需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

冷冻切片与免疫染色小鼠内耳组织：从胚胎期到成年期

3.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/67647

⸱

2025年4月11日

 , 
1Department of Biology, Georgetown University

本文内容

摘要

本方案面向小鼠内耳组织的初学者，全面详述了针对不同发育阶段的小鼠内耳组织进行切片免疫染色的处理步骤。

摘要

本方案详细介绍了制备胚胎期、新生期及成年小鼠内耳样本的一般组织学方法。该方案旨在为可能刚进入该领域的研究人员提供一种简单且标准化的小鼠耳蜗组织处理方法。本文包含解剖、固定、包埋、冷冻切片和免疫染色的实验步骤。切片免疫染色是研究整个耳蜗背景下单个细胞的最佳方法之一。

关键步骤包括将内耳从颅骨中解剖分离，使用4%多聚甲醛固定组织，用最佳切割温度化合物包埋，进行冷冻切片，以及利用靶向耳蜗表达的特定蛋白的抗体进行免疫染色。

在我们的方法中，包含了针对耳蜗的特殊考量，鉴于其
形状和结构 需要具备较为良好的聚焦和解剖技能，因为组织损伤可能影响免疫染色的质量以及样本间的一致性。然而，通过我们所概述的操作步骤，大多数使用者可在数周内接受培训并制备出高质量的样本。总体而言，本方案为促进研究小鼠模型中听觉发育、功能及疾病提供了重要的技术途径。

引言

了解听觉发育和功能对于表征和应对不同类型的听力损失至关重要。听力损失的风险因素众多，包括糖尿病1,2、高血压3,4,5、自身免疫性疾病6,7、细菌性脑膜炎8,9，以及多种神经退行性疾病10,11,12,13。此外，某些药物，如部分抗生素和化疗药物，也可能对听力产生负面影响14。除了听觉障碍带来的直接挑战外，听力损失还可能影响认知功能，并增加焦虑和压力，这些因素可能与认知功能障碍和心理健康恶化相关11,15,16。通过发布本实验方案，我们旨在降低进入听觉研究领域的门槛，特别是为那些此前无耳蜗操作经验的研究人员提供便利。本指南详细说明了如何从胚胎期、幼年期（新生期）及成年小鼠中制备内耳样本。本方案的目的是提供一种简明的内耳组织处理方法，确保实验间的可重复性和一致性。切片免疫染色是研究整个耳蜗背景下不同类型细胞的最佳方法之一；而在其他情况下，整体免疫染色可能更具优势（例如，观察毛细胞静纤毛形态或蛋白定位）。

这一方法的提出源于小鼠耳蜗操作中的诸多挑战。耳蜗体积微小、结构呈独特的螺旋状且极为精细17，因此需要采用专门的技术才能准确完成解剖、固定、包埋、冷冻切片和免疫染色。由于耳蜗呈螺旋形，包埋时必须特别注意其方向，以确保耳蜗每一圈结构均得以完整保留，这对于获得一致性的切片至关重要。此外，随着耳蜗的发育成熟，会逐渐发生骨化18，即逐步转变为骨组织，这可能影响组织的保存效果，并需要进行脱钙处理。相较于其他制备方法（如整体免疫染色），冷冻切片免疫染色具有多项优势。其主要优点在于能够较好地保存蛋白质和核酸，并且切片较薄、接近二维结构，有利于实现一致且精确的测量。此外，该方法可完整保留并可视化所有类型的耳蜗细胞，同时有助于提升免疫染色的质量。与许多耳蜗整体标本制备方法不同，冷冻切片能够保留包括螺旋韧带、血管纹、前庭膜和盖膜在内的多种结构。有关胚胎期19,20,21、新生期22,23,24及成年期25,26内耳高质量切片免疫染色的实例，可参见以下先前发表的研究。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：本文所述所有方法均已获得乔治城大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。本研究中所有小鼠的饲养均遵循乔治城大学机构动物照护与使用委员会的规定（方案编号 #1147）。在出生后第一周，由于颞骨结构尚未完全发育，无需进行脱钙处理。然而，P6 及更大小鼠的耳蜗则需要脱钙，并采用不同的解剖方法。在本方案中，使用了雄性和雌性 NCI Cr:NIH(S)（NIH Swiss）小鼠，实验时间点分别为 E16.5、P0 和 P30。对于每个步骤，我们在括号中注明初学者完成该步骤预计所需的时间。随着操作熟练度的提高，许多步骤所需时间将缩短。

