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评估小胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬作用 体外 在重复磁刺激下

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DOI：

10.3791/67642

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2025年6月17日

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1Department of Rehabilitation Medicine, The Affiliated Suzhou Hospital of Nanjing Medical University, 2Rehabilitation Medicine Center, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, 3Department of Children's Rehabilitation, Linyi People's Hospital, 4Department of Endocrinology, People's Hospital of Dongxihu District, 5Department of Rehabilitation, Hengyang Medical School, The First Affiliated Hospital, University of South China

通讯作者： Qi Wu <wuqi87@126.com>

本文内容

摘要

本实验方案旨在评估重复性磁刺激对小胶质细胞吞噬髓鞘碎片能力的影响。 体外 已建立小胶质细胞与髓鞘碎片共培养系统以实现该目的。

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻吞噬细胞，通过清除受损细胞、细胞碎片和髓鞘残余物，在维持CNS完整性和稳态中发挥关键作用。髓鞘残余物的积聚与多种CNS疾病相关，包括多发性硬化症、阿尔茨海默病、创伤性脑损伤和脊髓损伤。髓鞘残余物的存在不仅加剧神经炎症，还阻碍髓鞘的再生潜力。因此，增强小胶质细胞通过吞噬作用清除髓鞘残余物的能力，是一种有前景的治疗策略。磁刺激作为一种治疗CNS疾病的创新手段，越来越多的证据表明其具有促进小胶质细胞吞噬功能并支持CNS恢复的潜力。为进一步阐明磁刺激对小胶质细胞清除髓鞘残余物的影响，我们设计了一项 体外 涉及小胶质细胞与髓鞘碎片共培养的实验。通过重复磁刺激处理该共培养体系，以评估其在中枢神经系统病理背景下对小胶质细胞吞噬活性的影响。

引言

髓鞘是由中枢神经系统（CNS）中的少突胶质细胞产生的稳定管状膜结构，包裹在轴突周围。这种髓鞘在促进动作电位快速高效传导方面起着关键作用1。然而，多种神经系统疾病，如多发性硬化症（MS）、脑卒中以及创伤性损伤（包括脊髓损伤（SCI）和创伤性脑损伤（TBI）），可导致髓鞘完整性的丧失。这会因髓鞘结构的破坏和髓鞘的直接损伤而产生髓鞘碎片2,3,4。髓鞘碎片的积聚不仅阻碍再髓鞘化和功能恢复，还会加剧神经炎症5,6。因此，在神经系统疾病发生后，有效清除髓鞘碎片对于缓解神经炎症、促进轴突再生以及恢复神经系统的稳态至关重要。

髓鞘碎片主要由吞噬细胞清除，例如中枢神经系统（CNS）中的巨噬细胞和小胶质细胞。小胶质细胞是CNS的常驻免疫细胞，持续监视其周围环境中的潜在威胁，并通过清除受损的髓鞘及髓鞘碎片来保护中枢神经系统。此外，小胶质细胞的吞噬作用在通过清除碎片促进神经发生方面发挥着关键作用7,8。越来越多的证据表明，增强小胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬能力，可减轻炎症的有害影响，减少中枢神经系统损伤，并在神经损伤后促进轴突再生4,9,10。

磁刺激疗法是一种非侵入性的神经调节技术，已广泛应用于多种神经系统疾病的治疗11。其中，重复经颅磁刺激（rTMS）在阿尔茨海默病（AD）、脑损伤和中风的治疗中展现出良好的应用前景12,13,14。最近一项研究表明，rTMS可增强小胶质细胞对β-淀粉样蛋白（Aβ）和载脂蛋白E（ApoE）的吞噬作用，从而在动物模型中抑制AD的病理进展15。同样，我们近期的研究发现，重复经脊髓磁刺激（rTSMS）可促进大鼠脊髓损伤后小胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬16。

