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方法文章

活体成像观察离体幼年斑马鱼神经肌肉接头中的突触囊泡循环

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DOI：

10.3791/67633

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2025年2月7日

 , 
1Department of Physiology, Osaka Medical and Pharmaceutical University

本文内容

摘要

斑马鱼幼体的神经肌肉接头是研究突触生理学的理想模型。该模型适用于多种实验技术，包括电生理学和光学成像。本文中，我们描述了一种在直立式落射荧光显微镜下利用基于pHluorin的探针进行突触传递成像的实验方案。

摘要

神经元之间的信息传递主要依赖于突触传递，这一过程由动作电位（AP）触发突触囊泡（SVs）释放其中储存的神经递质而实现。由于突触囊泡在突触前末梢局部循环利用，因此囊泡的胞吐与内吞过程之间的协调对于维持持续的突触传递至关重要。一种对pH敏感的绿色荧光蛋白——pHluorin，可通过靶向定位至突触囊泡腔内，成为监测突触囊泡胞吐与内吞动态的有力工具。然而，利用基于pHluorin的探针追踪动作电位驱动的突触囊泡循环，在很大程度上仍受限于 体外 培养制备，因为引入基因编码探针并进行后续光学成像在技术上通常具有较大挑战性 体内 动物模型或组织制备。斑马鱼是一种具有多种优势的模式系统，包括易于进行遗传操作、组织透明度高以及体外发育迅速。我们近期构建了一种转基因斑马鱼，其运动神经元末梢可高水平表达pHluorin标记的探针，并开发了一种用于监测动作电位驱动的突触小泡出胞/内吞过程的实验方案，该过程位于神经肌肉接头（NMJ），这是一个经典的突触模型。 体内本文中，我们展示了如何制备适用于pHluorin成像的斑马鱼幼虫神经肌肉接头（NMJ）标本。我们还证明，该标本可在常规直立式落射荧光显微镜下进行延时成像，为分析NMJ功能提供了一种经济高效的平台。

引言

由突触前末梢的突触小泡（SVs）释放神经递质介导的突触传递，是神经功能的基本过程1。在早期研究中，突触传递主要通过电生理技术进行测量，这些技术可检测神经递质与其受体相互作用所引发的突触后反应。然而，在过去几十年中，已开发出多种成像技术，能够直接可视化突触前功能2。其中应用最广泛的探针之一是一种称为pHluorin的pH敏感性绿色荧光蛋白3,4。

突触小泡（SVs）在突触前末梢的回收是维持神经递质持续传递的关键过程5。在SV通过胞吐作用释放神经递质后——其囊腔通常维持在酸性pH环境6,7——膜成分及SV蛋白会立即通过内吞作用从质膜上被回收。新形成的SV随后被重新酸化，并重新装载神经递质。当pHluorin通过与SV蛋白融合而被靶向定位至SV腔内时，在静息状态下其荧光信号极弱。然而，在SV发生胞吐时，pHluorin暴露于细胞外中性pH环境中，从而产生强烈的荧光信号。随后，随着SV的重新酸化，荧光信号逐渐减弱。因此，pHluorin荧光可用于实时监测SV的回收过程。

在开创性研究中，突触小泡相关膜蛋白2（synaptobrevin/VAMP 2）是前脑突触中负责突触小泡融合的囊泡型SNARE（可溶性NSF附着蛋白受体）蛋白8 在SV蛋白中含量最丰富9，被选为pHluorin的融合伴侣，所得到的融合蛋白被命名为synaptopHluorin（SpH）3,4然而，由于探针在细胞表面大量表达，SpH 的信噪比（S/N）较低。因此，已尝试其他突触囊泡蛋白作为载体伴侣10,11,12迄今为止，囊泡转运蛋白被证明具有最低的表面表达水平13,14,15这些探针最初在培养的哺乳动物神经元中被用于追踪动作电位驱动的突触囊泡循环8,9,10,11,12,13 并已扩展至其他制备物，包括解剖组织 体内 动物16,17,18,19,20,21,22.

