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结构生物学与分析化学方法在表征中的应用 C人类肠道微生物群中的糖苷代谢酶

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DOI：

10.3791/67629

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2025年5月23日

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

近期研究表明，人类肠道微生物群的酶在代谢C-糖苷中发挥重要作用。本文介绍了一种综合性方法，结合分析化学技术（LC-MS/MS 和 NMR）与结构生物学手段，系统性地表征这些C-糖苷代谢酶的结构特征及酶促反应过程。

摘要

肠道微生物群作为宿主健康的關鍵調控因子日益受到關注，尤其因其能夠代謝飲食中的糖苷類物質。與O-糖苷相比，C-糖苷具有更優異的化學穩定性和對酶解作用的抵抗能力，但特定的腸道細菌仍可選擇性地代謝這類物質，從而提高其生物利用度。儘管微生物來源的C-糖苷酶已被鑑定，其精確的反應機制尚未完全闡明，且目前尚缺乏研究這些過程的標準化方法。為填補這一空白，我們提出了一種整合性的多學科方法，結合結構生物學、酶學以及分析技術，包括液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）和核磁共振（NMR），以系統性地表徵這些酶活性。這一綜合性方法能夠在分子、酶學及代謝層面精確解析C-糖苷的代謝過程。

引言

近年来，人类肠道微生物群因其在维持宿主健康方面的重要作用而受到广泛关注1,2。这些微生物群落能够代谢宿主来源的化合物，产生具有生物活性的代谢产物1,2,3。例如，黄酮类化合物是我们日常饮食中含量最丰富的天然化合物之一，主要以O-或C-糖苷形式存在，而这些糖苷在人体肠道中吸收较差4。然而，肠道微生物群可将这些糖苷转化为更具生物活性的衍生物，如次级糖苷或苷元，降低其溶解度并增强吸收能力，从而使其相较于原始形式具有更强的生物活性5,6。

历史上，O-糖苷的水解机制已被广泛研究7,8。而C-糖苷由于具有C-C糖苷键，表现出更高的化学稳定性并更耐降解9,10。尽管如此，某些肠道细菌已进化出降解C-糖苷的能力11,12。1988年，Hattori 等人首次证明某些肠道细菌能够从C-糖苷上移除糖基13。随后的研究分离出首株具备该能力的细菌菌株，从而推动了对C-糖苷裂解机制的进一步探索14。然而迄今为止，仅有少数几种肠道细菌菌株及C-糖苷代谢酶被鉴定和表征14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26。最近的研究表明，PUE菌株中裂解葛根素（大豆苷元-8-C-葡萄糖苷）的酶（DgpA/B/C）可通过两步反应将葛根素裂解为大豆苷元和葡萄糖：首先由Gfo/Idh/MocA家族氧化还原酶DgpA将葛根素氧化为3''-氧代-葛根素，随后在DgpB/C复合物介导下发生β-消除反应，生成苷元和葡萄糖10,26。然而，C-糖苷代谢酶（特别是DgpA/B/C系统）的结构与功能特征仍不完全清楚，该领域研究亟需更先进的方法学，尤其是生物学与化学策略的整合，以推动深入研究24。

为解决这一空白，我们采用整合的多学科方法研究人类肠道微生物群中 DgpA/B/C 催化的反应 C-糖苷代谢反应。在此反应中，DgpA 催化糖基的氧化反应 C-糖苷，随后，DgpB 和 DgpC 形成一种 DgpB/C 复合物，该复合物特异性切割氧化的 C糖苷产物10,26,27我们首先分别进行了DgpA和DgpB/C的重组表达与纯化。随后对纯化的DgpA和DgpB/C蛋白进行结晶，并通过X射线晶体学解析了它们的三维结构。最后，我们重建了 C使用完整的 DgpA/B/C 酶系统进行糖苷键裂解功能研究，并进行全面的代谢产物分析 通过 联用液相色谱-串联质谱与核磁共振波谱技术27基于这些方法，我们已开展研究 C由 DgpA/B/C 酶系统催化的糖苷代谢。

