方法文章

用于活组织中发芽血管生成的 离体 机械表征的 2.5D 模型

DOI：

10.3791/67641

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2025年2月28日

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1Department of Biomedical Engineering, Soft Tissue Engineering and Mechanobiology, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems, Eindhoven University of Technology, 3Institute for Bioengineering of Catalonia, The Barcelona Institute of Science and Technology, 4Faculty of Science and Engineering, Cell Biology, Åbo Akademi University

本文内容

摘要

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发芽血管生成是发育和疾病的基础，涉及复杂的分子和机械过程。我们提出了一个多功能的 2.5D 离体 模型，该模型分析了猪颈动脉的细胞发芽，揭示了刚度依赖性的血管生成和独特的前导-跟随细胞力学。该模型有助于推进组织工程策略和癌症治疗方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

发芽血管生成是从预先存在的脉管系统形成新血管，对于生理学（如组织生长和修复）和病理过程（包括癌症和转移）非常重要。发芽血管生成的多步骤过程是一个分子和机械驱动的过程。它包括通过血管内皮生长因子诱导细胞芽、通过 Notch 信号传导选择前导/跟随细胞、内皮细胞的定向迁移以及血管融合和稳定。多年来，已经开发了各种发芽血管生成模型，以更好地了解细胞发芽的潜在机制。尽管在理解发芽血管生成的分子驱动因素方面取得了进展，但由于现有模型的局限性，机械线索的作用和发芽血管生成的机械驱动因素仍未得到充分探索。在这项研究中，我们设计了一个 2.5D 离体模型，使我们能够使用牵引力显微镜机械表征猪颈动脉的细胞发芽。该模型确定了芽内不同的力模式，其中领导细胞施加拉力，而追随细胞对基质施加推力。该模型的多功能性允许纵化学和机械线索，例如基质刚度，从而增强其与各种微环境的相关性。在这里，我们证明了发芽血管生成的开始是刚性依赖性的。所提出的用于量化发芽血管生成过程中细胞牵引力的 2.5D 模型提供了一种简化但具有生理学相关性的方法，增强了我们对细胞对机械线索反应的理解，这可以推进针对肿瘤血管生成的组织工程和治疗策略。

引言

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血管生成是从预先存在的血管形成新血管的过程。这个过程在胚胎发育、伤口愈合和癌症进展过程中是必不可少的，所有这些都与微环境中的生物力学变化有关 1,2,3,4。在血管生成开始时，缺氧或受伤的组织会释放血管内皮生长因子 （VEGF），该因子将激活邻近血管的内皮细胞以形成内皮芽 - 其中两种不同的前导和跟随表型通过分子 Notch 信号通路采用5。在内皮芽形成（一种称为发芽血管生成的现象）时，前导细胞将降解周围的细胞外基质，共同迁移到 VEGF 刺激，而不会失去与后续跟随细胞的细胞间粘附 6,7。

在过去的几十年里，已经描述了越来越多的发芽血管生成测定，这些测定通过各种方法研究细胞集体迁移，每种方法都有不同的优点和局限性。这些分析评估了细胞群（如内皮细胞）通过 3D 基质的协调运动，从而允许在受控环境中研究细胞行为，如发芽、侵袭和集体迁移 8,9,10。体内发芽血管生成测定可在生物体内进行全面评估，捕获复杂的相互作用，但耗时、成本高、易产生高变异性且难以量化11,12。体外发芽血管生成测定可以精确控制实验条件，具有高重现性和精确定量，但不能完全复制体内复杂性 11,12,13。相比之下，离体发芽血管生成测定（其中主动脉环测定是应用最广泛的模型）使用生物体外的组织，在保持生理相关性的同时避免体内并发症 14,15,16。尽管在技术上具有挑战性，有时还在努力解决组织活力问题，但离体模型在复杂性和控制之间提供了宝贵的平衡，使其成为研究发芽血管生成的一种有前途的方法。虽然这些模型已被广泛用于研究发芽血管生成的分子驱动因素，但机械线索的影响和细胞的机械行为仍然知之甚少。

发芽血管生成过程中的多细胞迁移高度依赖于细胞力学，因为基于肌动球蛋白的收缩力调节内皮细胞侵袭到周围细胞外基质 17,18,19,20。具体来说，已观察到非肌肉肌球蛋白 II 马达是细胞内主要的基于肌动蛋白的收缩机器21，可在发芽血管生成过程中控制细胞收缩力22,23。领导细胞可能是发芽的主要产生力的元素，因为与领导细胞相比，领导细胞周围周围 3D 细胞外基质的变形明显更高，特别是附近富含肌动蛋白的细胞突起23,24 23,25.尽管越来越多的证据表明细胞收缩性在 3D 发芽血管生成中的重要性，但缺乏对发芽血管生成的细胞机制进行时空机械表征的方法。

本研究的总体目标是开发一种方法，允许在发芽过程中对细胞迁移进行机械表征。通过在生物学相关背景下实现机械力的时空表征，我们旨在为细胞力学如何影响血管生成芽的形成提供新的见解。为此，我们开发了一个 2.5D 模型系统，通过创建 2D 聚丙烯酰胺 （PAA） 水凝胶，在其上接种颈动脉片，并用一层薄薄的 I 型胶原蛋白凝胶覆盖，为细胞建立局部 3D 环境。多细胞芽从 PAA-胶原凝胶界面上的动脉片中迁移出来。与现有技术相比，这种方法的优势在于 2D PAA 水凝胶允许通过牵引力显微镜 （TFM） 进行分析，这是一种众所周知的多功能技术，其中细胞粘附在弹性 2D 基材上，并在细胞牵引力26 时使基材变形。可以捕获这些变形，并且可以根据基材的机械性能计算蜂窝牵引力26。通过调整 TFM 用于离体活组织，我们的目标是弥合 体外 控制和 体内 相关性之间的差距，从而更全面地了解血管生成过程中的机械力。