幼年斑马鱼是一种具有重要价值的模式系统，具备易于进行遗传操作、光学通透性高以及体外发育迅速等特点。研究人员构建了表达与pHluorin融合的突触素（synaptophysin）的转基因斑马鱼，即SypHy斑马鱼，并将其应用于多种实验体系中，例如监测脊髓神经元突触小泡（SV）的自发性融合事件。 体内21不依赖动作电位的带状突触囊泡再循环 体内20,22 或在分离的细胞中23,24,25然而，pHluorin成像技术在斑马鱼模型中用于动作电位驱动的突触囊泡循环的研究应用仍然有限。

神经肌肉接头（NMJ）是研究突触生理学的一个理想模型26，已有多个研究成功在小鼠中利用SpH对动作电位（AP）驱动的突触小泡（SV）循环进行成像18,19。在斑马鱼中利用NMJ研究SV循环的工作由Wen等人首次开创16。最近，我们构建了转基因斑马鱼（Tg斑马鱼），其运动神经元特异性高表达与囊泡GABA转运体（VGAT）融合的pHluorin标记蛋白27。该探针还在VGAT的管腔端尾部串联携带一个HaloTag，因此被命名为VpHalo。尽管VGAT并非内源性表达于胆碱能运动神经元中，但我们通过结合电生理记录、依赖活动的HaloTag配体标记SV以及pHluorin的活体成像，证实了VpHalo能够定位于所有SV池，并能响应动作电位（AP）被正常循环利用27。由于VpHalo表达水平高且在细胞表面的背景信号极低，来自该转基因鱼的NMJ样本可实现信噪比良好的AP驱动SV循环监测。此外，由于NMJ在透明的斑马鱼体内分布稀疏，因此无需使用共聚焦激光扫描显微镜即可完成该检测。尽管在完整斑马鱼体内监测AP驱动的SV循环是未来理想的研究方向，但首要任务是建立适用于NMJ的制备方法，以便在严格可控的条件下验证基于pHluorin探针的有效性，正如在培养细胞样本中所进行的那样3,4,10,11,12,13,14,15。本文中，我们描述了一种制备斑马鱼幼鱼NMJ样本的解剖方案，该样本可用于多种类型的实验，例如终板电流的膜片钳记录、回收SV的HaloTag标记以及上述的pHluorin活体成像。此外，我们重点介绍并提供了利用该NMJ样本在配备电刺激装置和灌流系统的常规落射荧光显微镜下进行pHluorin活体成像的详细操作流程。

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方案

所有动物实验均按照大阪医疗药科大学关于动物护理和使用的指南进行。斑马鱼在14小时光照与10小时黑暗的循环条件下饲养和维持。胚胎和幼鱼在含有0.006%海盐和0.01%亚甲蓝的养卵水中于28–30 °C条件下培养。实验在受精后4–7天（dpf）进行。当实验在6 dpf之后进行时，建议从5 dpf开始每天喂食两次。每次喂食前必须更换培养液。

1. 溶液的配制

  1. 配制 200 mL 细胞外液（112 mM NaCl、2 mM KCl、10 mM HEPES、10 mM 葡萄糖、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2，pH 7.3–7.4）。取 6.4 mL 3.5 M NaCl、0.4 mL 1 M KCl、1 mL 1 M HEPES（pH 7.5）、0.4 mL 1 M CaCl2、0.2 mL 1 M MgCl2 和 360 mg 葡萄糖，加入超纯水定容至 200 mL。若 pH 不在 7.3–7.4 范围内，用 1 M NaOH 调节。每次实验均需使用新鲜配制的细胞外液。
  2. 配制含 3 µM D-筒箭毒碱（D-TBC）的 100 mL 细胞外液。将 20 µL 15 mM D-TBC 储存液加入 100 mL 细胞外液中。
    注：D-TBC 储存液以水配制，于 -20 °C 保存。
    注意：操作 D-TBC 粉末时需佩戴手套，并在通风橱内进行配制。处理 D-TBC 溶液时也建议佩戴手套。
  3. 配制含 0.02% 三卡因（MS-222）的 25 mL 细胞外液。将 0.5 mL 1% 三卡因储存液加入 25 mL 细胞外液中。
    注：三卡因储存液以水配制，于 4 °C 保存。三卡因仅用于解剖，成像过程中不使用。