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方案

1. 蛋白质的制备与纯化

  1. 表达载体的构建
    注意：在本研究中，来自人类肠道微生物群的 DgpA、DgpB 和 DgpC 基因， PUE 菌株作为模式系统。第一步是利用表达质粒产生相应的重组蛋白。
    1. 从NCBI获取DgpA/B/C基因簇序列（GenBank: LC422372.1）。随后，商业合成DgpA/B/C DNA，并将DgpA、DgpB和DgpC基因分别克隆至修饰后的pET-28a载体中，以表达带有N端SUMO和6×His标签（His-SUMO标签）的目标蛋白28.
    2. 将 DgpA、DgpB 或 DgpC 质粒分别转化进入 E. coli BL21 (DE3) 感受态细胞。随后，在含有 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中，于 37 °C 培养细菌。
    3. 当菌液密度（OD）达到0.6时，向培养基中加入0.2 mM IPTG。600) 达到 0.6。在 16 °C 下培养细菌 16 小时。
    4. 将表达 DgpA、DgpB 和 DgpC 的细菌培养物分别在 4,000 x g 4 °C 下离心 20 分钟。将细胞沉淀重悬于 20 mL 缓冲液 A 中（表1每1升细菌培养物
  2. 蛋白质纯化
    注意：高纯度且足量的重组酶对于功能表征和结构生物学研究至关重要。DgpB 与 DgpC 可形成稳定的蛋白质复合物（在裂解过程中会自发形成 DgpB/C 复合物）以实现其功能10,26随后进行 DgpA 蛋白以及 DgpB/C 复合物的纯化。
    1. 向细菌重悬液中加入 1 mM PMSF。将步骤 1.1.4 中的 DgpB 和 DgpC 细菌悬液混合，然后使用超声波细胞破碎仪裂解 DgpA 细菌悬液或 DgpB 与 DgpC 的混合物（以形成有功能的 DgpB/C 复合物）。
    2. 将细菌裂解液在48,000 x g下离心 g 4 °C下孵育40分钟。保留含有蛋白的上清液，弃去细菌沉淀。
    3. 使用镍亲和层析柱（Ni-NTA）从上清液中纯化 DgpA 或 DgpB/C 复合物。用缓冲液 A 和缓冲液 B 建立 0 - 50% 的咪唑浓度梯度，洗脱结合的蛋白质表1在ÄKTA纯化仪中。
    4. 取10 µL洗脱样品，与2 µL 5 × 蛋白上样缓冲液混合，使用垂直电泳系统在220 V条件下进行SDS-PAGE电泳45分钟，随后用考马斯亮蓝染色以显示蛋白质条带。根据SDS-PAGE分析结果，收集含有DgpA或DgpB/C复合物的组分，用于后续实验。
      注意：带有 His-SUMO 标签（17 kDa）的 DgpA（44 kDa）蛋白条带迁移位置约为 61 kDa图 2D），而带有His-SUMO标签（17 kDa）的DgpC（33 kDa）迁移至约50 kDa处，带有His-SUMO标签（17 kDa）的DgpB（15 kDa）迁移至约33 kDa处（图2J)..
    5. 使用10 kDa截留分子量透析膜，将步骤1.2.3中获得的DgpA或DgpB/C复合物样品在缓冲液C中透析，以去除咪唑，并加入泛素样蛋白酶1（Ubiquitin-like protease 1, ULP1； 材料表) 酶以去除 His-SUMO 标签29.
    6. 将透析后的蛋白质样品加入缓冲液C中（表1) 通过离子交换层析柱（Q柱）。随后，使用由缓冲液C和缓冲液D配制的氯化钠浓度梯度（从100 mM至600 mM）洗脱结合的蛋白质。表1) 在 ÄKTA 纯化仪中。
    7. 按照步骤1.2.3对从Q柱洗脱的DgpA及DgpB/C复合物进行SDS-PAGE分析，注意观察以下分子量：His-SUMO标签（17 kDa）、DgpA（44 kDa）、DgpA的寡聚条带（高于95 kDa）图2E），DgpB（15 kDa）、DgpC（33 kDa）、DgpB 和 DgpC 的寡聚条带（53 kDa 至 95 kDa 之间）（图 2K).
    8. 使用缓冲液 E 通过尺寸排阻色谱柱（SEC）纯化蛋白质表1）使用洗脱组分中的蛋白质进行SDS-PAGE分析，随后用考马斯亮蓝染色以观察蛋白条带。通过SDS-PAGE分析后，收集含有目标蛋白DgpA或DgpB/C复合物的组分。
      注意：DgpA 条带出现在约 44 kDa 处，而寡聚化的 DgpA 条带位于 95 kDa 以上图2F），而DgpC约为33 kDa，DgpB约为15 kDa，且存在寡聚化的DgpB和DgpC（分子量介于53 kDa至95 kDa之间）（图2L).
    9. 使用纳米分光光度计在280 nm处测定DgpA或DgpB/C复合物的蛋白浓度。随后，利用超滤管将DgpA或DgpB/C复合物浓缩至约20 mg/mL，分装后用液氮速冻。将DgpA或DgpB/C复合物于-80 °C保存，以备后续使用。
  3. 圆二色性（CD）光谱数据采集
    注意：由于DgpA催化的糖基氧化反应是该代谢途径中的关键起始步骤，因此特别采用圆二色光谱（CD）来验证DgpA的正确折叠状态及其二级结构的完整性。这些结构参数对于酶活性以及蛋白质成功结晶均至关重要。
    1. 用1×PBS缓冲液（pH 7.4）将DgpA蛋白稀释至0.2 mg/mL表1).
    2. 将1× PBS缓冲液（pH 7.4）加入石英比色皿中，使用圆二色光谱仪在200–260 nm范围内记录基线CD光谱，以灵敏检测二级结构和折叠状态的差异27.
    3. 将缓冲液比色皿替换为1.3.1步骤中的蛋白质样品，在200 - 260 nm范围内记录圆二色光谱，并扣除缓冲液基线，得到蛋白质样品的圆二色光谱。
    4. 采集三次扫描以确保准确性，并分析数据以获取二级结构特征和蛋白质折叠状态图 3G, 3H).