方案

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该方案使用猪颈动脉。猪颈动脉是从当地屠宰场获得的荷兰长白杂交猪（5-7 个月大，体重（活）80-120 公斤）收获的。这些方案符合荷兰政府（荷兰农业、自然和食品质量部）监督的 EC 法规 1069/2009 关于用于诊断和研究的屠宰场动物材料，并获得了动物福利相关法律机构（食品和消费品安全局）的批准。不需要伦理批准，因为组织是从已经被处决的动物的副产品中收获的。死亡和组织运输之间的时间为 10-25 分钟，具体取决于屠宰场。

注意: 材料表 总结了有关本协议中使用的材料、设备和试剂的详细信息。 补充文件 1 中描述了 2D 和 3D 样品的实验方案。

1. 2D 聚丙烯酰胺 （PAA） 基材的制备

  1. 在通风橱中，通过分别以 4286 μL、357 μL 和 357 μL 的 12:1:1 无水乙醇（用于合成）、乙酸和结合硅烷混合来制备结合硅烷溶液。在室温下，将 120 μL/孔结合硅烷溶液在玻璃底 12 孔板上孵育 1 小时。
    注意:无水乙醇是一种高度易燃的液体和蒸气 （H225），会引起严重的眼睛刺激 （H319）。乙酸是一种易燃液体和蒸气 （H226），会导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤 （H314）。穿戴个人防护装备并在通风橱中工作。
  2. 在通风橱中，使用喷雾瓶用无水乙醇（工业）清洗玻璃底 12 孔板 3 次。丢弃乙醇。
  3. 使用氮气干燥玻璃底 12 孔板。如果玻璃底部顶部出现白色斑点，则洗涤是不够的。重新清洗玻璃底 12 孔板。
  4. 根据 表 1 中的比例制备 PAA 凝胶混合物。
    1. 将 PBS 添加到微量离心管中，并在凝胶混合物中重悬 40% 丙烯酰胺、2% 双丙烯酰胺和荧光标记物。在凝胶制备前涡旋溶液。
    2. 尽快向溶液中加入 10% APS 和 TEMED，并在添加每种元素后涡旋。在每个孔的玻璃底部吸取 11.5 μL 凝胶混合物液滴，然后将 13 mm 盖玻片轻轻放在液滴顶部。
    3. 轻轻敲击并旋转板，使凝胶混合物均匀分布在盖玻片下。如果出现气泡，请轻轻提起盖玻片将其去除。让凝胶在室温下聚合 1 小时。使用管中剩余的凝胶混合物检查聚合。12 孔板中的聚合 PAA 凝胶将显示内晕。
      注意:丙烯酰胺吞咽或吸入有害 （H302 + H332），会引起皮肤刺激 （H315），可能引起皮肤过敏反应 （H317），会引起严重的眼睛刺激 （H319），可能导致遗传缺陷 （H340），可能导致癌症 （H350），怀疑会损害生育能力 （H361f），如果吞咽，长时间或反复接触会对器官造成损害 （H372）。APS 可能会加剧火势（氧化剂，H272），吞咽有害 （H302），引起皮肤刺激 （H315），可能引起皮肤过敏反应 （H317），引起严重的眼睛刺激 （H319），吸入可能引起过敏或哮喘症状或呼吸困难 （H334），并可能引起呼吸道刺激 （H335）。TEMED 是一种高度易燃的液体和蒸气 （H225），吞咽有害 （H302），会导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤 （H314），吸入有毒 （H331）。穿戴个人防护装备。
  5. 聚合后，向孔中加入 PBS。使用镊子和/或弯曲的针头，轻轻提起并取下盖玻片。在 PBS 中洗涤凝胶一次。
  6. 为了促进 PAA 凝胶的胶原包被，需要使用交联剂 Sulfo-SANPAH 对凝胶进行功能化。向 PAA 凝胶中加入 75 μL 溶于超纯水的 1 mg/mL Sulfo-SANPAH，并在 365 nm 紫外光下孵育 5 分钟。
    注:保持 Sulfo-SANPAH 避光，并在 UV 孵育前加入超纯水。从浅红色（紫外光孵育前）到深红色（紫外光孵育后）可见变色。
    注意:Sulfo-SANPAH 会引起严重的眼睛刺激 （H319）。
  7. 在生物安全柜中，对凝胶上的 Sulfo-SANPAH 进行快速无菌 PBS 洗涤。因此，在无菌 PBS 中洗涤功能化的 PAA 凝胶 2 次 10 分钟。
    注意:从方案中的这一点开始，所有步骤都将在无菌条件下进行。
  8. 在生物安全柜中，在冰上的 PBS 中制备 0.1 mg/mL IV 型胶原蛋白溶液。将 50 μL 0.1 mg/mL IV 型胶原液滴吸至功能化的 PAA 凝胶上，并在 4 °C 下孵育过夜。
  9. 在无菌 PBS 中洗涤凝胶 2 次。取出 PBS 并让凝胶干燥 5 分钟。
  10. 在凝胶顶部吸取 50 μL 内皮细胞生长 （ECG） 培养基液滴，并在 37 °C 和 5% CO2 下孵育至少 1 小时。
    注:在 ECG 培养基中孵育凝胶可改善细胞和组织与凝胶的粘附。

