本方案面向小鼠内耳组织的初学者，全面详述了针对不同发育阶段的小鼠内耳组织进行切片免疫染色的处理步骤。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
本方案详细介绍了制备胚胎期、新生期及成年小鼠内耳样本的一般组织学方法。该方案旨在为可能刚进入该领域的研究人员提供一种简单且标准化的小鼠耳蜗组织处理方法。本文包含解剖、固定、包埋、冷冻切片和免疫染色的实验步骤。切片免疫染色是研究整个耳蜗背景下单个细胞的最佳方法之一。
关键步骤包括将内耳从颅骨中解剖分离，使用4%多聚甲醛固定组织，用最佳切割温度化合物包埋，进行冷冻切片，以及利用靶向耳蜗表达的特定蛋白的抗体进行免疫染色。
在我们的方法中，包含了针对耳蜗的特殊考量，鉴于其
形状和结构 需要具备较为良好的聚焦和解剖技能，因为组织损伤可能影响免疫染色的质量以及样本间的一致性。然而，通过我们所概述的操作步骤，大多数使用者可在数周内接受培训并制备出高质量的样本。总体而言，本方案为促进研究小鼠模型中听觉发育、功能及疾病提供了重要的技术途径。
引言
了解听觉发育和功能对于表征和应对不同类型的听力损失至关重要。听力损失的风险因素众多，包括糖尿病1,2、高血压3,4,5、自身免疫性疾病6,7、细菌性脑膜炎8,9，以及多种神经退行性疾病10,11,12,13。此外，某些药物，如部分抗生素和化疗药物，也可能对听力产生负面影响14。除了听觉障碍带来的直接挑战外，听力损失还可能影响认知功能，并增加焦虑和压力，这些因素可能与认知功能障碍和心理健康恶化相关11,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：本文所述所有方法均已获得乔治城大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。本研究中所有小鼠的饲养均遵循乔治城大学机构动物照护与使用委员会的规定（方案编号 #1147）。在出生后第一周，由于颞骨结构尚未完全发育，无需进行脱钙处理。然而，P6 及更大小鼠的耳蜗则需要脱钙，并采用不同的解剖方法。在本方案中，使用了雄性和雌性 NCI Cr:NIH(S)（NIH Swiss）小鼠，实验时间点分别为 E16.5、P0 和 P30。对于每个步骤，我们在括号中注明初学者完成该步骤预计所需的时间。随着操作熟练度的提高，许多步骤所需时间将缩短。
1. 胚胎和幼年期耳蜗样本采集（约75分钟）
- 根据批准的动物实验方案，对小鼠实施安乐死并断头。
- 使用精细解剖剪，在头皮正中线处小心剪开切口，从颈部开始向吻部延伸，将皮肤向两侧推开（第一刀）。
- 将剪刀的下刃置于枕骨大孔处，上刃置于颅骨顶部，沿颅骨上半部分剪至鼻部（第二刀）。
- 将剪刀从已部分切开的头部退出，然后将剪刀下刃置于颅骨底部，上刃末端置于枕骨大孔处，沿头部下半部分剪至鼻部（第三刀）。
注意：剪刀刀刃必须准确穿过正中线，并能轻松剪开而无需用力。这可确保剪刀刀刃正好位于左、右内耳之间。 - 此时，小鼠头部已沿头尾轴被分为两半。使用精细镊子和剪刀，小心去除颞骨周围的所有软组织，如脑组织、肌肉和结缔组....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们展示了来自本实验室的胚胎第16.5天（E16.5）小鼠耳蜗顶转与基转，以及出生后第0天（P0）和第30天（P30）耳蜗基转的示例。这些样品经过切片并使用毛细胞标记物（Myo7A 和 Myo6）、螺旋神经节神经元（SGNs；Tuj1）、胶质细胞与支持细胞（Sox2）以及Plexin-B1进行免疫染色，其中Plexin-B1标记耳蜗管和螺旋神经节神经元周围的基底膜。在不同发育阶段耳蜗的横截面显示出形态学和细胞组织结构的显著差异，反映了耳蜗的成熟过程。
在E16.5时期，耳蜗处于发育的早期阶段，柯蒂器官开始分化。此时，螺旋神经节神经元（SGNs）对毛细胞的神经支配已经启动（图1C），尽管神经完全发育尚需数周时间。毛细胞前体已可识别，内毛细胞和外毛细胞的早期形态可见（图1D）。结构上，耳蜗管已形成，但尚未伸长至成年时的全长。到出生后第0天（P0）时，耳蜗相对成熟得多。耳蜗管结构更加清晰，鼓阶和前庭阶的扩张已明显可见。耳蜗的神经支配持续进展，毛细胞与螺旋神经节神经元之间.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
成功的冷冻切片和免疫染色有几个关键步骤。耳蜗组织的适当固定至关重要，而固定时间的长短也非常重要，具体时长可能因抗体不同而有所差异。尽管大多数抗体在较短的固定时间（例如45分钟的多聚甲醛固定）下效果更佳，但某些靶向表位可以耐受过夜固定。根据我们的经验，45分钟的固定能够确保充分的组织保存，并且适用于大多数常用于耳蜗样本研究的一抗。在排查免疫染色问题时（见表1），应考虑不同的固定时间。虽然 冷冻切片具有多种优势，例如可识别特定细胞类型，并有助于更清晰地分辨某些结构细节（如前庭膜、血管纹、蜗轴），但整体封片法在保留组织的三维结构和空间关系方面更具优势29。此外，整体封片（未固定）样本还为将耳蜗作为活体样本进行研究提供了可能，可用于观察细胞动态行为30和Ca2+瞬变等现象31。
