州立大学上州医科大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。研究严格遵循IACUC关于动物福利、手术指南和研究终点的所有要求。纽约州立大学上州医科大学实验动物研究部门的研究人员及相关教职员工将定期进行动物福利检查和常规护理。任何损伤、不适、感染或不良反应均会立即得到处理。

1. 可植入电极组件的构建

  1. 在洁净的环境中进行可植入电极组件的自制操作，环境应包括洁净实验台、丁腈检查手套和手术口罩。
  2. 若使用带有快速连接插头和DIN连接器的现有导线束，请拆除插头的公头和母头（补充图1A）。保留插头以及带DIN连接器的长导线，用于后续导线组装阶段（补充图1B）。
  3. 根据所需电极数量（本示例设置为9个；补充图1A），向两个插头及带DIN连接器的护套导线束中添加或移除导线。
  4. 准备5根脑电图（EEG）电极（颜色分别为红、橙、黄、绿、蓝）和4根心电图（ECG）电极（颜色分别为黑、粉、白、灰）。使用热缩管和热风枪，从每根电极头部开始，按动物模型所需的正确长度对导线进行捆扎（补充图2A）。
    注：对于新西兰白兔（年龄1.25至13个月，体重0.8至4.17 kg）：脑电图导线从电极头部起为25 cm，黑色和粉色心电图导线为 40 cm（左臂和左腿），白色心电图导线为 35 cm（右臂），灰色心电图导线为 30 cm（左腿）。此长度足以将导线和电极穿隧至目标位置，并为兔子的生长和活动预留额外长度。
  5. 将导线束穿过电缆穿通衬套（补充图2B）。
    注：在手术前，对组装完成的植入体进行等离子灭菌。
  6. 从电缆穿通衬套末端起约1–1.5 cm处，沿导线侧面剪开，并剥离每根导线末端约5 mm长的绝缘涂层（补充图2B）。
  7. 将对接连接器的一端连接至从穿通衬套引出的每根导线，并压接固定以确保牢固连接。在每个插头导线上套上一段热缩管。将插头导线的裸露端插入对接连接器未压接的一侧，并与对应同色导线连接（补充图2C）。
    注：切勿在热缩管上进行压接，以免其破裂导致对接连接器的导电金属暴露。 若所选导线兼容，也可采用焊接替代对接连接器。
  8. 使用小型热缩管覆盖并热缩每个对接连接器/连接点（确保无金属暴露），以实现各通道之间的隔离。
  9. 将一段较大的热缩管滑过插头，推至电缆穿通衬套底部，覆盖所有导线，仅在插头底部露出极短部分导线（补充图2D）。使用热风枪和防护手套加热收缩热缩管。
    注：务必避免将热缩管收缩在插头必要的锁定机构上。
  10. 制作一个模具，用于在端口带电极的一侧塑形 丙烯酸基座（补充图3）。
    注：使用一个50 mL锥形管盖，用砂轮去除螺纹，并在一组位置切出四个狭缝 ，然后在距离第一组狭缝110°–120°的位置再切出五个狭缝（补充图3A）。在模具（管盖）底部钻一个直径0.5英寸的孔。在模具内侧贴上美纹纸，并从狭缝处将胶带剪开。
  11. 将装配好的端口连同穿通衬套一起放入模具中，使插头（红色）穿过模具底部的孔。当电缆穿通衬套与模具底部齐平时，表示装置已就位（补充图3B）。
  12. 布置导线，使五根脑电图电极位于模具左侧的五个狭缝内，四根心电图导线位于模具右侧的四个狭缝内。用美纹纸覆盖模具内侧的狭缝。
  13. 在通风良好的区域，使用玻璃小瓶按两份树脂粉末与一份树脂液体的比例混合牙科丙烯酸材料。使用移液管搅拌粉末和液体，直至混合物呈粘稠状但仍可通过移液管流动 。
  14. 使用移液管将丙烯酸混合物注入模具中，确保所有导线均被覆盖。待丙烯酸开始硬化，但在完全固化前将其从管盖上取下。
  15. 修整丙烯酸端口基座上的任何毛边。补充图3C展示了最终产品：导线嵌入丙烯酸基座中，穿过穿通衬套，连接至插头，并全部用热缩管密封。