2. 制备用于运输的改性 Krebs 溶液

注意:准备新鲜的改性 Krebs 溶液。在该方案中，改性的 Krebs 溶液在组织收获前 1 天制备。

  1. 通过高压灭菌对运输瓶进行消毒。在玻璃瓶中加入所需总运输体积 （350 mL） 的 90% （315 mL） 超纯水。确保水温为 15-20 °C。
  2. 使用搅拌磁铁轻轻搅拌水，加入 9.6 g/L （3.36 g） Krebs-Henseleit 缓冲液，搅拌至溶解。使用巴斯德移液管，用少量溶液冲洗称量船，以包括溶液中的所有微量粉末。不要加热溶液。
  3. 搅拌的同时，向溶液中加入 0.373 g/L （130.55 mg） 氯化钙 （CaCl2） 并搅拌至溶解。用少量溶液冲洗称量船。
    注意:H319 会引起严重的眼睛刺激。
  4. 搅拌的同时，向溶液中加入 2.1 g/L （0.63 g） 碳酸氢钠 （NaHCO3），搅拌直至溶解。用少量溶液冲洗称量船。
  5. 搅拌的同时，向溶液中加入 1 x 10-1 mM （13.15 mg） 罂粟碱，搅拌直至溶解。用少量溶液冲洗称量船。
    注:罂粟碱是一种平滑肌松弛剂，用于防止在收获过程中因切割和处理容器而引起的过度血管收缩。
    注意:吞咽 H301 有毒。
  6. 在通风橱中，向溶液中加入 0.05 mM （1.2 μL） 2-巯基乙醇并搅拌。
    注:2-巯基乙醇用于保持低水平的氧自由基。
    注意:2-巯基乙醇吞咽或吸入有毒 （H301 + H331），与皮肤接触致命 （H310），引起皮肤刺激 （H315），可能引起皮肤过敏反应 （H317），造成严重的眼睛损伤 （H318），怀疑对未出生的孩子造成伤害 （H361d），吞咽后长期或反复接触可能对器官造成损害 （H373），对水生生物毒性很大，影响持久 （H410）。穿戴个人防护装备并在通风橱中工作。
  7. 搅拌时，添加 1 N （1 M） HCl 或 1 N （1 M） NaOH，将 pH 值调节至 7.2。最终 pH 目标是 7.4，但在过滤过程中，pH 值可能会上升 0.1-0.3 个 pH 单位。
    注意:HCl 含有加压气体;加热时可能爆炸 （H280），导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤 （H314），吸入有毒 （H331）。穿戴个人防护装备。
  8. 继续在生物安全柜中工作。加入 10% 超纯水，使溶液达到最终体积。
  9. 使用孔隙率为 0.22 μm 的膜过滤，立即对溶液进行消毒。将无菌溶液直接分配到无菌瓶中。向溶液中加入 7 mL 2% 青霉素/链肌蛋白 （P/S）。
    注:在运输过程中，向培养基中加入 2% P/S 以去除所有细菌。在组织培养过程中，向培养基中加入 1% P/S。
  10. 将改性的 Krebs 溶液储存在 4 °C 直至组织收获。

3. 组织采集

  1. 根据屠宰场的不同，通过电击或 CO2 将猪击晕。随后，将猪吊在后肢上，放血，然后宣布死亡。
  2. 在进入干净的屠宰过程之前，将猪烫伤以脱毛，烧毛以去除最后一根毛，并对胴体外部进行消毒。
  3. 沿着腹部做一个中线切口，小心地去除内脏，将猪的内脏去除。根据屠宰场的不同，颈动脉仍然附着在猪的尸体上，或者颈动脉已经通过胸部器官的拔除从尸体中取出。
  4. 使用锋利的刀，从胴体或喉咙区域组织中收获颈动脉和一些剩余的周围组织，而无需接触动脉或施加机械应力。
  5. 短暂打开瓶子，将含有颈动脉的组织放入含有无菌改良 Krebs 溶液的运输瓶中。将瓶子倒置一次，以确保整个组织都被 Krebs 溶液覆盖。将冰上的组织运送到实验室。运输大约需要 30-45 分钟。

4. 组织解剖

  1. 通过高压灭菌对解剖设备手术镊子（粗略处理）、环氧树脂涂层圆尖镊子（精细处理）、手术刀、平夹和盖玻片进行消毒。
  2. 在组织收获/运输之前准备生物安全柜。用手术单覆盖解剖区域。安装解剖设备（在无菌 50 mL 管中）、手术刀片和无菌盖玻片。用无菌 PBS 填充两个大培养皿以准备解剖盘。将组织培养物在一个小培养皿中与 ECG 培养基在 37 °C 下孵育。
  3. 组织运输后，在生物安全柜内，使用手术镊子将颈动脉从运输瓶（装满改良的 Krebs 溶液）转移到装有无菌 PBS 的大培养皿中。
  4. 使用手术镊子和手术刀去除颈动脉周围的多余组织，以清晰地看到颈动脉。
  5. 用手术刀切割，从颈动脉两端去除 2-3 cm，以消除靠近动脉分叉的区域。使用细圆头镊子去除颈动脉周围的动脉筋膜。
    注意:更新手术刀刀片有助于更精确地切割筋膜。
  6. 将颈动脉转移到装满无菌 PBS 的新大培养皿中。尽可能去除动脉筋膜的剩余薄层。
    注意:颈动脉在 PBS 中停留的时间越长，筋膜松动的碎片就越多。切除筋膜很重要，因为它会在显微镜检查期间阻碍视力。
  7. 将干净的颈动脉切成约 2 毫米宽的环。将颈动脉环转移到装有ECG培养基的预热小培养皿中，并保持在37°C。

5. 组织接种

注:通过添加无盖玻片、无菌未处理的盖玻片或无菌 pluronic 处理的盖玻片（PBS 中的 1% w/v pluronic，盖玻片孵育过夜并在使用前用无菌超纯水洗涤）来测试组织附着在 PAA 水凝胶上接种后在动脉片顶部。

