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方法文章

用于定量代谢通量研究的洗涤人血小板制备

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DOI：

10.3791/67639

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2025年1月10日

 ,  ,  , 
1Depeartment of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Department of Bioengineering, University of Colorado Denver, Anschutz Medical Campus, 3Department of Pediatrics, Section of Hematology, Oncology, and Bone Marrow Transplant, University of Colorado Denver, Anschutz Medical Campus, 4Quantitative Biosciences and Engineering, Colorado School of Mines

本文内容

摘要

血小板代谢备受关注，尤其是其高活性与低活性在出血及血栓性疾病中的作用。某些代谢检测需要将血小板从血浆中分离；本文介绍一种从洗涤后血小板中分离细胞内代谢物的方法。

摘要

血小板是一类在止血和先天免疫反应中发挥关键作用的血细胞。血小板的过度活化或功能低下均与代谢紊乱相关，会增加血栓形成和出血的风险。血小板的活化与其代谢密切相关，目前已有多种方法用于检测前者，但针对后者的检测手段相对有限。为了在不受其他血细胞和血浆成分干扰的情况下研究血小板代谢，必须对血小板进行分离。然而，由于血小板对剪切力敏感且易于发生不可逆活化，这一过程具有较大挑战性。本文介绍了一种血小板分离（洗涤）方案，可获得处于静息状态且对血小板激动剂刺激敏感的血小板。该方法通过连续的离心步骤，并在过程中添加血小板抑制剂，将血小板从全血中分离并重悬于成分可控的等渗缓冲液中。该方法可稳定地从全血中回收30%–40%的血小板，且活化水平较低，可通过颗粒分泌标志物和整合素活性加以验证。用户可精确控制血小板数量和燃料浓度，从而探究多种代谢状态下的生物学问题。

引言

血小板是体积较小（直径2–4 µm）、无细胞核的细胞，在止血过程中发挥重要作用，止血是一种受到严密调控的凝血过程1。尽管血小板对维持血管完整性至关重要，但也与多种不良健康事件相关。血小板参与深静脉血栓形成（DVT）和动脉血栓形成（AT），这些血栓会阻塞血管，导致局部血流减少；或者，当血栓碎片脱落（栓塞）时，可能阻断肺部、心脏或大脑的血液供应2,3,4,5,6,7。血小板高反应性是高血压、糖尿病和癌症的共病因素，导致DVT和AT的发生率增加8,9,10。血小板的活化与其代谢密切相关11,12，这促使人们越来越关注将靶向血小板代谢作为治疗策略13,14。关于血小板活化后确切的代谢重编程机制仍存在争议，这也是当前活跃的研究领域之一15。随着对疾病中血小板功能障碍及其与代谢关联的关注日益增加，迫切需要一种可重复的方法来分离血小板并研究其代谢特性。

人类血小板通常通过静脉穿刺获取，然后从全血中分离。 洗涤血小板通过连续的洗涤和离心步骤从全血中分离16。该方法最初由 Mustard 研究组建立17，随后由 Cazenave 研究组稍作改进18。另一种替代方法是凝胶过滤血小板，可通过使用琼脂糖凝胶珠填充柱进行尺寸排阻色谱法从富血小板血浆（PRP）中获得19。目前存在多种适用于人类和啮齿类动物血液的洗涤方案，并已针对不同检测方法进行了优化20,21,22,23，但尚无专门用于测量血小板代谢的方案。

研究血小板代谢的技术包括通过Seahorse XF分析仪进行的生物能量测定11,24,25,26,27、细胞外通量测定11,13,24、代谢组学14,28以及同位素辅助的代谢通量分析（13C-MFA）29。在代谢组学研究中，通常目标是确定两种不同条件之间的改变通路（例如，静息状态与激活状态的血小板14）。代谢组学研究涉及使用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）。这些研究可针对细胞内或细胞外代谢物进行，并常与通路分析或主成分分析（PCA）相结合14,28。同位素辅助的代谢通量分析（13C-MFA）包括向细胞提供一种称为示踪剂的标记底物，并利用LC-MS测量该示踪剂在反应网络中的传播情况。该技术能够以反应水平的分辨率计算代谢通路中的通量29,30。在全血和富血小板血浆（PRP）中，燃料浓度（如葡萄糖、谷氨酰胺、乙酸盐等）存在供体间的变异性，而血浆中存在的白蛋白和性激素结合球蛋白可能改变激素、药物及其他生物学相关分子的活性浓度31。洗涤后的血小板提供了一种将血小板悬浮于用户自定义培养基中的方法，其中可包含已知浓度的燃料，适用于13C-MFA研究32。

