活体成像观察离体幼年斑马鱼神经肌肉接头中的突触囊泡循环

摘要

斑马鱼幼体的神经肌肉接头是研究突触生理学的理想模型。该模型适用于多种实验技术，包括电生理学和光学成像。本文中，我们描述了一种在直立式落射荧光显微镜下利用基于pHluorin的探针进行突触传递成像的实验方案。

摘要

神经元之间的信息传递主要依赖于突触传递，这一过程由动作电位（AP）触发突触囊泡（SVs）释放其中储存的神经递质而实现。由于突触囊泡在突触前末梢局部循环利用，因此囊泡的胞吐与内吞过程之间的协调对于维持持续的突触传递至关重要。一种对pH敏感的绿色荧光蛋白——pHluorin，可通过靶向定位至突触囊泡腔内，成为监测突触囊泡胞吐与内吞动态的有力工具。然而，利用基于pHluorin的探针追踪动作电位驱动的突触囊泡循环，在很大程度上仍受限于 体外 培养制备，因为引入基因编码探针并进行后续光学成像在技术上通常具有较大挑战性 体内 动物模型或组织制备。斑马鱼是一种具有多种优势的模式系统，包括易于进行遗传操作、组织透明度高以及体外发育迅速。我们近期构建了一种转基因斑马鱼，其运动神经元末梢可高水平表达pHluorin标记的探针，并开发了一种用于监测动作电位驱动的突触小泡出胞/内吞过程的实验方案，该过程位于神经肌肉接头（NMJ），这是一个经典的突触模型。 体内本文中，我们展示了如何制备适用于pHluorin成像的斑马鱼幼虫神经肌肉接头（NMJ）标本。我们还证明，该标本可在常规直立式落射荧光显微镜下进行延时成像，为分析NMJ功能提供了一种经济高效的平台。

引言

由突触前末梢的突触小泡（SVs）释放神经递质介导的突触传递，是神经功能的基本过程¹。在早期研究中，突触传递主要通过电生理技术进行测量，这些技术可检测神经递质与其受体相互作用所引发的突触后反应。然而，在过去几十年中，已开发出多种成像技术，能够直接可视化突触前功能²。其中应用最广泛的探针之一是一种称为pHluorin的pH敏感性绿色荧光蛋白^3,4。

突触小泡（SVs）在突触前末梢的回收是维持神经递质持续传递的关键过程⁵。在SV通过胞吐作用释放神经递质后——其囊腔通常维持在酸性pH环境^6,7——膜成分及SV蛋白会立即通过内吞作用从质膜上被回收。新形成的SV随后被重新酸化，并重新装载神经递质。当pHluorin通过与SV蛋白融合而被靶向定位至SV腔内时，在静息状态下其荧光信号极弱。然而，在SV发生胞吐时，pHluorin暴露于细胞外中性pH环境中，从而产生强烈的荧光信号。随后，随着SV的重新酸化，荧光信号逐渐减弱。因此，pHluorin荧光可用于实时监测SV的回收过程。

方案

所有动物实验均按照大阪医疗药科大学关于动物护理和使用的指南进行。斑马鱼在14小时光照与10小时黑暗的循环条件下饲养和维持。胚胎和幼鱼在含有0.006%海盐和0.01%亚甲蓝的养卵水中于28–30 °C条件下培养。实验在受精后4–7天（dpf）进行。当实验在6 dpf之后进行时，建议从5 dpf开始每天喂食两次。每次喂食前必须更换培养液。

1. 溶液的配制

1. 配制 200 mL 细胞外液（112 mM NaCl、2 mM KCl、10 mM HEPES、10 mM 葡萄糖、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂，pH 7.3–7.4）。取 6.4 mL 3.5 M NaCl、0.4 mL 1 M KCl、1 mL 1 M HEPES（pH 7.5）、0.4 mL 1 M CaCl₂、0.2 mL 1 M MgCl₂ 和 360 mg 葡萄糖，加入超纯水定容至 200 mL。若 pH 不在 7.3–7.4 范围内，用 1 M NaOH 调节。每次实验均需使用新鲜配制的细胞外液。
2. 配制含 3 µM D-筒箭毒碱（D-TBC）的 100 mL 细胞外液。将 20 µL 15 mM D-TBC 储存液加入 100 mL 细胞外液中。
   注：D-TBC 储存液以水配制，于 -20 °C 保存。
   注....