2. 蛋白质晶体学与结构测定

注意：在确认 DgpA 保持正确的折叠和结构完整性后，采用结构生物学方法测定 DgpA 的三维结构。由于 DgpB/C 复合物的催化活性已通过先前的功能实验在生物化学上得到证实10,26,27，因此省略了圆二色（CD）光谱验证步骤。

  1. 蛋白质晶体生长与优化
    1. 将0.5 µL纯化的DgpA（20 mg/mL）或DgpB/C复合物（20 mg/mL）与来自结晶试剂盒的储液溶液等体积（0.5 µL）混合，采用悬滴法在48孔结晶板上进行结晶30将晶体板转移至16 °C以进行晶体生长。
      注意：使用显微镜观察这些悬滴，以确定DgpA或DgpB/C复合物晶体生长的条件（包括蛋白质浓度以及沉淀剂，如PEG 3350、甲酸镁等）。
    2. 采用悬滴蒸汽扩散法对 DgpA 及 DgpB/C 复合物进行结晶条件优化30.
    3. 对于 DgpA，从步骤 2.1.1 确定的条件（20 mM 甲酸镁，20% PEG3350）开始，采用正交优化方法，测试六个 PEG3350 浓度梯度（17%、18%、19%、20%、21% 和 22%）与四个甲酸镁浓度梯度（16 mM、18 mM、20 mM 和 22 mM）的组合30.
    4. 在硅化玻璃盖玻片上混合0.8 µL DgpA蛋白溶液（10或20 mg/mL）与0.8 µL储液，制备结晶液滴。随后将盖玻片倒置于24孔结晶板上，于16 °C孵育以促进晶体生长。
    5. 对于 DgpB/C 复合物的优化，采用相同方法：将 0.8 µL 蛋白复合物（10 或 20 mg/mL）与 0.8 µL 含乙酸镁（16、18、20 或 22 mM）和 PEG 8000（8%、9%、10%、11%、12% 或 13%）的储液混合。同样地，在经硅烷化处理的盖玻片上设置悬滴，置于 24 孔板上，于 16°C 下孵育。
    6. 让DgpA和DgpB/C复合物的蛋白质晶体生长至完全大小，直至晶体停止生长，随后将晶体转移至浸泡溶液中，该溶液含有储液缓冲液以及5 mM的DgpA和DgpB/C复合物底物化合物（葡萄糖和葛根素），在16 °C下浸泡30分钟。
    7. 将晶体（包括含葡萄糖或无底物的 DgpA，以及无底物的 DgpB/C 复合物）转移至含有浸渍缓冲液并添加 25% 甘油的冷冻保护溶液中，立即存于液氮中以备数据收集。
      注意：尽管 DgpA 和 DgpB/C 复合物晶体均经过底物（葡萄糖和染料木苷）浸泡，但只有葡萄糖成功进入 DgpA 的催化中心。因此，共获得三种不同的晶体形式用于结构分析：含葡萄糖的 DgpA（图3E）；无底物的 DgpA（图3B- C）；以及无底物的 DgpB/C 复合物（图 3D）。冷冻保护剂溶液通过防止蛋白质晶体在液氮中快速冷却时形成冰晶，从而保护晶体的结构完整性，并减少辐射损伤。该溶液通常以母液为基础配制，并添加优化浓度的冷冻保护剂（如甘油或乙二醇）。
  2. 数据收集与结构解析
    1. 在中国上海国家蛋白质科学设施（NFPS）的上海同步辐射光源（SSRF）收集DgpA与葡萄糖结合或无底物状态以及DgpB/C复合物无底物状态的晶体X射线衍射数据，入射波长为0.978 Å。
    2. 使用晶体学数据处理软件处理三组X射线衍射数据，包括DgpA以及DgpB/C复合物的数据31首先加载原始数据，然后依次点击软件中的相应按钮，执行索引（index）、整合（integrate）和标度（scale）功能。生成适用于后续结构解析的已处理输出文件（output.sca）。
    3. 确定 DgpA 在结合葡萄糖或无底物状态下的结构（图3B-摄氏度，3E），以及无底物状态下的 DgpB/C 复合物（图3D) 使用分子置换法（材料表）。然后通过引入相关配体（如葡萄糖、Mn2+，H2O等31.