然而，重复性磁刺激对小胶质细胞的影响主要通过动物实验模型得到证实17,18,19事实上，磁刺激已被证明可通过诱导电流来调节神经元兴奋性20因此，不容忽视的是，神经元与小胶质细胞之间的相互作用可能影响小胶质细胞的功能。因此， 体外 有必要开展实验以确定磁刺激对小胶质细胞的影响是否独立于神经元兴奋性的改变。近期研究已在实验模型中发现重复性磁刺激对小胶质细胞具有调节作用。部分研究表明，重复性磁刺激可促进小胶质细胞向M2表型极化19,21然而，其在小胶质细胞功能方面的研究仍有待进一步阐明。值得注意的是，Amelie Eichler 等人利用 10 Hz 磁刺激对体外脑组织切片进行干预，发现 10 Hz 磁刺激能够促进小胶质细胞释放细胞因子，从而影响神经元的兴奋性与可塑性22尽管本研究拓展了对磁刺激作用于小胶质细胞效应的认识，但仍需在细胞水平上进一步研究，以全面阐明其作用机制。

因此，我们建立了一种方案，以验证磁刺激是否能够促进髓鞘碎片的吞噬作用 体外与疾病或组织损伤后产生的髓鞘碎片（损伤产物）不同，本实验中使用的髓鞘碎片是髓鞘降解后形成的结构。此外，髓鞘碎片这一概念源于髓鞘的崩解产物。作为大脑主要的吞噬细胞，小胶质细胞在清除受损细胞和髓鞘碎片过程中发挥关键作用23，这与多发性硬化症和阿尔茨海默病等疾病相关24,25髓鞘碎片的积聚已被证实会加剧神经炎症并阻碍再生26本研究旨在探讨磁刺激增强小胶质细胞对髓鞘碎片吞噬作用的潜力，从而减轻神经炎症，并促进神经退行性疾病及创伤性神经系统损伤后的中枢神经系统恢复。简而言之，本研究采用共培养方法，将小胶质细胞与髓鞘碎片共培养，并施加重复磁刺激，以验证重复磁刺激对小胶质细胞吞噬能力的影响。

方案

本实验采用三只 SD 雌性大鼠（年龄 2–3 周）通过蔗糖梯度离心法提取髓鞘碎片。所有大鼠均购自中国南京医科大学实验动物中心（动物许可证：SYXK（苏）2021-0023）。所有大鼠均在对照条件下饲养（温度 22 ± 2 °C，12 小时光照/12 小时黑暗循环，相对湿度 55% ± 5%）。所有动物实验均经南京医科大学动物护理与使用委员会批准（编号：IACUC-1903031 和编号：IACUC-2005001），并旨在尽量减少动物痛苦及使用数量。

