用于定量代谢通量研究的洗涤人血小板制备

摘要

血小板代谢备受关注，尤其是其高活性与低活性在出血及血栓性疾病中的作用。某些代谢检测需要将血小板从血浆中分离；本文介绍一种从洗涤后血小板中分离细胞内代谢物的方法。

摘要

血小板是一类在止血和先天免疫反应中发挥关键作用的血细胞。血小板的过度活化或功能低下均与代谢紊乱相关，会增加血栓形成和出血的风险。血小板的活化与其代谢密切相关，目前已有多种方法用于检测前者，但针对后者的检测手段相对有限。为了在不受其他血细胞和血浆成分干扰的情况下研究血小板代谢，必须对血小板进行分离。然而，由于血小板对剪切力敏感且易于发生不可逆活化，这一过程具有较大挑战性。本文介绍了一种血小板分离（洗涤）方案，可获得处于静息状态且对血小板激动剂刺激敏感的血小板。该方法通过连续的离心步骤，并在过程中添加血小板抑制剂，将血小板从全血中分离并重悬于成分可控的等渗缓冲液中。该方法可稳定地从全血中回收30%–40%的血小板，且活化水平较低，可通过颗粒分泌标志物和整合素活性加以验证。用户可精确控制血小板数量和燃料浓度，从而探究多种代谢状态下的生物学问题。

引言

血小板是体积较小（直径2–4 µm）、无细胞核的细胞，在止血过程中发挥重要作用，止血是一种受到严密调控的凝血过程¹。尽管血小板对维持血管完整性至关重要，但也与多种不良健康事件相关。血小板参与深静脉血栓形成（DVT）和动脉血栓形成（AT），这些血栓会阻塞血管，导致局部血流减少；或者，当血栓碎片脱落（栓塞）时，可能阻断肺部、心脏或大脑的血液供应^2,3,4,5,6,7。血小板高反应性是高血压、糖尿病和癌症的共病因素，导致DVT和AT的发生率增加^8,9,10。血小板的活化与其代谢密切相关^11,12，这促使人们越来越关注将靶向血小板代谢作为治疗策略¹³

方案

本研究获得了科罗拉多大学安舒茨医学校区机构审查委员会的批准。所有研究参与者均签署了书面知情同意书。参与者报告在采样前48小时内未饮酒，在采样前十天内未服用非甾体抗炎药（NSAIDs）。本项目由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所资助，资助编号为R61HL141794。

1. 血液采集

1. 准备采血。建议由经过培训的采血技术人员进行血液采集。
2. 使用19 G针头在手臂内侧进行静脉穿刺。
3. 将最初采集的约2 mL血液收集至不含添加剂的真空采血管中并弃去。此步骤旨在去除受损内皮细胞释放的化学信号分子，以避免激活血小板。在采集完最初的2 mL血液后，松开止血带以减少血小板所受的剪切应力。
4. 将剩余血液以14:3（血液:ACD-A）的比例收集至含抗凝剂枸橼酸右旋葡萄糖（ACD-A）的真空采血管中。采血后轻轻倒置每支采血管，使血液与抗凝剂充分混匀。

2. 血小板洗涤

结果

代表性结果 图2 代表6位不同的献血者，包括3名男性和3名女性。相对于全血的血小板得率如图所示 图2A最终血小板回收率为平均 52% ± 3%（标准差，n=6）。使用全自动血液学分析仪测定最终血小板计数与白细胞污染情况。白细胞计数占总细胞数的比例低于 0.1%图2B）。经过洗涤过程和1小时静置，血小板仍保持较低的P-选择素暴露水平，但对凝血酶处理表现出强烈反应（图 2C）。第一次1000 x 后结合的纤维蛋白原峰 g 离心，但在第二次1000 × g离心后恢复至5%以下 g 旋转。与P-选择素暴露类似，经凝血酶处理并在静置1小时后，结合的纤维蛋白原显著增加图2D代表性门控策略用于筛选大小、单细胞及CD42a阳性细胞，如图所示。 图 3A

讨论

血小板对其所处环境极为敏感，包括剪切应力和激动剂的存在^38,39。这使得血小板的处理和分离具有挑战性，因此使用抑制剂和宽口移液管至关重要⁴⁰。正确储存和配制PGI₂非常关键，若未在碱性PBS中配制PGI₂，将导致PGI₂迅速降解⁴¹。为尽量减少剪切力诱导的活化，应使用宽口移液管、斜面切割的移液枪头以及19号采血针。

在洗涤过程的每一步中，不可避免地会损失一部分血小板（图2A）。并非所有血小板都会保留在血浆层中，若收集血浆时过于接近白细胞层，则存在白细胞污染的风险。此外，在重悬过程中，部分血小板会发生聚集并沉降至管底，因此每次重悬后将重悬的沉淀转移至洁净离心管中至关重要。如图2D所示，在第一次1000 × g离心后，纤维蛋白原结合增加，而在第二次10.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µM 滤膜 Spin-X 离心管	Millapore-Sigma	CLS8160	试剂制备
19 G × 3/4" 针头	McKesson Corporation	448406	采血
21 G 1.5 英寸带鲁尔锁的针头	Amazon	B0C39PJD23	试剂制备
96 孔半面积板	Greiner Bio-One	675101	流式细胞术
ACD-A 真空采血管	Fisher Scientific	364606	采血
接头	McKesson Corporation	609	采血
酒精棉片	VWR	15648-916	采血
马铃薯来源的apyrase	Sigma	A6410-100UN	试剂制备
CD42a 单克隆抗体	Thermo Fisher Scientific	48-0428-42	流式细胞术
预冷微量离心机	ThermoFisher Scientific	75002441	淬灭
D-葡萄糖	Sigma	G7021	试剂制备
FITC 标记的抗纤维蛋白原抗体	Abcam	4217	流式细胞术
流式细胞仪	Beckman Coulter	82922828	流式细胞术
纱布	VWR	76049-110	采血
甘油	Sigma Aldrich	G5516	试剂制备
HEPES	Sigma Aldrich	H4034	试剂制备
人α-凝血酶	Prolytix	HCT-0020	流式细胞术
KCl	Sigma Aldrich	P9333	试剂制备
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5655	试剂制备
MgCl2	Sigma	M8266	试剂制备
微量离心管	VWR	87003-292	通用
Na2HPO4	Sigma	S3264	试剂制备
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	试剂制备
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761	试剂制备
细口径移液管	VWR	16001-176	血小板洗涤
4% 多聚甲醛 PBS 溶液	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	流式细胞术
PECy5 标记的小鼠抗人 CD62P 抗体	BD Pharmingen	551142	流式细胞术
板盖	Thermo Fisher Scientific	AB0626	流式细胞术
聚丙烯 15 mL 锥形管	VWR	89039-658	试剂制备
聚丙烯 50 mL 锥形管	VWR	352070	血小板洗涤
前列环素 I2（钠盐）	Cayman Chemical	18220	试剂制备
SKC Inc. C-Chip 一次性血细胞计数板	Fisher Scientific	22-600-100	细胞计数
注射器	BD Pharmingen	14-823-41	试剂制备
止血带	VWR	76235-371	采血
真空采血管针头架	BD	364815	采血
涡旋振荡器	VWR	102091-234	试剂制备
水浴锅	Thermo Fisher Scientific	TSGP02	血小板洗涤
宽口径移液管	VWR	76285-362	血小板洗涤