3. 反应活性监测与动力学参数的测定

注意：DgpA/B/C 系统介导 C通过明确的两步级联反应实现糖苷类转化：DgpA 首先催化糖基部分的氧化反应，生成中间产物，随后由 DgpB/C 复合物对其进行裂解或异构化10,26,27在本研究中，DgpA/B/C 指负责该反应级联的酶，但需注意 DgpA 与 DgpB/C 复合物之间不存在直接相互作用。这种偶联活性可通过三种互补方法进行严格量化：高效液相色谱产物分析、监测电子传递的 DCPIP 偶联分光光度法检测，或对反应参数进行详细的动力学表征27,32特别是 C通过高效液相色谱法（HPLC，265 nm 紫外检测）分析 DgpA/B/C 催化产生的糖苷裂解产物（大豆苷元）。采用标准校准曲线对产物生成量进行定量（标准曲线的建立方法详见步骤 3.3.2 下方的注释），并通过非线性回归分析将产物生成速率拟合至米氏方程模型，以确定动力学参数。27,32抑制实验通过检测葡萄糖对葛根素C-糖苷键裂解的影响，提供了佐证证据，表明糖类可作为DgpA的底物。随后，DCPIP实验通过监测氧化糖释放的电子将蓝色的2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）还原为无色的白质DCPIP的过程，来检测糖的氧化反应33从而反映 DgpA 的催化活性。