2. 线束组件装配

  1. 获取 与端口上的插头相匹配的插头。获取旋转接头，并在每侧保留九根预连接的导线（补充图4).
  2. 在小旋转端一侧，将导线剪至5 cm长，并剥离每根导线末端5 mm的绝缘层补充图 5A).
  3. 剪一段2厘米长的小型热缩管，将其套在配对插头的每根导线上补充图 5A).
  4. 将插头上的导线焊接到旋转接头小端对应颜色的导线上补充图 5A).
  5. 对于每根导线，将热缩管套在焊点连接处，然后使用热风枪加热固定。
  6. 将一段较长的大号热缩管穿过插头，并滑动使其覆盖整个线束的长度。热缩管的长度必须足以覆盖插头部分2.5 mm，并尽可能多地覆盖旋转接头的小端，同时不得妨碍其旋转功能。使用热风枪固定补充图 5B).
  7. 在转接头的较大一端，将每根导线末端的绝缘层剥离5 mm。滑入一个 > 从切割端开始（而非带有DIN连接器的一端）将一根45厘米长的金属护套穿入导线束，直至露出被切割的导线。
    注意：将小号热缩管剪成2 cm长的小段，并套在旋转接头较粗一端的每根导线上补充图 5B）。剪下一段较长的热缩管（长度5 cm），将其套在整束电线上。在接下来的步骤中，确保所有热缩管远离热源或焊接操作。
  8. 将旋转接头较粗一端的导线通过绞合和焊接的方式连接到已截断的电极导线（带DIN连接器的一端）补充图 5B).
  9. 使用热风枪将小段热缩管固定在每个连接处。为防止旋转接头大端处的导线受到压力或挤压，在旋转接头的大端（覆盖旋转接头8 mm）以及导线上（覆盖导线2 cm）直接加装一段超大尺寸的带胶热缩管，并用热风枪加热固定。补充图 5C).
  10. 将金属护套滑过新连接的导线并旋转补充图 6A）。如果金属护套无法套在旋转接头上，可使用钳子或研磨机去除并打磨旋转接头的环形凸缘，使其能够与金属护套紧密贴合。这应 需要用户将护套拧在旋转接头上。
  11. 继续旋转，直到护套到达插头底部，但不妨碍旋转头的转动。这一点非常重要，以确保护套牢固固定在旋转头上补充图 6B).
  12. 将金属护套拉伸至最大长度，并在尼龙护套/线束上标记此位置。
  13. 剪取一段长1 cm、外径（OD）15 mm的橡胶管，从DIN连接器端开始，将其套在尼龙薄膜和导线束上 补充图 6C).
  14. 在橡胶管上套一段3厘米长的大号热缩管。使用热风枪，在已标记的位置将橡胶管与热缩管固定。该结构将作为止动装置，防止导线从金属护套中抽出。
  15. 在插头末端20厘米和24厘米处的未拉伸金属护套上，各套入一段长1厘米的热缩管。使用热风枪进行固定。补充图 6C这些位点随后用于固定牵开器电缆支架。 补充图7 展示了完成的线束组件，包括插头、导线、旋转接头、金属护套、塞子以及卷收器电缆的连接点。