  1. 从凝胶中去除 ECG 培养基液滴。将颈动脉环转移到装有无菌 PBS 的干净培养基培养皿中。
  2. 使用圆头镊子和手术刀将戒指切成两半。将半个环切成约 2 mm 宽的片材，以创建尺寸为 2 x 2 mm 的动脉片材。注意动脉片内皮侧的方向。动脉片的曲率和一些剩余的筋膜可能有助于确定这个方向。
    注意:颈动脉环的大小可能会有所不同。大环大约有 6-8 张，而小环有 3-4 张。由于动脉片中的曲率较小，大环的附着性增强。
  3. 使用圆头镊子，抓住片材背面（血管壁外侧）的动脉片，将片材放在 PAA 凝胶的边缘，内皮内衬朝向 PAA 基材，以避免在放置片材时损坏 PAA 基材。
  4. 使用镊子或钳子，将动脉片非常轻柔地移动到 PAA 水凝胶的中心，不要接触凝胶。将动脉片放在凝胶的边缘（组织可能会粘在镊子或钳子上）。
    注意:血管壁外侧的动脉筋膜小残留物为抓住动脉片创造了一个容易的手柄，而血管壁的内皮内衬非常光滑。
  5. 在放置在 PAA 底物上的动脉片顶部添加 50 μL ECG 培养基。Ty 将 ECG 培养基液滴保持在凝胶顶部。
  6. 使用圆头镊子，将干燥的 13 mm 盖玻片放在培养基中 PAA 基材上的动脉片顶部。使用玻璃底部的内缘轻轻降低盖玻片，直到它接触到培养基液滴并且培养基在其下方扩散。
    注意:13 mm 盖玻片是有利的，因为它们与玻璃底孔板内壁的尺寸紧密匹配。如果过快降低盖玻片，组织将移动到盖玻片的边缘。
  7. 让组织在 37 °C 和 5% CO2 下附着 5 小时，然后向每个孔中加入 1 mL ECG 培养基。将动脉片放在 37 °C 和 5% CO2 的 PAA 基材上 24 小时。

6. 创建 2.5D 模型

  1. 高压灭菌圆尖镊子以去除盖玻片。在超纯水中制备 1 M NaOH，通过 0.22 μm 孔径过滤器过滤灭菌，并在 4 °C 下储存。
    注意:1 M NaOH 可以在未来的实验中重复使用。
  2. 使用尖端弯曲的无菌锋利针头，非常轻柔地从动脉片上提起 13 mm 盖玻片，然后取下盖玻片。使用玻璃底的内环作为支撑来提起和取下盖玻片。任何侧向移动都会增加动脉片与 PAA 基质脱离的风险。
  3. 在无菌微量离心管中，根据 表 2 在冰上制备 I 型胶原蛋白混合物。向溶液中加入 I 型胶原和 NaOH 后，充分重悬并倒置试管一次，以确保混合物均匀混合。
    注意:在混合物中加入 I 型胶原蛋白后，浅粉红色的混合物会变成无色。添加 NaOH 后，无色混合物变成浅粉红色。
  4. 使用真空抽吸系统从孔中取出介质。在不接触组织的情况下，尽可能多地去除组织周围的培养基。
    注意:动脉片周围过多的介质会阻止 I 型胶原凝胶围绕它。
  5. 在每个动脉片的顶部加入 10 μL I 型胶原凝胶混合物液滴，并将 I 型胶原凝胶在 37 °C 和 5% CO2 下聚合 1 小时。
  6. 非常轻柔地向每个孔中加入 1 mL 预热的 ECG 培养基，并将样品置于 37 °C 和 5% CO2 中。

7. 活细胞成像

注:使用配备热、CO2 和湿度控制并使用 Leica 或 NIS 软件控制的 Leica DMi8 或 Nikon Ti2 Eclipse 落射荧光显微镜进行活细胞成像。自适应对焦控制 （Leica） 和完美对焦系统 （Nikon） 用于及时保持对焦。

  1. 在 2.5D 系统中培养 24 小时后，检查发芽血管生成。一些动脉片在培养 24 小时后已经开始形成细胞芽，而其他片材需要更多时间才能开始内皮发芽。
  2. 如果已开始发芽血管生成，请刷新 ECG 培养基并将 12 孔板放入显微镜的 37 °C 预热孵育箱内的载物台支架中。
  3. 选择感兴趣的目标。本研究使用了不同的物镜，使用 10 倍物镜创建细胞芽形成的全局概览，使用 20 倍物镜进行全聚焦方式 （TFM）。
  4. 定义感兴趣的通道。为了实现全聚焦方式 （TFM） 目的，使用相差观察细胞芽，并使用波长为 660 nm 的荧光通道观察 PAA 衬底中的荧光标记物（深红色）。
  5. 选择（多个）感兴趣的区域并找到焦点平面。打开对焦系统（Leica DMi8 的自适应对焦控制或 Nikon Ti2 Eclipse 的完美对焦系统）以确保在延时摄影成像过程中稳定对焦。
  6. 通过选择时间间隔和延时摄影长度来定义感兴趣的延时摄影。在本研究中，不同的时间间隔 （5-20 min） 和延时长度 （4-24 h） 用于不同的目的。
  7. 对于 TFM 目的，延时成像后，通过在超纯水中加入几滴 5% SDS 来去除生长的细胞，并等待几分钟。对于每个选定的位置，取 PAA 衬底中荧光标记物的 z 堆栈（2 μm 的 z 高度定义为 0.2 μm），以获得荧光标记物的松弛状态作为参考图像。
    注:进行 Z 堆栈成像是因为细胞可能会沿 z 方向拉动或推动荧光标记物。