2. 使用θ玻璃毛细管制备双极电极

  1. 使用微电极拉制仪拉制theta玻璃毛细管，使尖端直径在3-10 µm范围内（图1A）。
    注意：建议采用两步或多步程序来拉制毛细管。
  2. 将theta玻璃移液管（内径1.17 mm，隔膜厚度0.165 mm）连接至刺激隔离器。用细胞外溶液填充移液管。将一根细铂丝（直径0.1 mm）插入theta玻璃毛细管的每个开口中，并将铂丝的后端连接至刺激隔离器（图1B）。注意避免两根铂丝发生短路。

3. 样品制备

注意：本方案已针对 Tg(hb9:tTAad, TRE:TagRFP-P2A-VpHalo) 斑马鱼幼体优化27，在此品系中，以下两种蛋白通过 P2A 自剪切肽连接，在运动神经元中以双顺反子形式特异性表达：一种是报告蛋白——红色荧光蛋白 TagRFP，另一种是传感器蛋白 VpHalo，后者为 pHluorin 与 HaloTag 的融合蛋白，定位于 VGAT 的管腔部分（图 2A）。hb9 启动子驱动 tTAad（四环素调控的转录激活因子-高级型）的表达，后者进而诱导四环素反应元件（TRE）复合启动子下游基因的表达。Tet 诱导表达系统可提高蛋白表达水平。pHluorin 可用于活体监测依赖于神经活动的突触囊泡（SV）循环，而 HaloTag 则可通过共价标记融合蛋白，可视化特定时间段内被循环利用的突触囊泡（图 2A）。尽管这两种方法各有优势，但本文重点介绍 pHluorin 成像技术。

  1. 将含有0.02%三卡因的25 mL细胞外溶液倒入玻璃培养皿中。
  2. 解剖时，将一条幼鱼转移至培养皿中。用两把精细镊子剥去幼鱼的皮肤。用第一把镊子固定幼鱼，并在鳔背侧捏住皮肤 用另一把镊子（图3A).
  3. 用手术刀去除鱼的 swim bladder、内脏和头部。通常可同时剥离鱼体两侧的皮肤，参见 视频 1.

4. 将样品放置于成像室中并插入刺激电极

注意：由于突触小泡（SV）的静息管腔 pH 值低于 6.0，因此在活体斑马鱼的神经肌肉接头（NMJ）处，pHluorin 的荧光几乎无法观察到（图 2B）。然而，当突触小泡管腔被碱化后，可观察到 VpHalo 在神经肌肉接头处的局限性定位（图 2C）。值得注意的是，神经肌肉接头的共聚焦 z 轴层扫图像显示，在 xy 平面上，除体节边缘外，各信号之间并不重叠（图 2C）。基于此观察结果，我们推测落射荧光显微镜适用于斑马鱼幼体中 VpHalo 的活体成像，该推断已在下述实验方案中得到验证。

  1. 使用尖端经火焰抛光的玻璃巴斯德吸管将样品转移至成像室（图3B）。用粘附在C形铂丝上的尼龙线机械固定样品，使其方向大致与刺激电极平行（图3C）。
    注意：C形铂丝与尼龙线由实验室自制。取约1 cm长、直径0.5 mm的铂丝弯成C形，并用锤子敲平。尼龙线可从日常用品中获取。我们使用的尼龙线来自超市购买的厨房滤水篮拆解所得。类似的固定装置在脑片实验中常规使用28。
  2. 使用重力灌流系统，以约1.0 mL/min的流速持续向样品灌注含有3 µM D-TBC的细胞外溶液。
    注意：建议使用在线溶液加热器控制灌流液温度。
  3. 将刺激电极插入脊髓。将步骤2中制备的θ型玻璃吸管电极安装在配备电动显微操作器的电极夹持器上。将电极插入样品，使其尖端靠近位于脊髓腹侧的脊髓运动神经元；在此标本中，这些神经元表现为TagRFP阳性神经元，可被识别（图3D）。从相邻节段以倾斜角度推进电极至目标位置。
    注意：体节之间的边界致密且难以穿透，因此需缓慢施压推进电极。电极尖端的位置至关重要。若电极距离脊髓过远，则会直接刺激邻近肌肉，导致后续延时成像过程中出现显著的图像漂移。