1. 胚胎和幼年期耳蜗样本采集（约75分钟）

  1. 根据批准的动物实验方案，对小鼠实施安乐死并断头。
  2. 使用精细解剖剪，在头皮正中线处小心剪开切口，从颈部开始向吻部延伸，将皮肤向两侧推开（第一刀）。
  3. 将剪刀的下刃置于枕骨大孔处，上刃置于颅骨顶部，沿颅骨上半部分剪至鼻部（第二刀）。
  4. 将剪刀从已部分切开的头部退出，然后将剪刀下刃置于颅骨底部，上刃末端置于枕骨大孔处，沿头部下半部分剪至鼻部（第三刀）。
    注意：剪刀刀刃必须准确穿过正中线，并能轻松剪开而无需用力。这可确保剪刀刀刃正好位于左、右内耳之间。
  5. 此时，小鼠头部已沿头尾轴被分为两半。使用精细镊子和剪刀，小心去除颞骨周围的所有软组织，如脑组织、肌肉和结缔组织，避免损伤骨骼或周围结构。
  6. 将小鼠半侧头部放入含有室温1×PBS的24孔板孔中。待所有头部样本处理完毕后，将1×PBS更换为4%多聚甲醛（PFA）溶液（用于固定），室温（通常为20 °C）孵育45分钟。
    注意：固定时间可能因目标蛋白的种类或不同抗体的结合效率而有所调整。
  7. 45分钟后，用1×PBS清洗组织3次，每次5–10分钟。
  8. 样本可暂存于4 °C的1×PBS中，或直接进入下一步进行解剖。如需长期保存，应置于含0.1%叠氮化钠的1×PBS中，4 °C保存。
  9. 按照所在机构关于生物危害物/组织废弃物处理的指南，妥善处置剩余的小鼠组织。

2. 胚胎和幼年期内耳样本解剖（每个样本 3 - 5 分钟）

  1. 在小鼠半侧头部中定位颞骨/内耳囊。其位置与外耳相同，但位于颅骨内部。使用精细镊子小心地剥离围绕内耳囊的所有软组织。一旦内耳囊松动，开始切割其周围的组织。
  2. 当内耳囊大部分从颅骨组织中分离后，用镊子轻轻按压内耳囊周围区域，使其完全游离。
    注意：应逐渐施加压力，以松解内耳囊与其周围结构的连接。避免损伤内耳囊。由于发育早期的内耳较为柔软，应避免镊子直接接触内耳组织。
  3. 将内耳样本按步骤1.8所述方法保存，并丢弃固定后头部组织中的任何残留碎片。