8. 牵引力显微镜分析

  1. 相对于最佳参考图像对齐和裁剪延时图像，以进行精确分析。
  2. 要测量 PAA 水凝胶中荧光标记物的位移，请使用定制的 MatLab 代码在任何延时图像和参考图像之间执行粒子图像测速 （PIV）。在 PIV 分析中，将图像划分为 32 x 32 像素的询问窗口，重叠 0.5 个。
  3. 使用 Boussinesq 方程27，通过基于傅里叶变换的牵引显微镜对具有有限凝胶厚度的无限凝胶计算荧光标记物位移的牵引力。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过所描述的方案，我们可以在覆盖有一层薄薄的 I 型胶原蛋白凝胶的 2D PAA 水凝胶上从猪颈动脉诱导 离体 发芽血管生成，从而创建一个 2.5D 离体 发芽血管生成模型。该模型使我们能够执行常规的TFM，并在空间和时间上测量PAA凝胶界面上发芽血管生成的细胞牵引力。

为了建立 2.5D 模型，我们首先制备了嵌入荧光标记物的 2D 聚丙烯酰胺 （PAA） 水凝胶，然后用 IV 型胶原蛋白 （d-1 至 d0） 过夜包被。在第 0 天 （d0），将颈动脉片放置在胶原 IV 包被的水凝胶上，并使其附着过夜 （d0 至 d1）。随后，在动脉片上涂上一层薄薄的 I 型胶原凝胶，然后在第 1 天 （d1） 开始成像以监测细胞发芽并跟踪荧光标志物以进行机械分析 （d1 至 d2）。为了验证 2.5D 模型中的发芽血管生成，我们在 3D I 型胶原凝胶中并行进行了常规的离体发芽血管生成。为此，制备了一层薄薄的 I 型胶原蛋白凝胶，然后接种颈动脉膜，随后覆盖额外的胶原蛋白层 （d0）。随着时间的推移监测血管生成发芽。此外，我们努力在 2D 中诱导发芽血管生成，以进一步降低模型复杂性。实验程序与 2.5D 模型的实验程序相同，主要区别在于排除了顶部胶原蛋白 I 型凝胶层。图 1 描述了这三种模型的概述，包括它们的实验程序。从当地屠宰场的猪身上采集颈动脉，并在无菌新鲜克雷布斯溶液中运输。在生物安全柜内，去除了颈动脉周围的过多组织，以确保在实时延时成像期间不会因发芽血管生成而造成视觉障碍（图 2A-E）。一旦动脉从过多的组织上清除，将动脉切成 2 毫米宽的动脉环，然后将环切成尺寸为 2 x 2 毫米的动脉片（图 2F）。

为了确保在 2.5D 和 2D 模型中 PAA 水凝胶界面顶部发芽血管生成，我们将动脉片接种，内部内皮细胞侧面向 IV 型胶原包被的 PAA 水凝胶，并让它们附着。为了优化动脉片与 PAA 水凝胶的附着，我们测试了在动脉片顶部添加防污涂层 12 mm 玻璃盖玻片的效果。24 小时后，取下盖玻片，并通过附着在 PAA 水凝胶上的动脉片的百分比来测量附着效率。我们观察到，与没有盖玻片相比，添加玻璃盖玻片 - 独立于防污涂层 - 提高了动脉片在 PAA 水凝胶顶部的附着效率（图 3A-D）。接下来，我们测试了玻璃盖玻片直径（12 或 13 毫米）对动脉片附着效率的影响，而板的内孔为 14 毫米。我们观察到，与 12 mm 盖玻片相比，13 mm 盖玻片提高了动脉片在 PAA 水凝胶顶部的附着效率（图 3E-G），因为盖玻片去除过程中的剪切力最小。在 2.5D 和 2D 模型中，我们继续使用未经处理的 13 mm 盖玻片将动脉片附着到 PAA 水凝胶上。

将动脉片附着到 PAA 水凝胶上后，我们在动脉片顶部添加了一层薄薄的 I 型胶原蛋白凝胶，以创建 2.5D 环境。我们将样品培养 5 天，并检查样品的发芽血管生成情况。我们在 3D 模型中观察到细胞芽的形成（图 4A），与文献中先前报道的离体发芽血管生成一致 28,29,30。在 2.5D 模型中，与 3D 模型相比，我们观察到细胞芽的组织相似（图 4B）。细胞芽在多个高度形成（视频 1），包括在 PAA 界面处。此外，发芽血管生成的特征是前导细胞和追随细胞的高度增殖，我们在 2.5D 模型中发芽期间观察到了这种现象（视频 2）。当在 2D 中培养动脉片时，来自不同来源的细胞（补充图 1）以单层形式从组织中迁移出来，因此缺乏细胞芽的组织（图 4C）。由于我们没有在 2D 模型中观察到发芽血管生成，因此我们从后续分析中排除了该模型。总而言之，动脉片需要一个局部 3D 环境来诱导发芽血管生成，显示了发芽血管生成的 2.5D 离体模型的潜力。