  1. 通过高效液相色谱法监测 DgpA/B/C 活性
    1. 在 500 µL 缓冲液 F（表 1）中进行 DgpA/B/C 催化的 C-糖苷裂解或异构化反应，反应体系包含 20 µM DgpA 和 DgpB/C 复合物（来自步骤 1.2.7），以及 0.1 mM 的底物：裂解反应使用染料木素-8-C-葡萄糖苷或葛根素，异构化反应使用大豆苷或染料木苷27。在 37 °C 下反应 8 小时，然后向反应混合物中加入 1.5 mL 甲醇终止反应。
    2. 将反应液在 16,000 × g 下离心 15 分钟，以去除因甲醇导致酶变性而产生的蛋白沉淀。使用 0.22 µm 滤膜过滤上清液。
    3. 采用梯度洗脱方式进行高效液相色谱分析，流速为 1 mL/min，进样体积为 10 µL，检测波长为紫外 265 nm。
      注：流动相为乙腈（流动相 A）和 0.1% 乙酸水溶液（流动相 B），采用梯度洗脱程序。流动相梯度如下：0–5 分钟为 5%–20% A，5–15 分钟为 20%–45% A，15–18 分钟为 45%–52% A，18–19 分钟为 52%–55% A，19–21 分钟为 55%–5% A，21–23 分钟为 5% A。DgpA/B/C 酶系统对大豆苷和染料木苷等底物表现出显著不同的催化效率，导致其产物生成速率存在明显差异。为定量评估底物转化动力学及产物积累动态，采用高效液相色谱在 0、2、4、6、12、16、20、24、36 和 48 小时时间点进行系统的时间进程分析。
  2. 利用 2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）法监测 DgpA 活性
    注：DCPIP 法通过检测蓝色 DCPIP 接受氧化糖释放的电子后还原为无色的白质 DCPIP 的过程，来监测糖的氧化反应33。本实验采用 DCPIP 报告系统检测野生型 DgpA 及其糖结合缺陷突变体对不同糖基化化合物、单糖、二糖或多糖的氧化活性。所用蛋白包括野生型 DgpA 及其糖结合缺陷突变体 D182A、Δ(308–316) 和 Δ(311–316)27。
    1. 在 1× PBS 缓冲液（pH 7.4）中，将 0.8 mM DCPIP 与 50 µM 蛋白（包括野生型 DgpA 及其三种糖结合缺陷突变体 DgpA D182A、DgpA Δ(308–316) 或 DgpA Δ(311–316)）以及 10 mM 底物（包括葛根素、牡荆素、染料木苷、可溶性淀粉、麦芽三糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖或麦芽糖）共同孵育。
    2. 反应 20 小时后，使用酶标仪在 600 nm 处记录 DCPIP 吸光度的变化33。
  3. 测定葡萄糖对葛根素 C-糖苷键裂解反应的抑制率
    注：DgpA 属于糖氧化还原酶家族，能够氧化 C-糖苷中的糖基部分。图 3E 显示葡萄糖结合于 DgpA 的催化中心，DgpA 结构测定的具体步骤详见步骤 2.2.3。为研究葡萄糖与 C-糖苷葛根素在 DgpA 上的竞争性结合，进行了以下实验。
    1. 在 1 × PBS 缓冲液（pH 7.4）中进行反应。向葛根素（C-糖苷）裂解反应体系中加入不同浓度的葡萄糖（1 mM、5 mM、10 mM、20 mM、50 mM、80 mM 和 100 mM），反应条件同步骤 3.1 所述。在 37 °C 下反应 12 小时。
    2. 利用标准品（标准大豆苷元）的高效液相色谱校准曲线对产物（大豆苷元）进行定量分析。首先计算含不同葡萄糖浓度的反应与未受抑制的 C-糖苷裂解反应（无葡萄糖）之间的产物产量差值，再将该差值除以未受抑制反应的产物产量，从而计算出抑制率。
      注：为建立定量高效液相色谱分析用校准曲线，需配制参考标准品（如葛根素或大豆苷元）的系列稀释液，浓度范围例如为 0.1–1 mM（以 0.1 mM 为增量）。通过高效液相色谱分析各浓度样品，记录峰面积，并将其对相应标准浓度作图。进行线性回归分析（y = mx + b，其中 y 为峰面积，x 为浓度），建立标准曲线。利用该回归方程可根据样品测得的峰面积推算其未知浓度。
  4. 动力学参数的测定
    注：动力学参数被广泛认为是定量评估酶催化效率的关键金标准。为定量评估 DgpA/B/C 催化的反应，测定了 DgpA/B/C 催化葛根素（C-糖苷）裂解反应的动力学参数。
    1. 为 DgpA/B/C 催化的 C-糖苷裂解反应配制底物 C-糖苷（葛根素）的浓度梯度（浓度范围为 0.01 至 4 mM，按 2 倍递增）。
    2. 按照步骤 3.1 所述方法，在 37 °C 下反应 8 小时。利用标准大豆苷元的高效液相色谱校准曲线对产物（大豆苷元）进行定量分析。然后将定量得到的产物量除以反应时间，计算反应速率（即产物生成速率）。
    3. 使用统计软件（材料表）将计算得到的反应速率与底物浓度拟合至米氏-门顿（Michaelis-Menten）模型，以确定 Km 和 kcat 动力学参数。