对小鼠耳蜗进行冷冻切片的最大优势之一是可以进行大量定量分析。例如，冷冻切片非常适合在抗体检测后对荧光强度水平进行定量分析（示例见.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
M.A.D. 和 T.M.C. 的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 5R01DC016595-07（资助给 T.M.C.）和 5R01DC018040-05（Michael Deans，犹他大学，项目负责人）的支持。图1A-H 中的示例显微图像由张凯迪博士生成。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 化学试剂 | |||
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BP151-500 | |
| PBS | Corning, Inc. | 46-013-CM | |
| EDTA | Sigma-Aldrich, LLC. | 60-00-4 | |
| Sucrose | VWR International, Inc. | 97061-432 | |
| Sodium azide | Amresco, Inc. | 0639-250G | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ethanol | Decon labs, Inc. | v1001 | |
| Dimethylbutane | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 19387-AP | |
| 最佳切割温度化合物（OCT） | VWR International, Inc. | 25608-930 | |
| 专用设备 | |||
| 冷冻切片机 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 14-071-459 | |
| 解剖镊 | Electron Microscopy Sciences | 72700-DZ | |
| 疏水屏障过氧化物酶-抗过氧化物酶笔（PAP） | Vector Laboratories, Inc. | H-4000 | |
| 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss Microscopy, LLC. | LSM 880 | |
| P20 微量移液器 | Gilson, Inc. | F144056M | |
| 解剖剪刀 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08-951-20 | |
| Sylgard 培养皿 | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5424R | |
| 封片材料 | |||
| Fluoromount | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Superfrost plus 载玻片 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1255015 | |
| 免疫染色试剂 | |||
| 正常驴血清 | Jackson ImmunoResearch, Inc. | 017-000-121 | |
| 抗小鼠 FAB 片段 | Jackson ImmunoResearch, Inc. | 715-007-003 | |
| BlokHen | Aves labs, Inc. | BH-1001 | |
| Tuj1（beta-III-微管蛋白）小鼠单克隆抗体 | Biolegend, Inc. | MMS-435P | |
| Sox2 山羊多克隆抗体 | R&D Systems, Inc. | AF2018 | |
| Myo6 兔多克隆抗体 | Proteus Biosciences | 25–6791 | |
| Myo7A 兔多克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PA1-936 | |
| Plexin-B1 山羊多克隆抗体 | R&D Systems, Inc. | AF3749 | |
| 二抗（驴源；Alexa-488、Cy3、Cy5） | Jackson ImmunoResearch, Inc. | 见产品目录 |
参考文献
- Bainbridge, K. E., Hoffman, H. J., Cowie, C. C. Diabetes and hearing impairment in the United States: Audiometric evidence from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999 to 2004 . Ann Intern Med. 149 (1), 1-10 (1999).
- Baiduc, R. R., Helzner, E. P.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