3. 手术步骤

  1. 术前24小时和48小时给予口服抗生素（例如多西环素，5 mg/kg），术后每日给药，持续5天。
  2. 根据体重计算氯胺酮（40 mg/kg）和赛拉嗪（6 mg/kg）的剂量（对体重和性别无限制，但建议兔子至少已断奶，以减少母兔或同窝幼兔干扰电极植入的可能性）。通过以下途径给予这些药物： 肌内注射（IM）
  3. 待兔子完全镇静（对物理刺激无反应）后，将保护性保湿凝胶涂抹于兔子的眼睛上。闭合眼睑，使凝胶均匀分布。
  4. 使用电动剃须刀（先粗后细的刀头）剃除兔子两眼之间至肩胛骨下角后方5 cm范围内的毛发。剃除兔子右侧 flank（ flank ）周围的毛发。继续剃除兔子前肢之间至肋骨下缘之间的腹侧毛发。
  5. 开始吸入维持麻醉（2%–3% 异氟烷），氧流量初始设置为 1.5–2 L/min，同时以 1.5 L/min 的流速给予氧气。将适合的兽用麻醉面罩紧密覆盖于兔的鼻部和口部，确保橡胶垫圈在动物面部周围形成适当密封，且兔鼻未顶住面罩后壁。
  6. 放置 SpO₂ 监测仪2 在兔的足部放置探头，确认生理数值和波形。将动物置于左侧卧位，以便接触右侧腹 flank。在无菌技术条件下进行后续手术操作，包括外科医生穿戴  无菌手术衣、头套、鞋套 操作面罩、刷手及使用无菌手套。对所有器械、溶液和植入物进行灭菌。
    注意：实验人员应确保兔子在麻醉期间保持体温。建议使用加热手术台或加热垫，并配合手术巾。
  7. 无菌手术助手将聚维酮碘和异丙醇分配至无菌容器中。从预定手术区域开始，以环形方式向外扩展，先涂抹聚维酮碘，再涂抹异丙醇，重复此过程3次。将无菌洞巾覆盖于兔体，确保预定手术区域仍暴露在外。
  8. 按照下述方法进行心电图导联放置。
    1. 使用无菌笔尖标记器在预期的心电图电极放置位置做4个小标记。预期位置包括胸部上壁，分别位于（1）右侧（RA）和（2）左侧腋窝（LA）内侧，以及（3）右侧（RL）和（4）左侧（LL）最下缘肋骨前部的下缘（沿锁骨中线）； 补充图 8A）。这将形成右下位置接地的爱因托文三角导联配置。
    2. 在动物右侧体侧做一长度为2.5–3.5 cm的纵向切口，位置位于兔子右前肢背侧约1 cm处补充图 8B).
    3. 使用止血钳，向腹侧钝性分离，形成一个贯穿整个胸部的皮下囊袋。确保该囊袋延伸至四个心电图电极标记位置的每一处。
    4. 使用3-0单丝缝线的无针端，在电极基部打3组外科结补充图 9A). 补充图 9B 展示了将缝合针装入止血钳的理想方法：在缝线的基部夹住，使针体与止血钳长轴平行。此举有助于使针顺利穿过皮下组织间隙，避免钩挂周围组织。
    5. 将连接电极的针穿过皮下囊袋，并在标记位置穿出皮肤（补充图10A使用镊子或缝线轻轻向上牵拉皮肤，形成帐篷状，可增加皮下 pocket 的空间，并降低针头钩住结缔组织的风险。
    6. 施加轻柔牵引，直至电极保持在标记位置（补充图10B）。松开牵拉力，触诊确认电极是否保持在标记位置。如果结缔组织阻碍电极到达标记位置，需进一步钝性分离导线和电极的走行路径。
      注意：对缝线施加过大的力或牵引以试图使电极到达理想位置是无效的，且可能导致缝合部位过度损伤或缝线断裂。
    7. 为将电极固定在标记位置，使用3-0单丝缝线及缝合针穿过兔皮肤，进针点紧邻缝线穿出部位补充图11A).
    8. 将缝线部分穿过皮肤，使皮肤外保留一个小环（补充图11B).
    9. 使用单根缝线（带针）在一侧，将线环侧视为单根缝线，在另一侧打一个标准的外科结补充图 11C）。最终的结应类似于 补充图11D修剪剩余的缝线。
      注意：避免将外部缝线绑得过紧，以免在皮肤上形成凹陷。必要时，可在收紧结时将一把小型尖头剪刀的尖端置于结内，这样可留下较松的固定，降低电极日后穿透组织的风险 皮肤
    10. 对剩余的ECG电极重复此过程。将外科胶水涂抹于每个外部结扎处。
  9. 按照以下描述进行脑电图电极的放置。
