结构生物学与分析化学方法在表征中的应用 C人类肠道微生物群中的糖苷代谢酶

摘要

近期研究表明，人类肠道微生物群的酶在代谢C-糖苷中发挥重要作用。本文介绍了一种综合性方法，结合分析化学技术（LC-MS/MS 和 NMR）与结构生物学手段，系统性地表征这些C-糖苷代谢酶的结构特征及酶促反应过程。

摘要

肠道微生物群作为宿主健康的關鍵調控因子日益受到關注，尤其因其能夠代謝飲食中的糖苷類物質。與O-糖苷相比，C-糖苷具有更優異的化學穩定性和對酶解作用的抵抗能力，但特定的腸道細菌仍可選擇性地代謝這類物質，從而提高其生物利用度。儘管微生物來源的C-糖苷酶已被鑑定，其精確的反應機制尚未完全闡明，且目前尚缺乏研究這些過程的標準化方法。為填補這一空白，我們提出了一種整合性的多學科方法，結合結構生物學、酶學以及分析技術，包括液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）和核磁共振（NMR），以系統性地表徵這些酶活性。這一綜合性方法能夠在分子、酶學及代謝層面精確解析C-糖苷的代謝過程。

引言

近年来，人类肠道微生物群因其在维持宿主健康方面的重要作用而受到广泛关注^1,2。这些微生物群落能够代谢宿主来源的化合物，产生具有生物活性的代谢产物^1,2,3。例如，黄酮类化合物是我们日常饮食中含量最丰富的天然化合物之一，主要以O-或C-糖苷形式存在，而这些糖苷在人体肠道中吸收较差⁴。然而，肠道微生物群可将这些糖苷转化为更具生物活性的衍生物，如次级糖苷或苷元，降低其溶解度并增强吸收能力，从而使其相较于原始形式具有更强的生物活性^5,6。

历史上，O-糖苷的水解机制已被广泛研究^7,8。而C-糖苷由于具有C-C糖苷键，表现出更高的化学稳定性并更耐降解^9,

方案

1. 蛋白质的制备与纯化

1. 表达载体的构建
   注意：在本研究中，来自人类肠道微生物群的 DgpA、DgpB 和 DgpC 基因， PUE 菌株作为模式系统。第一步是利用表达质粒产生相应的重组蛋白。
   1. 从NCBI获取DgpA/B/C基因簇序列（GenBank: LC422372.1）。随后，商业合成DgpA/B/C DNA，并将DgpA、DgpB和DgpC基因分别克隆至修饰后的pET-28a载体中，以表达带有N端SUMO和6×His标签（His-SUMO标签）的目标蛋白²⁸.
   2. 将 DgpA、DgpB 或 DgpC 质粒分别转化进入 E. coli BL21 (DE3) 感受态细胞。随后，在含有 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中，于 37 °C 培养细菌。
   3. 当菌液密度（OD）达到0.6时，向培养基中加入0.2 mM IPTG。₆₀₀) 达到 0.6。在 16 °C 下培养细菌 16 小时。
   4. 将表达 DgpA、DgpB 和 DgpC 的细菌培养物分别在 4,000 x g 4 °C 下离心 20 分钟。将细胞沉淀重悬于 20 mL 缓冲液 A 中（表1每1升细菌培养物
....

结果

遵循以下所述的步骤 图1，我们首先在 E. coli BL21(DE3) 细胞。由于 DgpB 和 DgpC 会形成稳定的酶复合物（DgpB/C 复合物）^10,26,27,34，表达这两种蛋白的细胞被混合用于共纯化。细胞裂解后，通过48,000 x g离心收集上清液。 g 40 分钟 4 °C 并进行镍亲和层析。结合的蛋白质使用 Buffer A 中的咪唑线性梯度（0-500 mM）洗脱图 2A, 2G）。DgpA 在 280 nm 处的紫外吸收曲线（图 2.......