4. 反应中间产物的制备与检测

注意：除了具有 C-糖苷键断裂活性外，DgpA/B/C 还可催化 O-糖苷异构化为 C-糖苷。因此，当以 O-糖苷作为 DgpA/B/C 的底物时，反应中间产物将以异构化的 C-糖苷形式生成。为了表征中间产物（芒柄花素），对该中间化合物进行了纯化，并随后采用分析化学手段（包括液相色谱-串联质谱 LC-MS/MS 和核磁共振 NMR 波谱）进行分析。

  1. DgpA/B/C 催化的 C-糖苷异构化反应中反应中间产物的制备27
    1. 采用 0.2 mM O-糖苷（大豆苷）作为底物，20 µM DgpA 和 DgpB/C 复合物，在 90 mL 反应体系中，按照上述步骤 3.1 所述方案进行 DgpA/B/C 催化的 O 至 C-糖苷异构化反应。
    2. 采用制备型高效液相色谱（HPLC），按照梯度洗脱策略纯化中间产物 C-糖苷（葛根素）。
      注：流动相为乙腈（流动相 A）和 0.1% 乙酸水溶液（流动相 B），采用梯度洗脱。流动相梯度洗脱程序如下：0–5 分钟，5%–20% A；5–15 分钟，20%–45% A；15–18 分钟，45%–52% A；18–19 分钟，52%–55% A；19–21 分钟，55%–5% A；21–23 分钟，5% A。
    3. 使用步骤 3.3.2 中的标准校准 HPLC 曲线计算纯化后中间产物的浓度，在步骤 4.1.1 的 90 mL 反应体系中可获得约 6 mg 葛根素，随后使用真空离心浓缩仪将纯化后的中间产物干燥，以备后续使用。
  2. 采用 LC-MS/MS 表征反应中间产物
    1. 收集步骤 4.1.3 中获得的干燥中间产物。称取 100 µg 来自大豆苷反应的中间产物，溶于 2 mL 甲醇中，得到终浓度为 50 µg/mL 的溶液。在 13,500 x g 条件下离心 10 分钟，收集上清液用于 LC-MS/MS 分析。
    2. 采用与步骤 4.1.2 相同的 HPLC 梯度洗脱程序进行 LC-MS/MS 分析，进样体积为 5 µL。
  3. 采用 NMR 表征反应中间产物
    1. 将来自大豆苷反应的 4 mg 纯化中间产物溶于 340 µL 二甲基亚砜-d6 中，用于 1H 和 13C 核磁共振（NMR）波谱分析。仪器参数设置如下：温度 298 K，匀场 3 次，脉冲宽度 18 µs，弛豫延迟 1.5 s，扫描次数 48 次，其余参数设为默认值27。
    2. 使用 600 MHz NMR 仪器采集 NMR 1H 和 13C 谱图。

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结果

遵循以下所述的步骤 图1，我们首先在 E. coli BL21(DE3) 细胞。由于 DgpB 和 DgpC 会形成稳定的酶复合物（DgpB/C 复合物）10,26,27,34，表达这两种蛋白的细胞被混合用于共纯化。细胞裂解后，通过48,000 x g离心收集上清液。 g 40 分钟 4 °C 并进行镍亲和层析。结合的蛋白质使用 Buffer A 中的咪唑线性梯度（0-500 mM）洗脱图 2A, 2G）。DgpA 在 280 nm 处的紫外吸收曲线（图 2...