1. 髓鞘的分离

注意：髓鞘碎片的提取方法如先前所述，并做了一些修改27。确保所有步骤均在 4 °C 下进行，并保持无菌条件。

  1. 粗髓鞘的分离
    1. 脑组织提取
      1. 使用戊巴比妥（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉后，通过夹趾反应评估麻醉深度。将雌性大鼠断头，在冰上解剖头部，用剪刀切开颅骨，充分暴露脑组织，以便完整取出脑组织。
      2. 使用剪刀和镊子仔细且无菌地切除脑膜、小脑和海马体，以防止脑组织蔗糖混合物受到污染。用 PBS 清洗脑组织 3 次，以去除残留的血液或其他组织。
      3. 将清洗后的脑组织转移至 10 mL 0.32 M 无菌蔗糖溶液中，用显微外科剪将脑组织剪成 5 mm3 的小块，得到脑组织蔗糖混合物。
    2. 脑组织匀浆
      1. 将脑组织蔗糖混合物转移至 50 mL 无菌匀浆器中，并加入 30 mL 0.32 M 无菌蔗糖溶液。使用 50 mL 玻璃匀浆器匀浆 2 分钟，获得均匀的脑组织匀浆液。
      2. 用 0.32 M 无菌蔗糖溶液将脑组织匀浆液稀释至 90 mL，混匀后缓慢加入六个含有 20 mL 0.83 M 无菌蔗糖溶液的 38.5 mL 无菌薄壁聚丙烯超速离心管上层。每根离心管中加入 15 mL 匀浆液，再用 0.32 M 无菌蔗糖溶液补足体积至平衡。
    3. 粗髓鞘碎片收集
      1. 将超速离心转子预冷至 4 °C，样品在 75,000 x g 条件下离心 45 分钟。离心结束后，使用无菌巴斯德吸管从两种蔗糖密度之间的界面收集髓鞘碎片。
        注意：在收集过程中必须格外小心，避免意外收集到样品中其他被污染的组分。
  2. 第一次等渗分离与纯化
    1. 将收集的髓鞘碎片溶液转移至 50 mL 离心管中，用预冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）调整体积至 35 mL。将溶液转移至新的 50 mL 无菌匀浆器中，匀浆 2 分钟，得到匀浆液。
    2. 将髓鞘碎片匀浆液均匀分配至六个 38.5 mL 无菌薄壁聚丙烯超速离心管中，并加入无菌 PBS 缓冲液。将离心管在 4 °C、75,000 x g 条件下离心 45 分钟。
  3. 第二次等渗分离与纯化
    1. 离心后弃去上清液，将白色固体沉淀用 10 mL 预冷的无菌 PBS 缓冲液重悬，得到髓鞘碎片悬液。将悬液均匀分配至两个 38.5 mL 无菌薄壁聚丙烯超速离心管中，并通过添加无菌 PBS 缓冲液平衡体积。
    2. 在 4 °C、75,000 x g 条件下离心 45 分钟。
  4. 纯化髓鞘的收集
    1. 离心后弃去上清液，将白色固体沉淀用 6 mL 无菌 PBS 缓冲液重悬。将髓鞘碎片悬液分装至六个 1.5 mL 离心管中，然后在 4 °C、12,000 x g 条件下离心 10 分钟。
    2. 离心后弃去上清液，将白色固体沉淀用 100 µL 预冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重悬。
  5. 髓鞘碎片的定量
    1. 取 3 µL 髓鞘碎片悬液，使用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。将剩余的髓鞘碎片悬液储存于 -80 °C。

2. 髓鞘碎片的荧光标记

  1. 羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯孵育
    1. 在4 °C或冰水中解冻所需量的髓鞘碎片，于4 °C下以12,000 × g 离心10分钟。弃去上清液，将髓鞘碎片重悬于200 µL羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯溶液（CFSE；50 µM）中。
    2. 室温避光孵育30分钟。孵育结束后，在4 °C下以12,000 × g 离心10分钟。
    3. 弃去上清液，用500 µL无菌PBS缓冲液洗涤样品3次。洗涤完成后，将髓鞘碎片重悬于100 µL预冷的无菌PBS缓冲液中，得到荧光标记的髓鞘碎片悬液，可保存于-80 °C。

3. 小胶质细胞培养

  1. 在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中，使用添加了10% (v/v) 胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 U/mL）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养BV-2细胞。将约50%融合度的BV-2细胞接种于12孔板和24孔板中，用于后续实验。

4. 体外 重复磁刺激

  1. 执行 体外 采用以下参数进行重复磁刺激干预：刺激频率20 Hz，刺激强度为最大输出强度的1%（即0.035 Tesla），刺激时间5 s，间歇时间20 s。每次治疗持续2.5分钟，共给予600次脉冲。
  2. 进行磁刺激时，将线圈中心与培养板中心对齐，并确保线圈紧密贴合于培养板底部。
    1. 预先确定磁刺激参数，并将磁刺激线圈的方向固定为垂直于地面且朝上。使用酒精对磁刺激线圈进行消毒，以防止细胞污染。
    2. 随后，从培养箱中取出细胞培养板，将其置于磁刺激线圈上方进行磁刺激。用酒精喷洒培养板以消毒，然后将其放回培养箱。整个过程中保持培养板加盖。