3. 成年个体内耳样本采集与解剖（约75分钟 + 2–3天EDTA处理）

  1. 根据批准的动物实验方案对小鼠实施安乐死并断头。
  2. 使用锋利的解剖剪，从颈部开始沿头皮中线小心剪开，一直延伸至吻部。将皮肤向后折叠，暴露颅骨（第一刀）。
  3. 将剪刀的下刃置于枕骨大孔处，上刃置于颅骨上，沿颅骨上半部分剪至鼻部（第二次剪切）。
    注意：在此步骤中，您将观察到中等程度的 "crunching" 剪刀刀片的这种状况是正常的。
  4. 将剪刀从部分切开的头部退出，然后将剪刀的下刃置于颅骨底部，上刃置于枕骨大孔处。沿中线向上剪开头部下半部分至鼻部（第三次切割），注意保持沿正中线切割，以确保剪刀避开内耳。
    注意：不要强行将剪刀插入组织中；这可能表明刀片已触碰到内耳结构之一。
  5. 对于每一侧头颅，使用镊子和剪刀去除颞骨周围的所有软组织，例如脑组织、肌肉和结缔组织。
    注意：需小心操作，避免损伤颞骨或周围结构。
  6. 在清除周围组织后， "反向卷曲" 用手指握住颅骨组织，并用拇指轻轻按压颞骨的下表面。在逐渐施加压力的同时，松解颞骨与其周围连接组织的附着。
    注意：随着压力的施加，内耳骨囊逐渐与颅骨周围的骨骼分离。通过轻柔的操作，骨骼应能相对容易地脱出。
  7. 内耳囊去除后，用1×PBS冲洗。
  8. 用4%多聚甲醛填充硅胶培养皿，并将其置于显微镜下。将一个已分离的内耳放入硅胶培养皿中。
  9. 检查内耳是否有附着的软组织或骨骼，并小心去除。
  10. 找到卵圆窗，用镊子轻轻移除镫骨。
  11. 找到圆窗，并刺一个小孔，以确保周围组织未堵塞圆窗。
  12. 用精细镊子在耳蜗顶开一个小孔，用装有4%多聚甲醛的P20移液枪冲洗耳蜗以进行固定。注意观察椭圆窗处有液体（稀释的血液、内淋巴/外淋巴）流出。
  13. 将固定的耳蜗置于含有4% PFA的24孔板中，标记时间。室温下轻轻振荡（摇床或翻转仪）孵育30–60分钟，然后用1×PBS溶液清洗样本，每次5–10分钟，共洗3次。
  14. 最后一次漂洗后，将组织置于1.25 mM EDTA中，于4 °C摇动孵育2-3天。
  15. 根据机构关于生物危害物/组织处理的指南，妥善处置剩余的小鼠组织。
  16. EDTA 处理后，用 1x PBS 将组织冲洗 3 次，每次 5 分钟。
  17. 将样品置于 1x PBS 中，4 °C 保存，或直接进行下一步解剖操作。如需长期保存，应将样品置于含 0.1% 叠氮化钠的 1x PBS 中，4 °C 保存。

4. 内耳样本的冷冻切片制备（约 24 小时）

  1. 将解剖出的内耳囊泡置于10%蔗糖（溶于1×PBS）中，室温孵育至少2小时。
    注意：当样品完全平衡后，会沉入管底。
  2. 弃去10%蔗糖溶液，加入20%蔗糖（溶于1×PBS），继续在室温孵育2小时。
  3. 弃去20%蔗糖溶液，加入30%蔗糖（溶于1×PBS），于4 °C过夜孵育（至少）。
    注意：此步骤可缩短至2小时，但过夜孵育效果最佳。组织可在任意浓度蔗糖溶液中长时间保存。
    1. 取出一半的30%蔗糖溶液，用最佳切割温度（OCT）包埋剂填充剩余空间。轻轻摇动，孵育时间至少30分钟，最多2小时。
      注意：样品在OCT中停留时间过长会导致组织收缩。
  4. 将样品转移至已标记并充满OCT包埋剂的冷冻模具中。
  5. 在显微镜下检查包埋后冷冻块中的耳蜗方向。对于"标准"耳蜗横切面，需确认内耳的凹面朝向冷冻模具的窄边。
  6. 将干冰放入小容器中，加入5–10 mL乙醇或二甲基丁烷。将装有OCT和样品的冷冻模具置于冒泡的干冰上，迅速冷冻组织块。
  7. 将样品储存在-80 °C条件下。

