方法文章

从小鼠肺组织中分离活体髓系细胞和上皮细胞群体

2.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/67648

⸱

2025年1月31日

 , 
1Department of Immunology, Harvard Medical School, 2Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

本文内容

摘要

本方案详细描述了从小鼠肺组织中分离稳态及流感病毒感染后活体免疫细胞和非免疫细胞群体的方法。同时提供了用于鉴定上皮细胞和髓系细胞亚群的设门策略。

摘要

肺部持续暴露于病原体及其他有害环境刺激，因而易受损伤、功能障碍并引发疾病。利用小鼠呼吸系统感染、过敏、纤维化及癌症模型开展的研究，对于揭示疾病进展机制和发现治疗靶点至关重要。然而，目前大多数针对小鼠肺组织的研究主要集中于分离免疫细胞或上皮细胞中的一类，而非同时获取两类细胞群体。本文介绍一种制备包含免疫细胞与非免疫细胞群体的单细胞悬液的实验方法，适用于流式细胞术和荧光激活细胞分选。所获细胞群体包括上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞以及多种髓系细胞亚群。该实验方案包括支气管肺泡灌洗 用dispase进行肺部灌洗并随后膨胀肺组织，然后将肺组织置于liberase混合液中消化。该处理方法可释放多种不同类型的细胞，获得单细胞悬液，无需通过滤膜手动解离，有助于提高细胞存活率，为后续分析提供大量活细胞。在本方案中，我们还定义了在未处理及流感病毒感染的肺组织中上皮细胞和髓系细胞亚群的设门策略。同时分离活的免疫细胞和非免疫细胞，对于研究细胞间相互作用以及深入理解健康与疾病状态下肺部生物学至关重要。

引言

肺由气道、肺泡和间质组成。免疫细胞和非免疫细胞存在于这些区域中，共同维持肺的稳态功能（气体交换）以及抵御环境损伤（如病毒感染）的宿主防御功能。大、小气道，即支气管和细支气管，由上皮细胞衬覆。这些区域的主要上皮细胞为克拉拉细胞（club cells）和纤毛细胞，它们分别负责分泌保护性分子并促进黏液纤毛清除1。肺泡是肺中最远端的结构，由两种上皮细胞类型构成：肺泡I型细胞（ATIs）和肺泡II型细胞（ATIIs）。ATIs负责气体交换，而ATIIs则分泌并回收表面活性物质，以维持适当的表面张力2,3。ATIIs具有自我更新能力，并可在肺损伤后分化为ATIs，这一功能在肺损伤修复过程中尤为重要4。此外，ATIIs为定植于肺泡微环境中的主要免疫细胞类型——肺泡巨噬细胞（AMs）——提供支持性微环境5,6。除了上皮组织外，成纤维细胞、内皮细胞以及间质巨噬细胞（IMs）（可与神经或血管相关联）共同构成间质结构7,8,9,10。在感染和损伤发生时，大量肺细胞死亡，单核细胞和中性粒细胞等免疫细胞浸润至肺组织中11,12。浸润肺组织的单核细胞可分化为巨噬细胞，并可能长期贡献于巨噬细胞区室13。

目前从小鼠 肺组织制备单细胞悬液的方法通常基于胶原酶消化，并需要对组织进行物理性解离14。这种方法可能导致非免疫细胞群体的活细胞数量较低。一些分离上皮细胞的方案采用分散酶（dispase）处理，可获得更高比例的活上皮细胞；然而，这些方案通常未系统评估免疫细胞的得率及其活性15,16,17。流式细胞术是用于区分消化后组织中不同细胞群体的常用方法。在稳态条件下，肺泡巨噬细胞（AMs）、间质巨噬细胞（IMs）、单核细胞和中性粒细胞的流式设门策略界限清晰。然而，在炎症状态下，由于浸润的单核细胞在向巨噬细胞分化过程中表面标志物的表达呈连续性变化，导致设门过程变得多变且难以解读。因此，本文所述方案还提供了在感染后识别目标髓系细胞群体的设门策略。

稳健地分离肺上皮细胞和髓系细胞对于阐明其稳态功能和炎症功能至关重要。一种可平行分离这些细胞区室的方法将有助于对维持健康和驱动疾病的关键细胞类型进行后续分析。本方案工作流程的示意图见图1。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本方案符合哈佛医学院机构动物照护与使用委员会的指南（资助编号：R35GM150816 和 P30DK043351）。实验使用8至12周龄的雌性C57BL/6J小鼠。本方案同样适用于雄性小鼠。本研究中所用试剂与设备的详细信息见于 材料表.