5. 小胶质细胞吞噬髓鞘碎片功能的检测

  1. 脂多糖联合重复磁刺激处理组（LPS+rMS组）的重复磁刺激治疗
    1. 使用CFSE（50 µM）标记髓鞘碎片以评估吞噬作用。将1 × 104个BV-2细胞接种于24孔板中，过夜培养。更换为无血清培养基，并用脂多糖（LPS；1 µg/mL）处理细胞12小时。用移液器轻轻吸除旧培养基，立即用移液器加入新的无血清培养基。
    2. LPS处理12小时后，在暗条件下向培养基中加入髓鞘碎片（100 µg/mL）进行共培养。按照步骤4.2所述对细胞进行重复磁刺激干预。
  2. 免疫荧光与成像
    1. 用PBS轻轻洗涤未吸附的髓鞘碎片，用4%多聚甲醛固定细胞15分钟。在室温下用含10%驴血清白蛋白和0.3% Triton X-100的PBS封闭细胞1小时，然后用PBS洗涤，并在4 °C下与一抗（IBA-1，1:200）孵育过夜。
    2. 在室温下用二抗（1:300，小鼠）孵育细胞2小时。使用共聚焦显微镜在40x和20x下采集图像。

结果

在本研究中，我们首先将BV-2小胶质细胞进行培养 体外 通过提取脑源性髓鞘碎片，并利用重复性磁刺激以增强其吞噬能力。随后，培养BV-2小胶质细胞，在磁刺激前给予LPS干预，从而模拟 体内 在严格的神经学验证下评估小胶质细胞的状态。随后，在LPS刺激后应用rMS干预。为验证细胞的吞噬作用，采用免疫荧光法，使用IBA-1标记小胶质细胞，CFSE标记髓鞘碎片。图1). 免疫荧光结果显示，被吞噬的外层髓鞘碎片（CFSE）面积以及IBA阳性细胞数量均显著减少+/髓鞘+ LPS组细胞与对照组相比，吞噬的外部髓鞘碎片面积以及IBA阳性细胞数量+/髓鞘+ LPS+rMS组细胞较LPS组显著增加（图2。我们的结果表明，在rMS干预后，LPS+4h rMS组小胶质细胞吞噬的髓鞘碎片数量和面积均显著大于LPS+1h rMS组和LPS+2h rMS组图3因此，这种促进作用具有时间依赖性。这些结果证实，rMS可促进小胶质细胞对髓鞘碎片的吞噬作用。 体外.

本方案在检测方面存在一定的局限性，此处呈现的结果是通过免疫荧光法检测小胶质细胞的吞噬作用获得的。由于CFSE实际上是一种用于标记髓鞘蛋白的荧光染料，因此在进行免疫荧光（IF）实验前，必须使用磷酸盐缓冲液（PBS）对其进行清洗，以避免结果中出现过多的异常荧光信号。然而，观察发现并非所有CFSE信号均能被有效去除，因此在后续荧光结果分析过程中需对其信号进行仔细甄别。因此，在评估免疫荧光结果时，应仅考虑与已被确认为吞噬了髓鞘碎片的细胞共标记的CFSE荧光信号。此外，在计数过程中应统计细胞内CFSE荧光区域的面积。需要注意的是，也可采用其他实验技术（如流式细胞术）来检测吞噬髓鞘碎片的细胞比例。此外，增加洗涤次数并对髓鞘碎片进行额外超声处理，可进一步提高结果的准确性。