5. 内耳切片（每个样本约 25 分钟）

  1. 将冻存块转移至预冷至 -20 °C 的冷冻切片机腔室内，使样品在其中平衡 30–60 分钟。
  2. 用铅笔标记与耳蜗位置相对应的冷冻块侧面，以确保切片时方向正确。
  3. 在卡盘上加入少量OCT，将冷冻组织块较宽的一面（无铅笔标记面）朝下放置于其上。
  4. 将夹持器加OCT包埋剂及样本放入预冷的冷冻切片机腔室内，使OCT完全冻结。数分钟后，将夹持器加样本置于夹持器架上，铅笔标记朝向左侧或右侧。
  5. 修剪 直到组织显现为止（修块设置使用40 μm）。
  6. 一旦组织显现，使用专用于冷冻切片的载玻片切取12 μm厚的组织切片，并在显微镜下检查切片位置。
  7. 若接近耳蜗转部，采集12 μm切片，并偶尔检查位置，直至完全通过所有转部。
    注意：每张载玻片上的切片数量可能有所不同，但我们通常每张载玻片获得8–10个切片，每只耳蜗约可得到6张载玻片。
  8. 将载玻片存放于 -80 °C。

6. 切片免疫染色（约1 - 3天）

  1. 从 -80 °C 冰箱中取出载玻片，室温下晾干约 10 分钟。
  2. 使用铅笔在载玻片上标记将要使用的抗体名称。
  3. 使用疏水性标记笔（例如，疏水屏障辣根过氧化物酶-抗辣根过氧化物酶笔（PAP））沿组织边缘划圈。
  4. 用 1x PBS 重悬样品，孵育 5 分钟。
  5. 弃去载玻片上的 1x PBS，加入含 0.1% Triton X-100 的 1x PBS（0.1% PBSTx），室温孵育 20 分钟以进行透化处理。
  6. 移除载玻片上的 0.1% PBSTx，每张载玻片加入 200 µL 封闭液，室温孵育 1–2 小时。
    注意：封闭是免疫组织化学和免疫荧光等免疫染色技术中的关键步骤，可防止抗体与组织或细胞发生非特异性结合。更多相关信息，请参见 Lewis 关于选择对照和封闭试剂的指南27。常用的封闭液为含 10% 正常驴血清的 0.5% PBSTx，但此方案仅适用于使用驴源性二抗的情况。
  7. 用 1x PBS 快速漂洗一次，每张载玻片加入 200 µL 用 0.5% PBSTx 配制的一抗溶液，室温孵育 1 小时或 4 °C 过夜。对于 图 1 中所示的一抗，使用以下稀释比例：Plexin-B1 为 1:200，Sox2 为 1:200，Tuj1、Myo6 和 Myo7A 均为 1:1,000（另见 材料列表）。
    注意：每种一抗的行为特性因其表位结合特性和穿透组织样本的能力而异。
  8. 一抗孵育完成后，用 PBSTx 漂洗 4 次，每次 30 分钟，然后每张载玻片加入 200 µL 用 0.5% PBSTx 配制的二抗溶液 （见 材料列表），室温孵育 1 小时。
    注意：有时将二抗溶液在 4 °C 下以最大转速离心 30 分钟以沉淀任何不溶性杂质会有所帮助。若已对二抗溶液进行离心处理，移液时应避免触碰离心管底部。
  9. 用 PBSTx 漂洗 4 次，每次 30 分钟（或过夜漂洗），然后使用可防止荧光淬灭的封片剂（如 Fluoromount）封片。
  10. 加盖合适尺寸且厚度适用于成像系统的盖玻片（例如厚度为 0.13–0.16 mm 的 1 号盖玻片）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