    1. 将动物置于俯卧位，确保麻醉面罩固定妥当，生理监测设备放置正确。用聚维酮碘涂抹手术区域，随后使用异丙醇脱碘，重复此过程3次，从预定手术部位开始，以环形方式向外扩展。在兔体上覆盖无菌手术单，使预定手术部位保持暴露。
    2. 使用无菌笔形标记器，在预定的脑电图电极放置位置做五个小点标记，分别位于右额（RF）、左额（LF）、右枕（RO）、左枕（LO）和中央（Cz）参考位点（补充图12从兔侧腹的切口处开始，钝性分离至肩胛骨下角，然后继续分离至头部基底。
    3. 在头部两耳基部前侧之间做一长度为1.5 cm的横向小切口补充图12小心切开，避免损伤下方的任何肌肉组织。
    4. 从该切口向尾侧钝性分离，直至形成一个皮下囊袋，并与 flank 处的切口相连。再向头侧钝性分离，直至在动物头部形成一个皮下囊袋，延伸至各 EEG 电极预定放置位置。操作时需小心，避免施加过大压力，以防损伤眼眶及多块肌肉。
    5. 将带橡胶头的止血钳从头部切口穿过皮下至 flank 处切口。夹住 EEG 电极（每次 1-2 根），将其从皮下通道拉出，经头部切口引出。重复步骤 3.8.4 中所述操作，于每根电极基部结扎缝线。 并如图所示 补充图 9A.
    6. 放置并固定脑电图（EEG）电极。将针穿过头部皮下囊袋，并在标记位置处穿刺皮肤。拉紧缝线至适当位置，并按照方案步骤3.8.7–3.8.9所述方法及图示进行固定。 补充图11.
    7. 对全部五个电极重复此操作。建议先放置额部电极，然后放置Cz电极，最后放置枕部电极。对所有外部缝合结涂抹外科胶。
    8. 将大型镊子插入 flank 处的切口，撑开镊子，提起标记为穿刺部位的皮肤，该位置位于肩胛骨下角尾侧。
    9. 使用6 mm的打孔活检工具创建一个圆形孔洞。轻轻来回旋转活检刀，直至孔洞完全形成。移除打孔活检范围内的切开皮肤。补充图13A).
    10. 用塑料/橡胶覆盖电线插头，以防止血液/组织进入插头。将端口穿过侧腹切口，并将端口的插头端推过穿刺活检所形成的孔洞。 补充图13B 示意图显示导管穿出皮肤的位置，不同颜色表示经皮下隧道通向头部（EEG）和胸部（ECG）的导线。
    11. 将皮肤按压至端口底部，使整个区域绷紧。将橡胶垫圈覆盖在端口上，并向下按压，直至其与皮肤表面平齐。将多余的导线小心地塞入背部和侧腹部的皮下囊袋中，注意使用钝性分离技术制备足够大的囊袋，以容纳并均匀分布多余导线。确保导线在任何区域均不聚集成团，且不直接穿过端口下方，以免引起刺激。
    12. 轻轻将皮肤对合，使用间断单纯缝线闭合所有切口。在所有3-0单丝缝线上及切口全长涂抹外科粘合胶。待其自然干燥。
      注意：在丙烯酸树脂硬化后（3.9.14），开始逐步降低吸入麻醉剂浓度，随后关闭麻醉。术后至少保留血氧饱和度（SpO2）探头15分钟，用于监测。
    13. 使用移液管按2:1的体积比混合丙烯酸粉末与液体，搅拌至混合物稀薄到足以通过移液管，但又足够黏稠以保持在穿刺部位不流动。
    14. 将丙烯酸混合物涂抹于端口外侧，形成一个小的丙烯酸穹顶，以密封端口与皮肤的连接处。静置一段时间，使丙烯酸充分固化。在兔侧腹切口处覆盖无菌纱布，并用兽用绷带（vet wrap）轻轻包裹兔体（松紧度以可在绷带下轻松插入2-3根手指为准）。头部切口可保持暴露，无需覆盖。
    15. 将兔子安置在铺有垫料、毯子和热源的笼子中使其恢复，并在整个过程中进行密切监护。当兔子开始苏醒（出现鼻部抽动、轻微活动）时，皮下注射缓释布托啡诺（0.1 mg/kg）。持续直接监护，直至兔子完全恢复意识（能够站立并在笼内自主活动）。
    16. 让兔子有足够时间恢复（至少72小时），然后再将兔子身上的端口连接至数据采集用的导线束。
      注意：在此期间，应遵循所有适当的术后护理步骤，以确保正常愈合并减轻不适，至少包括每日观察食物和水的摄入情况、排便、排尿、切口部位愈合情况、精神状态以及是否存在疼痛或不适表现。术后10天拆除所有切口部位的缝线。