5. 图像采集

  1. 选择成像区域。根据TagRFP荧光的实时图像，选择包含多个突触小结且避开体节边界的成像区域（图2C 和 图4A）。选择与刺激电极位于同一体节内的区域，因为运动神经元的支配范围通常局限于单个体节29,30。切换至GFP/pHluorin荧光的滤光片组。
    注意：在本实验设置中，pHluorin成像使用470/40 nm激发滤光片和510/20 nm发射滤光片；TagRFP成像使用555/20 nm激发滤光片和595/44 nm发射滤光片。使用Micro-Manager软件同时控制科学级cMOS相机的图像采集和LED光源的TTL快门。为实现图像采集与电刺激的同步，采用Arduino作为数字输入/输出设备。另一种无需编写脚本的替代方案是使用Molecular Devices的Digidata及其配套软件。
  2. 设置图像采集软件和数字输入/输出设备，使图像采集与电刺激同步。优化光源的曝光时间和强度，以在1 Hz时间序列模式下获得足够明亮但未饱和的图像，并将曝光时间填入Micro-Manager主窗口的“曝光 [ms]”字段中。
  3. 在Arduino脚本中设定刺激频率、动作电位（AP）数量以及图像采集开始与刺激施加之间的时间间隔。根据实验参数，确定图像采集总时长所对应的图像帧数，并将其填入Micro-Manager多维采集窗口的“计数”字段中。将“时间间隔”字段设为1 s，以实现1 Hz的时间序列成像。进行电刺激时，通过刺激隔离器施加持续时间为1 ms的恒定电压脉冲（70 mV）。
  4. 执行图像采集。运行数字化命令并开始图像采集。检查是否存在不可接受的图像漂移，并确认能否观察到pHluorin响应。若无法观察到响应，则电极位置可能不正确，需返回步骤4.2。
    注意：可通过肌纤维的微分干涉差（DIC）图像识别可能影响pHluorin响应的组织损伤。若未发现此类损伤但仍无pHluorin响应，则可能是电极定位错误所致。这通常表现为显著的图像漂移，因为电极位置不当会引起肌肉收缩，如步骤4.2所述。另一种可能导致无法诱发pHluorin响应的问题是theta玻璃毛细管中存在气泡，从而导致电极电学隔离。由于电极定位不当引起的肌肉收缩会导致Z轴方向的图像漂移，而这种漂移在后续图像分析中无法校正（见步骤6.5）。因此，建议在图像采集过程中识别出具有显著图像漂移的数据，并予以排除。
  5. 根据实验目的，调整刺激强度（即频率和脉冲数量）和/或温度。将时间序列图像保存为TIFF格式的时间序列图像堆栈。参见 视频2。

6. 图像分析

注意：使用 Fiji 进行以下图像处理与分析。使用 Microsoft Excel 或类似的电子表格软件计算测量结果。使用 Igor Pro 对获得的结果进行曲线拟合。