此外，2.5D 模型系统是一个多功能系统，允许用户检查来自细胞微环境的机械线索的影响，例如基质刚度。3D I 型胶原水凝胶（通常用于离体发芽血管生成的水凝胶）的基质刚度取决于 ECM 蛋白的浓度，其中蛋白质浓度的增加与基质刚度的增加相关32。使这种 3D 水凝胶诱导发芽血管生成的 I 型胶原蛋白浓度的典型范围为 1-4 mg/mL，对应于 1 Pa 至 1 kPa 的基质刚度 32,33,34。较低浓度可能太软而无法提供结构支撑，而较高浓度会抑制细胞运动。内皮组织的生理刚度为 1 kPa35，可以用 3D I 型胶原水凝胶模拟。然而，肿瘤的形成和进展与组织硬化4 有关，因此强调需要一个可以实现更高基质刚度的模型来研究肿瘤血管生成。PAA 水凝胶的基质刚度 - 动脉片内皮细胞感应的刚度 - 可以很容易地在 1 到 10 kPa 的范围内进行调整。在这里，我们通过在添加 I 型胶原蛋白层后第二天开始形成细胞芽的样品百分比来检查 PAA 基材刚度对发芽血管生成开始的影响。我们观察到，与病理性硬质 （12 kPa） PAA 水凝胶相比，在生理软 （1 kPa） PAA 水凝胶上培养时，更多的动脉片显示出细胞芽的早期迹象（图 5），显示了该模型研究基质刚度对发芽血管生成影响的潜力。除了可调节的底物刚度外，这些底物还允许系统地调节其他机械线索（例如，基质组成和密度）以及化学线索（例如，通过调节培养基来抑制分子调节剂），证明了这种 2.5D 离体发芽血管生成模型的多功能性。

为了量化发芽血管生成的细胞力学，我们对在 2D PAA 界面上形成的细胞芽进行了常规的牵引力显微镜 （TFM）。添加 I 型胶原层后一天，我们对细胞（图 6A）和嵌入 PAA 水凝胶中的荧光标记物进行了活细胞成像。使用粒子图像测速法测量荧光标记物的位移（图 6B），并使用 PAA 水凝胶的机械特性计算细胞牵引力（图 6C）。使用这个 2.5D 离体 模型，我们最初观察到细胞芽前导细胞突起处的拉力，然后是沿细胞芽的推力 - 在前导细胞的后部以及追随细胞（图 6C）。

figure-results-1
图 1: 实验模型和程序。 （左）测试的实验模型。2.5D 模型表示放置在扁平的 IV 型胶原蛋白包被聚丙烯酰胺 （PAA） 水凝胶上的动脉片，并覆盖有一层薄薄的 I 型胶原蛋白水凝胶。3D 模型代表了夹在两层 I 型胶原凝胶之间的动脉片，该系统已知可诱导发芽血管生成36。2D 模型表示放置在扁平胶原蛋白 IV 型涂层 PAA 水凝胶顶部的动脉片。（右）相应模型的实验程序。对于 2D 和 2.5D 模型，在接种前一天 （d-1） 制备 PAA 水凝胶，并在过夜进行 IV 型胶原蛋白涂层。从猪身上收获颈动脉，解剖成动脉片，在第 0 天 （d0） 接种在水凝胶上，并放置过夜 （d1）。对于 2.5D 样品，在动脉片顶部放置一层薄薄的 I 型胶原凝胶。在第 2 天 （d2） 发芽开始后进行机械分析。对于 2D 样品，在第 1 天 （d1） 刷新培养基。对于 3D 模型，在第 0 天 （d0） 接种前准备了一层 I 型胶原凝胶。动脉片接种在 I 型胶原蛋白层的顶部，并覆盖有第二层 I 型胶原蛋白。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-2
图 2:颈动脉夹层步骤 （d0）。 （A） 从当地屠宰场的猪身上采集了约 10 厘米长的颈动脉。（B） 丢弃过多的组织和大约 2 cm 的边缘（为避免太靠近分支点，（B'）。（C-E）对颈动脉进行去皮 （C），浸泡在 PBS 中 （D），并对所有剩余组织进行去皮，以确保成像过程中的清晰可见度 （E）。（F） 将干净的颈动脉切成宽度约为 2 毫米的动脉环。每个环被切割成 4 块尺寸约为 2 x 2 毫米的动脉片。 请点击此处查看此图的较大版本。

figure-results-3
图 3:使用 13 mm 玻璃盖玻片 （d1） 提高动脉片附着效率。 （A-D） 玻璃盖玻片对动脉片附着聚丙烯酰胺 （PAA） 水凝胶的影响。对无玻璃盖玻片 （A）、未经处理的玻璃盖玻片 （B） 和使用 Pluronic F127 （C） 的防污涂层玻璃盖玻片进行了比较。附着效率是通过去除盖玻片后附着在 PAA 水凝胶上的动脉片数量与样品总数的比较来测量的:无盖玻片（36 个中的 4 个）、未处理的盖玻片（36 个中的 10 个）和防污涂层盖玻片（36 个中的 9 个;（EG） 未经处理的玻璃盖玻片的大小对动脉片与 PAA 水凝胶附着的影响。在 14 mm 孔内，对未经处理的 12 mm 玻璃盖玻片 （E） 和未经处理的 13 mm 玻璃盖玻片 （F） 进行了比较。通过去除盖玻片后附着在 PAA 水凝胶上的动脉片数量与样品总数的比较来测量附着效率:12 mm 盖玻片（36 个中的 10 个）和 13 mm 盖玻片（72 个中的 52 个; 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-4
图 4:模型的维数定义了细胞生长 （d2+） 期间的组织。 在 3D 模型（左）中，细胞以发芽组织的形式从组织中迁移出来，类似于 2.5D 模型（中）。细胞在 2D 设置中以单层组织形式从组织中迁移出来（右）。比例尺代表 250 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-5
图 5:2.5D 模型中内皮发芽的开始取决于聚丙烯酰胺水凝胶基质刚度 （d2）。 （A-B）在方案的第 2 天（添加层胶原蛋白 I 型凝胶后 1 天），动脉片在软 （A;1 kPa） 或硬 （B;12 kPa） 聚丙烯酰胺 （PAA） 水凝胶上覆盖有一层薄薄的 I 型胶原蛋白凝胶。（C） 发芽开始是通过已经显示出细胞生长迹象的动脉片数量与样本总数的对比来衡量的:软（24 个中的 7 个）和僵硬（24 个中的 3 个）。比例尺表示 1 毫米 （A， B） 或 500 微米 （A'， B'）。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-6
图 6:早期发芽血管生成过程中的牵引力表征。 时间 （0-4 h） 的成像细胞显示在顶行。1 kPa PAA 水凝胶底物上相应的荧光标志物位移 （0-2 μm） 和细胞牵引力 （0-50 Pa） 分别显示在中间行和底行。细胞牵引在 0 小时、2 小时和 4 小时的放大显示为橙色。 请单击此处查看此图的较大版本。