我们展示了来自本实验室的胚胎第16.5天（E16.5）小鼠耳蜗顶转与基转，以及出生后第0天（P0）和第30天（P30）耳蜗基转的示例。这些样品经过切片并使用毛细胞标记物（Myo7A 和 Myo6）、螺旋神经节神经元（SGNs；Tuj1）、胶质细胞与支持细胞（Sox2）以及Plexin-B1进行免疫染色，其中Plexin-B1标记耳蜗管和螺旋神经节神经元周围的基底膜。在不同发育阶段耳蜗的横截面显示出形态学和细胞组织结构的显著差异，反映了耳蜗的成熟过程。

在E16.5时期，耳蜗处于发育的早期阶段，柯蒂器官开始分化。此时，螺旋神经节神经元（SGNs）对毛细胞的神经支配已经启动（图1C），尽管神经完全发育尚需数周时间。毛细胞前体已可识别，内毛细胞和外毛细胞的早期形态可见（图1D）。结构上，耳蜗管已形成，但尚未伸长至成年时的全长。到出生后第0天（P0）时，耳蜗相对成熟得多。耳蜗管结构更加清晰，鼓阶和前庭阶的扩张已明显可见。耳蜗的神经支配持续进展，毛细胞与螺旋神经节神经元之间...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

成功的冷冻切片和免疫染色有几个关键步骤。耳蜗组织的适当固定至关重要，而固定时间的长短也非常重要，具体时长可能因抗体不同而有所差异。尽管大多数抗体在较短的固定时间（例如45分钟的多聚甲醛固定）下效果更佳，但某些靶向表位可以耐受过夜固定。根据我们的经验，45分钟的固定能够确保充分的组织保存，并且适用于大多数常用于耳蜗样本研究的一抗。在排查免疫染色问题时（见表1），应考虑不同的固定时间。虽然 冷冻切片具有多种优势，例如可识别特定细胞类型，并有助于更清晰地分辨某些结构细节（如前庭膜、血管纹、蜗轴），但整体封片法在保留组织的三维结构和空间关系方面更具优势29。此外，整体封片（未固定）样本还为将耳蜗作为活体样本进行研究提供了可能，可用于观察细胞动态行为30和Ca2+瞬变等现象31。

对小鼠耳蜗进行冷冻切片的最大优势之一是可以进行大量定量分析。例如，冷冻切片非常适合在抗体检测后对荧光强度水平进行定量分析（示例见...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

M.A.D. 和 T.M.C. 的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 5R01DC016595-07（资助给 T.M.C.）和 5R01DC018040-05（Michael Deans，犹他大学，项目负责人）的支持。图1A-H 中的示例显微图像由张凯迪博士生成。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂
Triton X-100Thermo Fisher Scientific, Inc.BP151-500
PBSCorning, Inc.46-013-CM
EDTASigma-Aldrich, LLC.60-00-4
Sucrose VWR International, Inc.97061-432
Sodium azide Amresco, Inc.0639-250G
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15714
EthanolDecon labs, Inc.v1001
Dimethylbutane Thermo Fisher Scientific, Inc.19387-AP
最佳切割温度化合物（OCT）VWR International, Inc.25608-930
专用设备
冷冻切片机Thermo Fisher Scientific, Inc.14-071-459
解剖镊Electron Microscopy Sciences72700-DZ
疏水屏障过氧化物酶-抗过氧化物酶笔（PAP） Vector Laboratories, Inc.H-4000
共聚焦显微镜Carl Zeiss Microscopy, LLC.LSM 880
P20 微量移液器Gilson, Inc.F144056M
解剖剪刀Thermo Fisher Scientific, Inc.08-951-20
Sylgard 培养皿Electron Microscopy Sciences24236-10
离心机Eppendorf5424R
封片材料
FluoromountElectron Microscopy Sciences17984-25
Superfrost plus 载玻片Thermo Fisher Scientific, Inc.1255015
免疫染色试剂
正常驴血清Jackson ImmunoResearch, Inc.017-000-121
抗小鼠 FAB 片段 Jackson ImmunoResearch, Inc.715-007-003
BlokHenAves labs, Inc.BH-1001
Tuj1（beta-III-微管蛋白）小鼠单克隆抗体Biolegend, Inc.MMS-435P
Sox2 山羊多克隆抗体R&D Systems, Inc.AF2018
Myo6 兔多克隆抗体Proteus Biosciences25–6791
Myo7A 兔多克隆抗体Thermo Fisher Scientific, Inc.PA1-936
Plexin-B1 山羊多克隆抗体R&D Systems, Inc.AF3749
二抗（驴源；Alexa-488、Cy3、Cy5）Jackson ImmunoResearch, Inc.见产品目录