小鼠髓鞘分离、荧光标记、免疫荧光成像、小胶质细胞刺激示意图。
图1：通过重复性磁刺激（rMS）实现小胶质细胞吞噬髓鞘碎片的示意图。 髓鞘碎片从小鼠脑组织中提取，同时培养BV-2细胞以用于后续细胞实验。BV-2细胞经LPS刺激12小时后，加入CFSE标记的髓鞘片段。随后进行重复性磁刺激干预，最后进行免疫荧光检测。缩写：CFSE = 羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯。 请点击此处查看该图的放大版本。

IBA-1、髓鞘、DAPI 的免疫荧光显微镜图像；柱状图显示 LPS 处理组中髓鞘减少
图2: 体外 BV2细胞通过rMS吞噬髓鞘碎片 (A各组中BV-2细胞（IBA-1，红色）摄取髓鞘碎片（CFSE，绿色）的代表性免疫荧光图像（n=4）。细胞核用DAPI复染（蓝色）。比例尺 = 50 µm, 10 µm. (B-D). BV-2细胞内髓鞘碎片面积的定量分析（B），图（A）中髓鞘碎片百分比及BV-2细胞数量（C），以及图（A）中小胶质细胞与髓鞘碎片共标记细胞数与小胶质细胞总数的比值，数据以均值 ± 标准差表示，#### p <0.0001 与对照组相比，**p <0.01 与 LPS+rMS 组相比，经单因素方差分析（one-way ANOVA）确定。该图已修改自16. 请点击此处以查看此图的放大版本。

IBA-1、髓鞘、DAPI、合并图的免疫荧光；共定位、强度；LPS处理。
图3：BV2细胞通过rMS时间依赖性吞噬髓鞘碎片。（A）各组中BV-2细胞（IBA-1，红色）摄取髓鞘碎片（CFSE绿色）的代表性免疫荧光图像（n=4）。使用DAPI复染细胞核（蓝色）。比例尺 = 50 µm。（B-D）BV-2细胞内髓鞘碎片面积的定量分析（B）、（A）中髓鞘碎片百分比与BV-2细胞数量（C），以及（A）中与小胶质细胞和髓鞘碎片共标记的细胞数与小胶质细胞总数的比值；数据以均值±标准差表示，### p <0.001 vs. 对照组，** p <0.01 和 *** p <0.001 vs. LPS+RMS 4小时，经单因素方差分析确定。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

重复性磁刺激（rMS）是一种非侵入性神经刺激技术，已广泛应用于多种神经和精神疾病的治疗，包括认知功能障碍、阿尔茨海默病（AD）、脑卒中、脑损伤以及脊髓损伤（SCI）。rMS利用脉冲磁场调节神经元的膜电位，选择性地影响神经系统内的神经兴奋性11。除了对神经元的作用外，rMS还被证实能够调节小胶质细胞功能、抑制神经炎症，并改善中枢神经系统（CNS）微环境19。在我们之前的研究中，观察到对损伤部位施加重复性磁刺激显著增强了小胶质细胞吞噬髓鞘碎片的能力，加快了髓鞘碎片的清除，并改善了SCI大鼠的脊髓微环境16。为进一步探究这一现象，我们建立了一种体外实验方案，以在细胞水平上验证重复性磁刺激对小胶质细胞吞噬功能的影响。该实验方法为理解重复性磁刺激在调控小胶质细胞功能中的作用提供了新的途径。

磁刺激疗法的大部分研究集中在神经元或神经可塑性领域，涵盖阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和脑卒中等疾病。12,13,14由可变磁场产生的感应电流对神经系统产生的生理效应一直是研究的主要领域。然而，越来越多的研究发现，磁刺激不仅能以如上所述的方式改善神经功能障碍，还可通过影响小胶质细胞等免疫细胞促进神经功能的恢复。但目前尚不清楚是否能在不损害神经生理功能的前提下直接调控小胶质细胞。本方法通过将磁刺激直接应用于小胶质细胞，进一步拓展了我们对磁刺激作用机制的理解 体外 独立分析磁刺激对小胶质细胞吞噬作用的影响。此外，本研究为进一步探索磁刺激对其他细胞的作用奠定了基础，从而补充了对磁刺激在神经系统疾病中作用机制的理解。