figure-results-7
图 7:2.5D 离体 发芽血管生成模型方法，允许对细胞芽进行机械表征。 请单击此处查看此图的较大版本。

1 千帕斯卡12 千帕斯卡
PBS 系列435 微升373.7 微升
40% 丙烯酰胺50 微升93.8 微升
2% 双丙烯酰胺7.5 微升25 微升
荧光标记物（深红色）5 微升5 微升
10% APS2.5 微升2.5 微升
特梅德0.25 微升0.25 微升

表 1: PAA 凝胶混合物比率。

公式每 12 孔板的体积 （130 μL）
ECG 培养基V心电图=Vfinal-V col1-V NaOH82.16 微升
I 型胶原蛋白Vcol1=（Vfinal*Cfinal）/C库存46 微升
氢氧化钠VNaOH=0.04*Vcol11.84 微升

表 2: I 型胶原凝胶混合物体积使用体积 （V） 和浓度 （C） 的缩写。

视频 1:2.5D 模型中细胞芽形成的延时成像。 使用相差成像在 22 小时内对细胞进行成像，时间间隔为 17.5 分钟。通过不同的焦平面观察到，细胞芽在 I 型胶原凝胶层内的多个高度上形成。比例尺代表 100 μm。 请单击此处下载此视频。

视频 2:2.5D 模型中细胞芽内细胞的高增殖率。 使用相差成像对细胞进行 22 小时的成像，时间间隔为 17.5 分钟。在延时成像过程中，前导细胞和跟随细胞都会增殖。比例尺代表 100 μm。 请单击此处下载此视频。

补充 图 1:免疫荧光染色 2D 模型 （d2+） 中的细胞表型。 （A） 细胞核 （DAPI）、内皮细胞标志物 （CD31） 和成纤维细胞标志物（α-平滑肌肌动蛋白;α-SMA）的免疫荧光 （IF） 染色。（B） 细胞核 （DAPI）、内皮细胞标志物 （CD31） 和平滑肌细胞标志物（钙调蛋白）的 IF 染色。比例尺代表 100 μm。请单击此处下载此图。

补充文件 1:免疫荧光染色方案。 请点击此处下载此文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

发芽血管生成 - 新血管的形成 - 是一个受分子和机械机制调节的复杂过程。虽然在过去几十年中已经开发了许多 3D 模型来研究发芽血管生成的分子驱动因素（例如，VEGF 和 Notch 信号传导），但由于模型限制，人们对细胞力学知之甚少。牵引力显微镜 （TFM） 是一种众所周知的技术，用于量化空间和时间上的细胞力，其中 2D 基材变形转化为细胞牵引力。因此，在该协议中，我们描述了一个 2.5D 离体模型，这意味着我们在本地为细胞提供 3D 环境，同时保留了 2D 模型的简单性，允许量化发芽血管生成过程中的牵引力（图 1）。为此，我们准备并接种了猪动脉片（内皮面朝下;图 2）在含有荧光标记物的 IV 型胶原包被聚丙烯酰胺 （PAA） 水凝胶的顶部。使用 13 毫米玻璃盖玻片连接动脉片后（图 3），我们添加一层薄薄的 I 型胶原蛋白水凝胶，允许形成细胞芽（图 4）。使用这个模型，我们表明在细胞发芽 22,23,24,25 期间，前导细胞施加拉力（如文献 19,20,21,22 中观察到的），但也使追随细胞施加推力（图 6).通过我们的协议获得的牵引场分辨率允许对时间和空间上的细胞运动学和动力学进行定量分析，这是在柔和基材 37,38,39 上采用牵引力显微镜的典型工作。

此外，我们通过改变微环境的机械线索证明了这种 2.5D 离体 发芽血管生成的多功能性（图 5）。虽然发芽血管生成通常发生在 1 kPa35 的生理刚度下 - 这可以通过 3D I 型胶原水凝胶来模拟，但肿瘤血管生成发生在僵硬的微环境中40 - 这超出了传统 3D I 型胶原水凝胶的刚度范围。通过改变交联剂的比例，可以很容易地调整 PAA 基材刚度，从而产生更高的基材刚度。使用这个模型，我们揭示了发芽血管生成的开始是刚性依赖性的。这些基材不仅提供可调的刚度，而且还能够系统地调制各种其他机械线索，例如基体组成和密度。此外，该模型允许我们研究细胞力学，同时使用培养基的调节来纵分子调节因子（例如，抑制对 Notch 信号传导对细胞力学的影响），以了解发芽血管生成的机械生物学机制。这证明了这种在不同微环境样本中发芽血管生成的 2.5D 离体 模型的实用性。