  1. 创建一幅差异图像，以突出显示如下所述的活跃突触。
    1. 在 Fiji 中通过选择打开图像的时间序列堆栈 文件 > 打开如果显示的图像较暗，请选择 图像 >调节 >亮度/对比度 >自动不要点击“应用”，因为这会重新调整信号强度，导致无法进行后续分析。请选择 分析 > 设置比例尺 输入成像条件下定义的校准因子。
    2. 选择刺激前时期采集的五幅图像，创建一个图像堆栈 图像 > 重复 并输入一个适当的数字以表示图像序列的范围（例如，对于具有15秒刺激前时期的实验，输入11-15）。
    3. 选择 图像 > 堆叠 > Z 投影 并选择 平均强度 从“投影类型”下拉菜单中选择。按下 好的 以生成刺激前时期的代表性图像（图4B平均过程对于减少信号波动的影响至关重要。
    4. 使用类似的处理方法，创建刺激后时期的平均图像图4B）。在刺激结束后立即复制五张图像的堆栈（例如，第26-30张th 15秒刺激前时期和10秒刺激时期实验的图像）。选择 过程 > 图像计算器 在下拉菜单中，分别将平均的刺激前图像和平均的刺激后图像设置为图像1和图像2。
    5. 选择 减去 从“操作”下拉菜单中选择并按下 好的 以生成一幅差异图像，突出显示活跃的突触（图 4B).
  2. 定义待分析的感兴趣区域（ROIs）。
    1. 选择 编辑 > 选择 > 指定 在第6.1步生成的差异图像上创建一个直径为7 µm的圆形感兴趣区域（ROI），将该ROI置于高亮显示的活跃突触位置，然后按压 T 将 ROI 添加到 ROI 管理器中。在所示的代表性结果中 图 4C- D在突触小结周围放置了6个ROI。
    2. 在未观察到信号增强的区域中，另设5个相同大小的感兴趣区域（ROI）。在下一步中，将其平均荧光强度用作背景信号。通过选择保存这些ROI 更多 >保存 从“感兴趣区域管理器”菜单中。
  3. 测量信号强度并计算荧光的显著变化。
    1. 选择原始时间序列图像栈，并将步骤 6.2 中保存的 ROI 转移至该图像栈。选择 分析 > 设置测量参数 并仅勾选“平均灰度值”复选框。通过选择所有时间点的感兴趣区域（ROI），测量其平均荧光强度。 更多 > 多参数检测 从“感兴趣区域管理器”菜单中。
    2. 将结果窗口中的所有数值复制并粘贴到电子表格程序中。计算5个背景感兴趣区域（ROI）的平均背景信号，并从每个突触ROI中减去该值，从而得到每个突触小体中显著的荧光变化（图 4D）。对单个视野中的所有数据（本例中为6个突触小结）进行平均，计为n = 1次实验。在 图4E，每条通过平均得到的曲线表示为 F/F0 通过将所有时间点的值除以初始基线期的平均值来计算。
  4. 通过曲线拟合估算荧光衰减时间常数（tau）。
    1. 在 Igor Pro 中通过选择打开一个新数据表 窗口 > 新表格. 复制时间点和 F/F0 从电子表格中复制数据，并将其粘贴到表格的不同行中。选择 窗口 > 新图表，选择 F/F0 将数据设为Y波形，时间点数据设为X波形，然后按压 动手操作 创建图表。
    2. 选择 窗口 > 显示信息 将一个光标置于信号峰上，另一个光标置于轨迹末端，以定义待分析数据的范围。选择 分析 > 曲线拟合 并选择 exp_XOffset 在“函数”下拉菜单中选择相应的函数，并在“波形”下拉菜单中选择适当的 X 和 Y 波形。
    3. 点击 数据选项 并按下 游标 按钮以设置曲线拟合范围。单击 系数，输入 1 作为 Y0，然后按 做它通过该程序进行曲线拟合可获得代表荧光衰减速率的 tau 值，该值反映了突触囊泡内吞和再酸化的速率。
  5. 执行手动漂移校正（可选），步骤如下所述。
    1. 如果在图像采集期间发生图像漂移，导致所选光斑移出7 µm直径的ROI区域，请运行手动漂移校正插件。在Fiji中通过选择打开时间序列图像堆栈 文件 > 打开. 选择 点工具 通过单击“点”工具栏。
    2. 找到最亮的突触小结作为标志物，并在其中心放置一个点。按下 T 将该点添加到 ROI 管理器中。对整个图像序列重复此过程。显示第一幅图像并选择 插件 > 注册 > 手动漂移校正将校正后的图像序列堆栈另存为新文件，并用于后续分析。
      注意：尽管X-Y漂移可以校正，但过大的Z轴漂移无法通过此方法校正。