本文介绍了一种用于血小板洗涤的方法，以获得可用于代谢分析的血小板。该方案可制备出静息状态的血小板，且红细胞和白细胞污染较少。  通过流式细胞术检测血小板活化标志物，监测血小板的活化状态。该方案相对于全血中的血小板计数，可稳定实现至少30%–40%的血小板回收率。采用此技术获得的洗涤血小板适用于多种代谢分析方法，且细胞内代谢物提取方法可根据使用者的需求进行调整（如LC-MS、GC-MS、光度法检测等）。

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方案

本研究获得了科罗拉多大学安舒茨医学校区机构审查委员会的批准。所有研究参与者均签署了书面知情同意书。参与者报告在采样前48小时内未饮酒，在采样前十天内未服用非甾体抗炎药（NSAIDs）。本项目由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所资助，资助编号为R61HL141794。

1. 血液采集

  1. 准备采血。建议由经过培训的采血技术人员进行血液采集。
  2. 使用19 G针头在手臂内侧进行静脉穿刺。
  3. 将最初采集的约2 mL血液收集至不含添加剂的真空采血管中并弃去。此步骤旨在去除受损内皮细胞释放的化学信号分子，以避免激活血小板。在采集完最初的2 mL血液后，松开止血带以减少血小板所受的剪切应力。
  4. 将剩余血液以14:3（血液:ACD-A）的比例收集至含抗凝剂枸橼酸右旋葡萄糖（ACD-A）的真空采血管中。采血后轻轻倒置每支采血管，使血液与抗凝剂充分混匀。

2. 血小板洗涤

血小板分离过程，显示转速（RPM）和时间步骤的离心示意图，实验室工作流程。
图1：血小板洗涤过程中连续的离心和重悬步骤。 请点击此处查看此图的放大版本。

注意：避免产生气泡。当气泡形成时，尤其是在离心前，应使用移液管去除气泡。每次打开或关闭血液/血小板管时，建议在盖上管盖前向管内呼气，以提高 CO2 水平。

  1. 预热离心机至 37 °C 以减少温度影响。在方案的每一步离心操作之间，保持离心机处于 37 °C.
  2. 将水浴锅预热至 37 °C. 将含葡萄糖的改良Tyrode's缓冲液置于水浴中。
    注意：改良的台氏液配方见于 补充文件 1.
  3. 将所有真空采血管中收集的全血合并至50 mL聚丙烯圆锥形离心管中。使用斜面切割的移液器吸头，在 45° 角度，取适量样品体积进行细胞计数（参见 细胞计数).
  4. 使用窄口移液管小心抽吸，去除产生的气泡。
  5. 将血液置于水浴中静置25分钟 37 °C 这使得血小板在可逆性活化状态（由于从体内取出、在试管间转移等操作所致）能够恢复至静息状态。
  6. 为防止离心过程中发生激活，加入 500 nM 前列腺素 I2 （PGI2）和 0.02 U/mL 阿吡塞酶加入全血中，轻轻倒置混匀一次。使用细口移液管去除产生的气泡。
    注意：正确使用PGI的说明2 以及apyrase配方可在 补充文件 1.
  7. 离心全血以获得富血小板血浆（PRP）（250 × g，15 分钟） g 对于42 mL全血）不使用刹车（37 °C).
  8. 使用宽孔移液管，轻柔地将PRP（位于白膜层和红细胞层上方的顶层黄色液体）收集至新的50 mL锥形管中。
  9. 转移时，将洁净的锥形管倾斜，轻轻沿管壁加入富血小板血浆（PRP），避免产生气泡。
  10. 留下约3 mm的PRP，以避免扰动白细胞层（位于PRP与红细胞之间的白色层）。若被扰动，转移移液管中会出现突然的白色漩涡状现象。
  11. 细胞计数（参见 血小板计数以确定下一步洗涤所需的重悬体积。
  12. 静置10分钟 37 °C.
  13. 使用斜面切割的移液器吸头取样，用于流式细胞术（参见 流式细胞术).
  14. 加入 500 nM PGI2 向PRP中加入0.02 U/mL阿pyrase，轻轻倒置混匀一次。
  15. 以 1000 x g 离心 10 分钟 g 在 37 °C （加速度：0，刹车：0）。请勿使用刹车。沉淀物不紧密，突然刹车可能导致重新混悬。 
  16. 离心时，确定重悬体积。假设回收率为75%，使细胞密度约为3×105 细胞μL.
  17. 使用塑料宽口移液管吸走上清液的大部分体积，剩余靠近沉淀的液体用1 mL移液器（未剪切尖端）吸走。避免触碰管底的沉淀。
  18. 加入 500 nM PGI2 并加入 0.02 U/mL 阿皮拉酶至改良 Tyrode 缓冲液中。将步骤 16 中计算好的缓冲液体积，沿锥形管管壁缓慢滴加。
  19. 使用斜切尖端的1 mL移液枪头，轻轻吹打沉淀物数次，以温和地重悬沉淀。
    1. 设定体积为 300 μL将移液器活塞在液面之上完全压下至底，然后将移液器尖端置于液面以下，缓慢上提至第一停点。此操作可使科学家重悬沉淀物，同时避免意外产生气泡，从而防止血小板被激活。
    2. 偶尔可见沉淀底部有一圈红细胞，应避免重悬此部分。
  20. 重悬沉淀后，使用宽口移液管将重悬液转移至新的锥形管中，留下任何红细胞或明显成团的细胞。
  21. 重复步骤11-20，确保加入500 nM PGI2 以及从新分装的样品中加入 0.02 U/mL 至改良 Tyrode 缓冲液中（不要重复使用第 18 步中的改良 Tyrode 缓冲液，PGI2 极不稳定。
  22. 取样进行细胞计数。根据需要，用改良的Tyrode缓冲液调整血小板浓度。
  23. 使用斜面切割的移液器吸头吸取流式细胞术样品。
  24. 让血小板在室温下静置1小时 37 °C 以留出足够时间使抑制剂作用消退，并让任何可逆性激活的血小板恢复至静息状态。
  25. 用宽口移液管轻轻混匀。取样进行流式细胞术检测。
  26. 洗涤后的静息血小板现可用于代谢分析。