参考文献

  1. Bainbridge, K. E., Hoffman, H. J., Cowie, C. C. Diabetes and hearing impairment in the United States: Audiometric evidence from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999 to 2004 . Ann Intern Med. 149 (1), 1-10 (1999).
  2. Baiduc, R. R., Helzner, E. P. Epidemiology of diabetes and hearing loss. Semin Hear. 40 (4), 281-291 (2019).
  3. Agarwal, S., Mishra, A., Jagade, M., Kasbekar, V., Nagle, S. K. Effects of hypertension on hearing. Indian J Otolaryngol Head Neck Surg. 65 (Suppl 3), 614-618 (2013).
  4. Przewoźny, T., Gójska-Grymajło, A., Kwarciany, M., Gąsecki, D., Narkiewicz, K. Hypertension and cochlear hearing loss. Blood Press. 24 (4), 199-205 (2015).
  5. Babarinde, J. A., Adeyemo, A. A., Adeoye, A. M. Hearing loss and hypertension: exploring the linkage. The Egyptian Journal of Otolaryngology. 37 (1), 1-6 (2021).
  6. Mijovic, T., Zeitouni, A., Colmegna, I. Autoimmune sensorineural hearing loss: the otology-rheumatology interface. Rheumatology (Oxford). 52 (5), 780-789 (2013).
  7. Mancini, P., et al. Hearing loss in autoimmune disorders: Prevalence and therapeutic options. Autoimmun Rev. 17 (7), 644-652 (2018).
  8. Persson, F., Bjar, N., Hermansson, A., Gisselsson-Solen, M. Hearing loss after bacterial meningitis, a retrospective study. Acta Otolaryngol. 142 (3-4), 298-301 (2022).
  9. Kutz, J. W., Simon, L. M., Chennupati, S. K., Giannoni, C. M., Manolidis, S. Clinical predictors for hearing loss in children with bacterial meningitis. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 132 (9), 941-945 (2006).
  10. Li, S., et al. Hearing loss in neurological disorders. Front Cell Dev Biol. 9, 716300(2021).
  11. Shen, Y., et al. Cognitive decline, dementia, Alzheimer's disease and presbycusis: Examination of the possible molecular mechanism. Front Neurosci. 12, 12(2018).
  12. Profant, O., et al. Auditory dysfunction in patients with Huntington's disease. Clin Neurophysiol. 128 (10), 1946-1953 (2017).
  13. Jafari, Z., Kolb, B. E., Mohajerani, M. H. Auditory dysfunction in Parkinson's disease. Mov Disord. 35 (4), 537-550 (2020).
  14. Rybak, L. P., Ramkumar, V. Ototoxicity. Kidney Int. 72 (8), 931-935 (2007).
  15. Demirhan, M. A., Celebisoy, N. Cognitive functions in episodic vestibular disorders: Meniere's disease and vestibular migraine. J Vestib Res. 33 (1), 63-70 (2023).
  16. Shoham, N., Lewis, G., Favarato, G., Cooper, C. Prevalence of anxiety disorders and symptoms in people with hearing impairment: a systematic review. Soc Psychiatry Psychiatr Epidemiol. 54 (6), 649-660 (2019).
  17. Manley, G. A., Gummer, A. W., Popper, A. N., Fay, R. R. The cochlea: What it is, where it came from, and what is special about it. Understanding the Cochlea. Springer Handbook of Auditory Research. 62, Springer. Cham. 17-32 (2017).
  18. Bai, J., et al. Three-dimensionally visualized ossification and mineralization process of the otic capsule in a postnatal developmental mouse. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 8 (4), 1036-1043 (2023).
  19. Dabdoub, A., et al. Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18396-18401 (2008).