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结果

如果解剖后的样本未受到严重组织损伤，且刺激电极已正确插入脊髓，则可通过高频电刺激引发强烈的pHluorin反应。图4D，E）。刺激前的荧光基线可能源于突触前膜表面存在的探针。刺激期间荧光的增加反映了探针通过胞吐作用释放至细胞表面。随后的荧光衰减则反映了含有探针的突触小泡的内吞及再酸化过程。基于pHluorin的探针的这些特性与以往在多种实验体系中的研究结果高度一致10,11,12,13,14,15,16,17

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讨论

幼年斑马鱼神经肌肉接头（NMJ）是研究突触生理学与病理学的一个新兴模型系统26,31。已有研究构建并使用了一种在神经元中特异性表达SpH的转基因斑马鱼，用于分析表现出运动障碍的突变体17。Wen等人17证明，在野生型对照NMJ中，以100 Hz频率刺激1000个动作电位（APs）时，pHluorin荧光强度大约增加2倍。相比之下，我们最近利用VpHalo的研究表明，在20 Hz频率下刺激200个动作电位时，pHluorin荧光强度增加了3倍以上，而该刺激强度明显弱于先前SpH研究所采用的条件17,27。因此，VpHalo能够以更高的响应灵敏度监测突触小泡（SV）的循环过程，并使得实验可在更接近生理条件的情况下进行。

上述关于 SpH 和 VpHalo 的研...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作得到了日本学术振兴会KAKENHI基金授予F. O.的18K06882项目资助；以及日本学术振兴会KAKENHI基金授予Y.E.的21K06429和24K10020项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
40倍水浸物镜OlympusLUMPLFLN40XW
四通道重力灌流系统ALAVCPlus-4G
5倍物镜OlympusNPLN5X
定制成像腔室Physiotechcustum made一个黑色丙烯酸板（直径10.7 cm，厚3 mm），中央带有一个井状凹槽（底部直径1 cm，顶部直径1.5 cm），可容纳约0.5 ml灌流液。 
数字输入/输出设备ArduinoUno Rev3
氯化筒箭毒碱五水合物Sigma93750
ExcelMicrosoftMicrosoft Office Professional Plus 2016
Fiji / ImageJhttps://imagej.net/ImageJ 1.54f
精细镊子AsOne7-562-05 (Dumont #5)
玻璃巴斯德吸管IWAKIIK-PAS-5P应修剪尖端并火焰抛光，直至最终直径为1.5–2 mm。 
玻璃培养皿AsOne1-4564-06
Igor ProWaveMetricsVer. 6.37
在线溶液加热器Warner InstrumentsSF-28
LED照明系统X-cyteXYLIS
亚甲蓝Wako133-06962
Micro-Managerhttps://micro-manager.org/Ver. 2.0.0
灌流管用微型磁性夹具Warner Instruments64-1553
电动显微操作器ScientificaPatchStar
电动可移动样品平台ScientificaMMSP
移液管固定器NarishigeH-13
移液管拉制仪NarishigePC-100
铂丝（φ0.1 mm）NilacoPT-351165
铂丝（φ0.5 mm）NiacoPT-351381
手术刀AsOne8-3086-02 (Feather #11)
科学级CMOS相机ThorlabsCC215MU
海水盐NAPQOInstant Ocean
体视显微镜OlympusSZX7
刺激隔离器AMPIISO-FLEX
吸引管Warner InstrumentsST-3, 64-1406
温度控制器Warner InstrumentsTC-324C
Theta玻璃毛细管Sutter InstrumentBT-150-10
三卡因（MS-222）TCIT0941
直立显微镜OlympusBX51WI

参考文献

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活体成像观察离体幼年斑马鱼神经肌肉接头中的突触囊泡循环
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