3. 血小板计数

  1. 可使用自动化血细胞计数器（遵循制造商说明）或血细胞计数板33对血小板进行计数。

4. 流式细胞术

  1. 准备
    1. 有关设置抗体混合物和准备流式细胞仪以检测血小板活化的详细方案及最佳实践综述，可参见其他文献34,35。
  2. 取样
    1. 进行流式细胞术取样时，使用斜面切割的移液器吸头收集血小板悬液，缓慢加入含有抗体的微量离心管中，轻轻弹击管壁混匀，室温孵育30秒。
    2. 使用斜面切割的移液器吸头，将血小板悬液/抗体混合物转移至96孔板中的相应孔位。
    3. 立即向孔中加入固定剂以固定细胞。
    4. 在固定后8小时内上机进行流式细胞术检测。
  3. 激动剂敏感性测试
    1. 洗涤后，准备两个15 mL锥形管，分别用于静息对照和凝血酶激活对照。
    2. 使用斜面切割的移液器吸头，轻柔地将100 μL血小板悬液加入每个锥形管中，在37 °C条件下静置1小时。
    3. 静置1小时后，向其中一个管中加入0.1 U/mL凝血酶（凝血酶配制方法见补充文件1），另一管中加入等量溶剂。在37 °C孵育15分钟。
    4. 分别从每管中取样进行流式细胞术检测，以评估血小板对激动剂的敏感性。

5. 定量代谢通量分析的取样

  1. 淬灭
    注意：淬灭代谢是准确测量代谢通量的必要步骤。通过快速冷却细胞并将其温度维持在 4 °C 或更低，可使代谢显著减缓，从而可认为其基本停止，以确保所采样的细胞能够真实反映整体培养物中细胞的代谢状态。虽然存在多种可用方法，但为了在快速冷却与最小化物质泄漏之间取得平衡，建议使用冷的（-4 °C）生理盐水36。如果盐分可能干扰后续分析，可改用其他液体（如甲醇/水、乙醇等）37。
    1. 准备并冷冻分装好的生理盐水，每份生理盐水体积为所需样品体积的 6 倍。
      注意：生理盐水配方见补充文件 1。
    2. 将微量离心机预冷至 0 °C。
    3. 以 1:6 的比例将血小板悬液收集至部分冻结的生理盐水（< -4 °C）中（例如，将 150 μL 血小板悬液加入含 750 μL 生理盐水的微量离心管中）。
      注意：血小板/盐水溶液在冰上放置时间不得超过 15 分钟。
    4. 在 16,000 x g、0 °C 条件下离心 10 分钟。
    5. 保留上清液用于胞外代谢物分析，沉淀用于胞内代谢物提取和测定。将两者均储存于 -20 °C，待分析时取出。
    6. 在所需的时间间隔和多个采样时间点重复此过程。
  2. 胞内代谢物提取
    1. 向已淬灭的沉淀中加入 0.5 mL 预冷的 -20 °C 7:3 甲醇-水溶液，剧烈涡旋 1 分钟。
    2. 液氮中速冻，0 °C 下解冻，再重复此冻融循环 2 次。
    3. 将悬液在 -4 °C、16,000 x g 条件下离心 10 分钟。
    4. 将上清液收集至新的微量离心管中。
    5. 取步骤 3 中的沉淀，使用 50:50 甲醇:水重复提取步骤（步骤 1–3），并将第二次收集的提取液合并至第一次提取液中，于室温下干燥过夜。
    6. 将干燥后的提取物重悬于 150 µL 液相色谱-质谱级水（或适用于目标分析的其他适当溶剂）中，在 4 °C 下混合 15 分钟。短暂涡旋后转移至 0.22 μm 微量离心管中以去除细胞碎片，在 16,000 x g、4 °C 条件下离心 5 分钟。
    7. 从离心机中取出后，用移液器向滤膜中加入额外的 50 μL 优级纯水，再次离心（5 分钟，16,000 x g，4 °C）以冲洗滤膜。收集冲洗液用于分析。