结果

如果解剖的样品未造成严重组织损伤，且刺激电极已正确插入脊髓，则可通过高频电刺激引发出显著的pHluorin反应（图4D、E）。刺激前的荧光基线水平可能源于存在于突触前膜表面的探针信号。刺激期间荧光的增加反映了探针通过胞吐作用释放至细胞表面。随后的荧光衰减则反映了含有探针的突触小泡（SVs）发生内吞及再酸化过程。基于pHluorin的探针的这些特性与以往在多种实验体系中报道的结果高度一致^{10,11,12,13,14,15,16,1.......}

讨论

幼年斑马鱼神经肌肉接头（NMJ）是研究突触生理学与病理学的一个新兴模型系统^26,31。已有研究构建并使用了一种在神经元中特异性表达SpH的转基因斑马鱼，用于分析表现出运动障碍的突变体¹⁷。Wen等人¹⁷证明，在野生型对照NMJ中，以100 Hz频率刺激1000个动作电位（APs）时，pHluorin荧光强度大约增加2倍。相比之下，我们最近利用VpHalo的研究表明，在20 Hz频率下刺激200个动作电位时，pHluorin荧光强度增加了3倍以上，而该刺激强度明显弱于先前SpH研究所采用的条件^17,27。因此，VpHalo能够以更高的响应灵敏度监测突触小泡（SV）的循环过程，并使得实验可在更接近生理条件的情况下进行。

上述关于 SpH 和 VpHalo 的研.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40倍水浸物镜	Olympus	LUMPLFLN40XW
四通道重力灌流系统	ALA	VCPlus-4G
5倍物镜	Olympus	NPLN5X
定制成像腔室	Physiotech	custum made	一个黑色丙烯酸板（直径10.7 cm，厚3 mm），中央带有一个井状凹槽（底部直径1 cm，顶部直径1.5 cm），可容纳约0.5 ml灌流液。
数字输入/输出设备	Arduino	Uno Rev3
氯化筒箭毒碱五水合物	Sigma	93750
Excel	Microsoft	Microsoft Office Professional Plus 2016
Fiji / ImageJ	https://imagej.net/	ImageJ 1.54f
精细镊子	AsOne	7-562-05 (Dumont #5)
玻璃巴斯德吸管	IWAKI	IK-PAS-5P	应修剪尖端并火焰抛光，直至最终直径为1.5–2 mm。
玻璃培养皿	AsOne	1-4564-06
Igor Pro	WaveMetrics	Ver. 6.37
在线溶液加热器	Warner Instruments	SF-28
LED照明系统	X-cyte	XYLIS
亚甲蓝	Wako	133-06962
Micro-Manager	https://micro-manager.org/	Ver. 2.0.0
灌流管用微型磁性夹具	Warner Instruments	64-1553
电动显微操作器	Scientifica	PatchStar
电动可移动样品平台	Scientifica	MMSP
移液管固定器	Narishige	H-13
移液管拉制仪	Narishige	PC-100
铂丝（φ0.1 mm）	Nilaco	PT-351165
铂丝（φ0.5 mm）	Niaco	PT-351381
手术刀	AsOne	8-3086-02 (Feather #11)
科学级CMOS相机	Thorlabs	CC215MU
海水盐	NAPQO	Instant Ocean
体视显微镜	Olympus	SZX7
刺激隔离器	AMPI	ISO-FLEX
吸引管	Warner Instruments	ST-3, 64-1406
温度控制器	Warner Instruments	TC-324C
Theta玻璃毛细管	Sutter Instrument	BT-150-10
三卡因（MS-222）	TCI	T0941
直立显微镜	Olympus	BX51WI