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讨论

目前，领域内对C-糖苷代谢酶的结构与功能特征仍不清楚，且缺乏适当的研究方法10,24,26。本研究利用化学与生物技术相结合的显著优势40,41,42,43,44,45，提出一种整合结构生物学、酶学及其他生物技术手段，并结合LC-MS/MS和NMR等化学技术的研究方法，用于探究肠道微生物中C-糖苷代谢酶的结构与功能特征。利用这些方法，我们对DgpA和DgpB/C复合物进行了结构表征。DgpA的结构与活性数据揭示了其底物特异性的机...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本研究由北京中医药大学（BUCM）启动基金项目（90011451310011）资助予 W.M.，北京中医药大学抗击新冠肺炎应急基金项目（1000061223476）资助予 W.M.，国家中医药管理局创新团队及人才培育项目（ZYYCXTD-C-202006）资助予 W.M.，以及北京中医药大学研究生自主研究项目（ZJKT2023012）资助予 H.P.。我们感谢马文福实验室所有成员提供的有益讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,6-二氯靛酚（DCPIP）Solarbio Science and TechnologyD6350
2-巯基乙醇（β-ME）Sigma-Aldrich08168
  5 × 蛋白上样缓冲液Sangon BiotechC508320
乙酸上海麦克林生化科技有限公司A111247
乙腈Thermo Fisher Scientific™?InvitrogenA12147
Bruker Avance III HD 700 MHz 核磁共振波谱仪BrukerAVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHz 核磁共振波谱仪BrukerAVANCE III 400 MHz
Centrifuge 5424R 离心机Eppendorf022620601
Chirascan™ plus 圆二色光谱仪Applied PhotophysicsChirascan™ 
大豆苷元上海源叶生物科技有限公司B20227
大豆苷上海源叶生物科技有限公司B20226
二硫苏糖醇（DTT）Solarbio Science and TechnologyD8220
大肠杆菌 BL21 (DE3) 感受态细胞Thermo Fisher Scientific™?InvitrogenEC0114
染料木素上海源叶生物科技有限公司S31565
染料木素-8-C-葡萄糖苷上海源叶生物科技有限公司BP2095
染料木苷上海源叶生物科技有限公司S31591
葡萄糖Sigma-AldrichG8270
GraphPad Prism 9GraphPad SoftwareVersion?Prism 9用于计算 Km 和 kcat 动力学参数
HiLoad Superdex 200 pg 制备型尺寸排阻色谱柱Cytiva28989335
HisTrap HP His标签蛋白纯化柱Cytiva17524802
HiTrap Q FF 阴离子交换色谱柱Cytiva17515601
HKL-3000HKL Research 公司 版本 723
HPLC 色谱柱 TC-C18(2)，170Å，5 µm，4.6 × 250 mmAgilent Technologies518925-902
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）Sigma-AldrichPHG0010
乳糖Sigma-Aldrich17814
LC-20AT 高效液相色谱系统岛津LC20AT
麦芽糖Sigma-Aldrich47288
麦芽三糖Sigma-Aldrich443713
氯化锰上海源叶生物科技有限公司S31112
甲醇Thermo Fisher Scientific™?InvitrogenM23142
NAD+Solarbio Science and TechnologyN8110
Olympus SZX12 体视显微镜OLYMPUS SZX7
苯甲基磺酰氟（PMSF）Sigma-AldrichP7626 
PhenixPhenix 开发团队1.21.2Phenix 是一套全面的蛋白质晶体结构解析软件套件，集成了使用 Phaser 软件的 SAD（单波长反常衍射）和 MR（分子置换）方法。
制备型高效液相色谱仪Waters2545/2998
蛋白质结晶筛选试剂盒Hampton ResearchHR2-110/HR2-112/HR2-144/HR2-126/HR2-098
葛根素上海源叶生物科技有限公司B20446
摇床培养箱上海智楚仪器有限公司 ZQZY-AF8
SnakeSkin™ 透析膜，10 kDa 截留分子量，35 mmThermo Fisher Scientific™?Invitrogen88245
可溶性淀粉Sigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 超高速离心机Thermo Fisher Scientific™75006590
SpectraMax i3x 多功能微孔板读板仪MOLECULAR DEVICESSpectraMax i3x 
SpectraMax QuickDrop 微体积分光光度计规格MOLECULAR DEVICESQuickDrop
蔗糖Sigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD 制备柱Waters186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVE 质谱仪Thermo Fisher Scientific™?InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
泛素样蛋白酶 1Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen12588018
超低温冰箱Thermo Fisher Scientific905GP-ULTS
真空离心浓缩仪北京金曼技术有限公司CV600
牡荆素Sigma-Aldrich49513

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