讨论

目前，领域内对C-糖苷代谢酶的结构与功能特征仍不清楚，且缺乏适当的研究方法^10,24,26。本研究利用化学与生物技术相结合的显著优势^{40,41,42,43,44,45}，提出一种整合结构生物学、酶学及其他生物技术手段，并结合LC-MS/MS和NMR等化学技术的研究方法，用于探究肠道微生物中C-糖苷代谢酶的结构与功能特征。利用这些方法，我们对DgpA和DgpB/C复合物进行了结构表征。DgpA的结构与活性数据揭示了其底物特异性的机.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,6-二氯靛酚（DCPIP）	Solarbio Science and Technology	D6350
2-巯基乙醇（β-ME）	Sigma-Aldrich	08168
5 × 蛋白上样缓冲液	Sangon Biotech	C508320
乙酸	上海麦克林生化科技有限公司	A111247
乙腈	Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen	A12147
Bruker Avance III HD 700 MHz 核磁共振波谱仪	Bruker	AVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHz 核磁共振波谱仪	Bruker	AVANCE III 400 MHz
Centrifuge 5424R 离心机	Eppendorf	022620601
Chirascan™ plus 圆二色光谱仪	Applied Photophysics	Chirascan™
大豆苷元	上海源叶生物科技有限公司	B20227
大豆苷	上海源叶生物科技有限公司	B20226
二硫苏糖醇（DTT）	Solarbio Science and Technology	D8220
大肠杆菌 BL21 (DE3) 感受态细胞	Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen	EC0114
染料木素	上海源叶生物科技有限公司	S31565
染料木素-8-C-葡萄糖苷	上海源叶生物科技有限公司	BP2095
染料木苷	上海源叶生物科技有限公司	S31591
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
GraphPad Prism 9	GraphPad Software	Version?Prism 9	用于计算 Km 和 kcat 动力学参数
HiLoad Superdex 200 pg 制备型尺寸排阻色谱柱	Cytiva	28989335
HisTrap HP His标签蛋白纯化柱	Cytiva	17524802
HiTrap Q FF 阴离子交换色谱柱	Cytiva	17515601
HKL-3000	HKL Research 公司	版本 723
HPLC 色谱柱 TC-C18(2)，170Å，5 µm，4.6 × 250 mm	Agilent Technologies	518925-902
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	Sigma-Aldrich	PHG0010
乳糖	Sigma-Aldrich	17814
LC-20AT 高效液相色谱系统	岛津	LC20AT
麦芽糖	Sigma-Aldrich	47288
麦芽三糖	Sigma-Aldrich	443713
氯化锰	上海源叶生物科技有限公司	S31112
甲醇	Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen	M23142
NAD+	Solarbio Science and Technology	N8110
Olympus SZX12 体视显微镜	OLYMPUS	SZX7
苯甲基磺酰氟（PMSF）	Sigma-Aldrich	P7626
Phenix	Phenix 开发团队	1.21.2	Phenix 是一套全面的蛋白质晶体结构解析软件套件，集成了使用 Phaser 软件的 SAD（单波长反常衍射）和 MR（分子置换）方法。
制备型高效液相色谱仪	Waters	2545/2998
蛋白质结晶筛选试剂盒	Hampton Research	HR2-110/HR2-112/HR2-144/HR2-126/HR2-098
葛根素	上海源叶生物科技有限公司	B20446
摇床培养箱	上海智楚仪器有限公司	ZQZY-AF8
SnakeSkin™ 透析膜，10 kDa 截留分子量，35 mm	Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen	88245
可溶性淀粉	Sigma-Aldrich	S9765
Sorvall LYNX 6000 超高速离心机	Thermo Fisher Scientific™	75006590
SpectraMax i3x 多功能微孔板读板仪	MOLECULAR DEVICES	SpectraMax i3x
SpectraMax QuickDrop 微体积分光光度计规格	MOLECULAR DEVICES	QuickDrop
蔗糖	Sigma-Aldrich	S5016
SunFire C18 OBD 制备柱	Waters	186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVE 质谱仪	Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen	IQLAAEGAAPFALGMBDK
泛素样蛋白酶 1	Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen	12588018
超低温冰箱	Thermo Fisher Scientific	905GP-ULTS
真空离心浓缩仪	北京金曼技术有限公司	CV600
牡荆素	Sigma-Aldrich	49513