我们介绍的模型利用了传统的二维TFM，与3D（粘弹性）TFM相比，这种方式分析更简单，空间分辨率更高，实施起来也更容易，因此更容易获得和成本效益26,41。然而，3D（粘弹性）TFM 通过捕获所有三个维度的牵引力并考虑细胞外基质的复杂机械特性，提供了更具生理相关性的环境，从而在更真实的环境中更深入地了解细胞行为 42,43,44,45.这种维度效应也指向了这个 2.5D 模型的局限性。我们使用二维全聚焦方式（TFM）的假设是，电池在二维衬底上迁移。虽然在这个 2.5D 模型中是这种情况，但细胞处于局部 3D 环境中，因此粘附在 I 型胶原凝胶层上并在该凝胶层中施加力。我们在此分析中采用的假设是，由于基质刚度的数量级差异，I 型胶原凝胶层没有机械耦合（这两个水凝胶之间没有力传递）到 PAA 界面，因此，最大限度地减少了细胞力对 I 型胶原层的影响。这使得使用 2.5D 离体模型的力表征成为细胞产生的力的简化表示。此外，该方案需要精确性，并且涉及多个可能丢失样品的步骤，例如 （i） 由于动脉片周围组织过多而导致的细胞可见困难（图 2），（ii） 三分之一的样品没有附着在 PAA 底物上（图 3），（iii） 并非所有样品都会引发细胞芽的形成（图 5），（iv） 细胞芽不会在 PAA 基材上形成，以及 （v） 在低刚度 PAA 水凝胶上使用厚动脉片时出现离焦荧光标记物。因此，我们针对 12 孔板优化了这种方法，以确保有大量感兴趣的区域来对发芽血管生成进行机械分析。

总之，使用 2.5D 模型（图 7）简化表征活猪动脉片发芽血管生成的细胞牵引力的方法有助于更准确和实时地了解天然组织环境中血管生成过程中的机械相互作用，与全 3D 系统相比，有助于以更低的复杂性和更高的可重复性研究动态细胞过程。这可以增强我们对细胞如何在更具生理相关性的环境中对机械线索做出反应的理解，同时保持 2D 方法的分析简单性。这些知识可以推动组织工程领域的发展，目的是创造血管，同时也可以寻找预防肿瘤血管生成的治疗药物，以限制肿瘤生长和减少转移。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有需要披露的利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 LifeTec 的员工从当地屠宰场采集和运输猪颈动脉;Leon Hermans、Pim van den Bersselaar 和 Adrià Villacrosa Ribas （TU/e， ICMS） 就实验程序和机械特性分析进行了富有成效的讨论。我们衷心感谢欧洲研究委员会 （771168）、荷兰科学研究组织 （024.003.013）、芬兰科学院（307133、316882、330411 和 337531）以及 Åbo Akademi 大学基金会的细胞机械平衡卓越中心 （CellMech） 的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2% 双丙烯酰胺Bio-Rad1610143
2-巯基乙醇默克生命科学60-24-2
3-（三甲氧基甲硅烷基）甲基丙烯酸丙酯结合-硅烷Sigma-Aldrich440159-100ML
40% 丙烯酰胺Bio-Rad1610140
Abslutute 乙醇（用于分析）VWR International1.00983.1000
无水乙醇（工业）VWR International83813.41
冰醋酸 100%默克1000562500
过硫酸铵APSBio-Rad7727-54-0
抗体（一抗） - 钙调蛋白Abcamab46794
抗体（一抗） - CD31SerotecMCA1746
抗体（一抗） - α-平滑肌肌动蛋白&α;SMADakoM0851
抗体（二抗） - 山羊抗小鼠 IgG1 Alexa 488分子探针A21121
抗体（二抗） - 山羊抗小鼠 IgG2a Alexa 555分子探针A21137
抗体（二抗） - 山羊抗兔 IgG Alexa 555分子探针A21428
高压灭菌Astell
氯化钙二水合CaCl2Calbiochem208291-250GM
I 型胶原蛋白，鼠尾康宁354236
IV 型胶原蛋白，人胎盘默克生命科学C5533-5MG
内皮细胞生长培养基心电图培养基PromocellC-22111
涂有环氧树脂的圆尖镊子细镊子Rubis PinzetteE78144-2A
荧光标记物，深红色InvitrogenF8807
玻璃盖玻片，Ø13 mm，#1EprediaCB00130RA120MNZ0
玻璃盖玻片和 Oslash;13 mm，#1.5EprediaCB00120RAC20MNZ0
盐酸，25%HClMerck1.100316.1000
Krebs-Henseleit 缓冲液Sigma-AldrichK3753
显微镜，Leica Application Suite X 软件，版本 3.5.7.23225Leica 显微系统
显微镜，Leica DMi8 落射荧光显微镜Leica 显微系统
显微镜， 尼康 Ti2 Eclipse尼康
显微镜， NIS-Elements AR 软件尼康
N，N，N'，N'-四甲基乙烷-1,2-二胺TEMED默克生命科学110-18-9
Nalgene 瓶Thermo Scientific2187-0016
针，21Gx1"Henke Sass WolfHK4710008025
正常血清，山羊Gibco10098792
酸罂粟碱Sigma61-25-6
青霉素/链肌蛋白 （10 000 U/mL）P/SGibco15140163
培养皿，大 （145x20 mm）Greiner Bio-one639160
培养皿，小 （60x15 mm）Greiner Bio-one628160
磷酸盐缓冲盐水PBSSigmaP4417
Pluronic F-127Merck Life ScienceP2443-250G
穿刺针，尖锐闭合尖端未知
手术刀，4Swann-Morton
碳酸氢钠NaHCO3VWR International144-55-8
磺基琥珀酰亚胺 6-（4'-叠氮基-2'-硝基苯氨基）己酸酯磺基-SANPAHThermo Scientific22589
手术刀片，20号 Swann-Morton
手术单片对开式单2775001
手术镊Lettix400024
Triton X-100Merck9036-19-5
紫外线灯Analytik 耶拿95-0042-13 
孔板，96 孔，F 底Greiner Bio-one655180
孔板，玻璃底 12 孔MatTekP12G-0-14-F
器 物 盐 号

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