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结果

代表性结果 图2 代表6位不同的献血者，包括3名男性和3名女性。相对于全血的血小板得率如图所示 图2A最终血小板回收率为平均 52% ± 3%（标准差，n=6）。使用全自动血液学分析仪测定最终血小板计数与白细胞污染情况。白细胞计数占总细胞数的比例低于 0.1%图2B）。经过洗涤过程和1小时静置，血小板仍保持较低的P-选择素暴露水平，但对凝血酶处理表现出强烈反应（图 2C）。第一次1000 x 后结合的纤维蛋白原峰 g 离心，但在第二次1000 × g离心后恢复至5%以下 g 旋转。与P-选择素暴露类似，经凝血酶处理并在静置1小时后，结合的纤维蛋白原显著增加图2D代表性门控策略用于筛选大小、单细胞及CD42a阳性细胞，如图所示。 图 3A

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讨论

血小板对其所处环境极为敏感，包括剪切应力和激动剂的存在38,39。这使得血小板的处理和分离具有挑战性，因此使用抑制剂和宽口移液管至关重要40。正确储存和配制PGI2非常关键，若未在碱性PBS中配制PGI2，将导致PGI2迅速降解41。为尽量减少剪切力诱导的活化，应使用宽口移液管、斜面切割的移液枪头以及19号采血针。

在洗涤过程的每一步中，不可避免地会损失一部分血小板（图2A）。并非所有血小板都会保留在血浆层中，若收集血浆时过于接近白细胞层，则存在白细胞污染的风险。此外，在重悬过程中，部分血小板会发生聚集并沉降至管底，因此每次重悬后将重悬的沉淀转移至洁净离心管中至关重要。如图2D所示，在第一次1000 × g离心后，纤维蛋白原结合增加，而在第二次10...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨此感谢皮埃尔·芒金博士实验室的艾米丽·贾纳斯-贝尔博士、克拉丽丝·穆里厄以及乔治·迪帕奥拉博士实验室的卡特里娜·巴克所提供的指导与建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µM 滤膜 Spin-X 离心管Millapore-SigmaCLS8160试剂制备
19 G × 3/4" 针头McKesson Corporation448406采血
21 G 1.5 英寸带鲁尔锁的针头AmazonB0C39PJD23试剂制备
96 孔半面积板Greiner Bio-One675101流式细胞术
ACD-A 真空采血管 Fisher Scientific364606采血
接头McKesson Corporation609采血
酒精棉片VWR15648-916采血
马铃薯来源的apyraseSigmaA6410-100UN试剂制备
CD42a 单克隆抗体Thermo Fisher Scientific48-0428-42流式细胞术
预冷微量离心机 ThermoFisher Scientific75002441淬灭
D-葡萄糖SigmaG7021试剂制备
FITC 标记的抗纤维蛋白原抗体Abcam4217流式细胞术
流式细胞仪Beckman Coulter82922828流式细胞术
纱布VWR76049-110采血
甘油Sigma AldrichG5516试剂制备
HEPESSigma AldrichH4034试剂制备
人α-凝血酶ProlytixHCT-0020流式细胞术
KClSigma AldrichP9333试剂制备
KH2PO4Sigma AldrichP5655试剂制备
MgCl2SigmaM8266试剂制备
微量离心管VWR87003-292通用
Na2HPO4SigmaS3264试剂制备
NaClSigma AldrichS7653试剂制备
NaHCO3Sigma AldrichS5761试剂制备
细口径移液管VWR16001-176血小板洗涤
4% 多聚甲醛 PBS 溶液Santa Cruz Biotechnologysc-281692流式细胞术
PECy5 标记的小鼠抗人 CD62P 抗体BD Pharmingen551142流式细胞术
板盖Thermo Fisher ScientificAB0626流式细胞术
聚丙烯 15 mL 锥形管VWR89039-658试剂制备
聚丙烯 50 mL 锥形管VWR352070血小板洗涤
前列环素 I2（钠盐）Cayman Chemical18220试剂制备
SKC Inc. C-Chip 一次性血细胞计数板Fisher Scientific22-600-100细胞计数
注射器BD Pharmingen14-823-41试剂制备
止血带VWR76235-371采血
真空采血管针头架BD364815采血
涡旋振荡器VWR102091-234试剂制备
水浴锅Thermo Fisher ScientificTSGP02血小板洗涤
宽口径移液管VWR76285-362血小板洗涤

参考文献

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