在本研究中，我们采用了一种包含小胶质细胞和髓鞘碎片的共培养系统，并对其进行重复性磁刺激（rMS）。rMS处理后的免疫荧光分析显示，小胶质细胞表现出增强的吞噬活性，能够有效清除髓鞘碎片。 体外值得注意的是，小胶质细胞吞噬作用的增强呈时间依赖性，提示重复经颅磁刺激对小胶质细胞功能具有渐进性影响。

在实施本方案时，必须考虑几个关键因素。首先，髓鞘提取过程必须在冷藏条件（4 °C）下进行，以防止降解并维持髓鞘的完整性，从而实现高效提取。此外，必须在无菌环境中进行提取，以避免污染。关于重复性磁刺激（rMS）干预，确定最佳刺激强度对于确保细胞活力至关重要。过高的强度可能影响小胶质细胞的存活，进而干扰实验结果。值得注意的是，吞噬细胞能够吞噬的髓鞘碎片体积存在上限。28因此，外源性髓鞘碎片需要预先通过超声进一步破碎，以减小其体积，并减轻大块髓鞘碎片对实验结果可能产生的影响。此外，根据实验的具体目标，可采用不同的细胞模型来模拟小胶质细胞在多种神经系统疾病状态下的反应，从而更全面地考察重复磁刺激（rMS）在不同病理背景下对髓鞘碎片清除作用的影响。同时，评估小胶质细胞在rMS干预下吞噬髓鞘碎片后的功能变化，可为进一步揭示该技术的治疗潜力提供重要信息。值得注意的是，本研究中使用了12孔和6孔培养板，但所用刺激靶标的直径大于培养板孔径。为避免rMS干预过程中磁刺激线圈对其他孔中细胞产生潜在的干扰效应，每个12孔或24孔培养板仅使用四个角上的孔进行实验 体外 实验。此外，小胶质细胞的吞噬能力可通过流式细胞术和活细胞成像系统进行定量评估，从而更全面地评价小胶质细胞的活性。

尽管结果令人鼓舞，但本方案仍存在一些局限性和未来可改进之处。虽然原代小胶质细胞为研究小胶质细胞对重复磁刺激（rMS）的反应提供了更具生理相关性的模型，但磁刺激设备的最低输出强度（0.035 T）限制了我们对强度梯度进行精确控制和测量的能力。未来的研究可探索不同rMS强度和频率对小胶质细胞功能的影响，以优化刺激参数。此外，本研究未对髓鞘碎片纯化的效率进行充分验证。为了提高未来实验的准确性，有必要验证纯化过程，并在实验使用前确保获得高质量的髓鞘碎片。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到中国国家自然科学基金（82302877，82172541）和湖南省自然科学基金（2023JJ30549）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含DAPI的抗荧光淬灭封片液Beyotime, 中国P0131
BCA试剂盒ThermoFisher Scientific, 美国23227
Bv-2细胞ATCCCBP60922
细胞培养12孔板Biofil, 中国
细胞培养24孔板Biofil, 中国
共聚焦激光扫描显微镜Zeiss, 德国800
恒温培养箱ThermoFisher Scientific, 美国
CFSEMedChemExpress, 美国HY-158820
DMEM培养基KeyGen, 中国KGL1202-500
FBSGibco, 美国16250078
Iba1Abcam, 美国ab48004
磁刺激装置Yiruide, 中国CCY-IA
磁刺激线圈Yiruide, 中国
多聚甲醛BioSharp, 中国
PBSKeyGen, 中国KGL2210-500
青霉素-链霉素Gibco, 美国15140-122
蔗糖MedChemExpress, 美国HY-B1779
胰蛋白酶KeyGen, 中国KGL2107-100
超速离心机Beckman, 美国L-100XP

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