  20. Mann, Z. F., Chang, W., Lee, K. Y., King, K. A., Kelley, M. W. Expression and function of scleraxis in the developing auditory system. PLoS One. 8 (9), e75521(2013).
  21. Wang, Z., et al. The purinergic receptor P2rx3 is required for spiral ganglion neuron branch refinement during development. eNeuro. 7 (4), (2020).
  22. Matern, M., et al. Gfi1Cre mice have early onset progressive hearing loss and induce recombination in numerous inner ear non-hair cells. Sci Rep. 7, 42079(2017).
  23. Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea. Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).
  24. Zhang, K. D., Coate, T. M. Recent advances in the development and function of type II spiral ganglion neurons in the mammalian inner ear. Semin Cell Dev Biol. 65, 80-87 (2017).
  25. Brooks, P. M., et al. Pou3f4-expressing otic mesenchyme cells promote spiral ganglion neuron survival in the postnatal mouse cochlea. J Comp Neurol. 528 (12), 1967-1985 (2020).
  26. Zhang, Y., et al. Pericytes control vascular stability and auditory spiral ganglion neuron survival. Elife. 12, e83486(2023).
  27. Lewis, M. A guide to selecting control and blocking reagents. , https://www.jacksonimmuno.com/secondary-antibody-resource/technical-tips/controls-diluents-blocking/ (2018).
  28. Song, L., McGee, J., Walsh, E. J. Frequency-and level-dependent changes in auditory brainstem responses (ABRS) in developing mice. J Acoust Soc Am. 119 (4), 2242-2257 (2006).
  29. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole-mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), e53561(2016).
  30. Driver, E. C., Northrop, A., Kelley, M. W. Cell migration, intercalation and growth regulate mammalian cochlear extension. Development. 144 (20), 3766-3776 (2017).
  31. Babola, T. A., et al. Purinergic signaling controls spontaneous activity in the auditory system throughout early development. J Neurosci. 41 (4), 594-612 (2021).
  32. Donadieu, E., et al. Improved cryosections and specific immunohistochemical methods for detecting hypoxia in mouse and rat cochleae. Acta Histochem. 109 (3), 177-184 (2007).
  33. Rio, C., Dikkes, P., Liberman, M. C., Corfas, G. Glial fibrillary acidic protein expression and promoter activity in the inner ear of developing and adult mice. J Comp Neurol. 442 (2), 156-162 (2002).
  34. Ahmad, S., Chen, S., Sun, J., Lin, X. Connexins 26 and 30 are co-assembled to form gap junctions in the cochlea of mice. Biochem Biophys Res Commun. 307 (2), 362-368 (2003).
  35. Li, X., et al. Spag6 mutant mice have defects in development and function of spiral ganglion neurons, apoptosis, and higher sensitivity to paclitaxel. Sci Rep. 7 (1), 8638(2017).
  36. Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
  37. Goodyear, R. J., et al. Accelerated age-related degradation of the tectorial membrane in the Ceacam16βgal/βgal null mutant mouse, a model for late-onset human hereditary deafness DFNB113. Front Mol Neurosci. 12, 147(2019).
  38. Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section. Protoplasma. 254 (5), 1931-1939 (2017).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

小鼠耳蜗冷冻切片内耳免疫染色耳蜗横切面组织固定OCT包埋多聚甲醛固定听觉发育耳蜗解剖组织学方法
冷冻切片与免疫染色小鼠内耳组织：从胚胎期到成年期
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。