4. 脑电图/心电图测量

  1. 将线束穿过 兔笼顶部中央（直径3/4英寸； 补充图14).
  2. 将DIN连接器插入 合适的监测设备。将牵开器电缆固定在笼子内部顶部靠近线束孔的位置。
  3. 用末端带夹子的牵开器电缆延长线，将其连接至两段热缩管之间的线束位置补充图15).
  4. 将导线固定在笼子外部的顶部，以防止其滑入笼内（补充图14，例如胶带）。
  5. 将线束上的插头连接到兔子背部的插头补充图16）。记录信号（图1).

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结果

采用该手术技术，术中及术后均未出现死亡病例。存在感染和伤口愈合不全的风险，尤其是当兔子抓挠或啃咬切口部位时。术前/术后使用抗生素、用干燥无菌纱布覆盖切口，以及为兔子穿戴背心，有助于保护手术部位并促进愈合。所有记录均在兔子的标准饲养笼内进行，该笼具用于动物设施中所有兔子的持续饲养。无需对笼具、饮水阀或食槽进行任何改造。笼架顶部设有小孔，用于穿过导线束。牵拉电缆被粘合或螺钉固定在笼子顶部。为确保持续采集脑电图（EEG）/心电图（ECG）信号，对兔子进行持续视频监测，并由动物饲养管理人员、兽医人员和研究人员每天多次检查。研究人员会确认是否存在导线断裂或断开，或脑电图/心电图信号丢失的情况。

补充图16 是一只植入了脑电图/心电图（EEG/ECG）装置的兔子图像，该装置连接至导线束以实现连续记录。兔子正卧于笼中，表明该系统可使兔子在笼内舒适地自由活动。这使得能够在动物处于放松状态及不同生理状态下持续采集脑电图/心电图记录。 <...

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讨论

本文介绍了一种定制线束的详细制备方案、植入装置的自主加工方法，以及无菌植入脑电图（EEG）/心电图（ECG）电极、导线和端口的操作流程。该系统能够以高效、安全且经济可行的方式获取连续、高质量的EEG/ECG记录。本方案构建的系统可在无需束缚装置或 持续人工监护的情况下，实现兔脑电和心电数据的同时采集。长期连续的EEG和ECG记录有助于深入理解昼夜节律、特定生理状态以及发作性事件（如心律失常、癫痫发作、猝死）前后神经-心脏电活动的功能特征。连续记录对于准确评估EEG/ECG异常的真实患病率与发生率，以及分析特定生理状态下、对外部刺激的反应中和给予药理学干预后的EEG/ECG指标具有重要意义。

存在长QT综合征1型和2型的遗传性兔模型7。这些兔模型表现出心脏心电图异常、心律失常和猝死。由于兔 可模拟人类心脏电生理功能，因此它们为心脏病的遗传性和获得性模型提供了重要工具，并被用于临床前药物测试8。持续监测可评估血清药物浓度与脑电图/心电图指标之间的时间关系，从而有助于药物有...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。本论文所包含的部分信息也出现在第一作者（Laura Williams）的硕士学位论文中，已获得适当许可。

致谢

我们感谢普拉迪普·丹帕拉（Pradeep Dumpala，兽医学博士，哲学博士）、莎拉·布莱尔（Sarah Blair，文学硕士）以及纽约州立大学上州医科大学的动物饲养团队，感谢他们悉心照料兔子所付出的努力与专注。本研究由美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（1R61NS133273）及纽约州立大学上州医科大学药理学系资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3:1 带胶热缩管N/AWirefly内衬胶黏剂的聚烯烃热缩管，加热后直径可收缩至原来的1/3。用于电极连接导线和插头时的绝缘保护，以及线束各部件之间的连接绝缘。
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参考文献

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