1. 材料准备

  1. 将必要的酶在冰上解冻，包括分散酶（dispase）、胶原酶（liberase）和脱氧核糖核酸酶（DNAse）。
  2. 准备其他必要的试剂。用5 mL含2 mM EDTA的DPBS填充10 mL注射器，并安装27 G针头。用DPBS填充1 mL注射器，并连接导管。

2. 收集肺组织

  1. 通过腹腔注射 400-500 mg/kg 和 25-100 mg/kg 的氯胺酮/赛拉嗪混合物开始对小鼠实施安乐死（遵循机构批准的方案）。当小鼠对足垫夹捏无反应时（约 5 分钟），继续进行解剖。
    注意：使用氯胺酮/赛拉嗪混合物而非二氧化碳进行安乐死，以避免窒息引起的出血和免疫细胞浸润，这些因素可能干扰实验结果。步骤 2.3 作为安乐死的辅助物理方法。
  2. 用 70% 乙醇喷洒小鼠。使用精细手术剪和 #7 镊子解剖小鼠。用剪刀在腹部做切口，并横向剪开腹膜。
    1. 在膈肌上做一个小切口以释放负压。将膈肌和下部肋骨从体腔中剪除，以暴露肺和心脏。
  3. 使用装有 27 G 针头的 10 mL 注射器，以 5 mL 含 2 mM EDTA 的 DPBS 对肺进行灌注。将针头插入心脏基部，从左心室穿入右心室，缓慢推动注射器中的液体完成灌注18。
    注意：灌注应缓慢进行，以防止血管破裂。
  4. 通过剪除肋骨两侧，在胸骨处打开胸腔，然后沿胸骨垂直剪开以暴露气管19。使用精细剪刀和 #7 镊子尽可能去除肌肉和结缔组织，注意不要刺破气管或肺。
  5. 用缝合线（规格 2-0）围绕气管缠绕一圈，如同结扎但暂不收紧。在气管侧壁做一小切口并插入导管。拉紧缝合线，将导管牢固固定。导管插入肺部深度不得超过 1 cm。
  6. 用 1 mL DPBS 充气使肺膨胀。缓慢回抽注射器吸取 DPBS。再次用同一份 DPBS 使肺充气，并再次回抽注射器以收集支气管肺泡灌洗液（BALF）。
  7. 将注射器从导管上断开，保留导管插入状态。将 BALF 排入微量离心管中。
  8. 用 1 mL 分散酶填充同一支 1 mL 注射器，并重新连接至导管。推动注射器使肺被分散酶充盈。在拔出导管的同时，收紧气管周围的缝合线，防止分散酶泄漏。
  9. 横向剪断气管。沿肋骨后方的结缔组织剪开，同时用镊子向上牵拉肺和气管，将肺从体腔中取出。
  10. 将心脏从肺组织中分离。将肺置于含 5 mL DPBS 的容器中，并置于冰上。
  11. 在此步骤中，取分离的 BALF，在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟。上清液可根据需要分装并储存。应可见细胞沉淀，可用 100 µL RPMI 重悬。
    注意：可等待最长 2 小时再进行消化步骤，以便同时处理多只小鼠。

3. 消化肺组织

  1. 配制消化液。每肺加入 83 µg/mL 的 liberase（50 µL 储液）和 100 µg/mL 的 DNAse（15 µL 储液）至 3 mL RPMI 培养基中。
  2. 分离肺的五个肺叶，去除所有结缔组织19,20。在玻片上用剪刀剪切肺组织约 1 分钟。
  3. 用解剖剪将剪碎的肺组织转移至 50 mL 离心管中。将从支气管肺泡灌洗液（BALF）中回收并重悬于 RPMI 培养基中的细胞沉淀加入该离心管中。使用 5 mL 血清移液管向含有样本的离心管中加入 3 mL 消化液。
  4. 用移液器将肺组织消化液轻轻吹打 2–3 次。将离心管置于 37 °C 摇床中，以 140 rpm 转速振荡 40 分钟，消化管倾斜呈 45 度角。

4. 制备单细胞悬液

  1. 从轨道摇床中取出50 mL离心管，置于冰上。用移液器将肺组织消化液上下吹打5-6次。通过70 μm细胞滤筛过滤至新的50 mL离心管中。用10 mL含5% FBS的RPMI培养基冲洗滤筛上残留的细胞，并中和酶活性。
  2. 在4 °C、600 × g条件下离心5分钟。使用真空吸液器或移液器吸除上清液。加入1 mL ACK裂解缓冲液重悬细胞，在室温孵育3分钟以裂解红细胞（RBCs）。加入9 mL PBS，上下吹打混匀。
  3. 在4 °C、600 × g条件下离心5分钟。使用真空吸液器或移液器吸除上清液。用1 mL FACS缓冲液（含1% FBS的PBS）重悬细胞，使用p1000移液器将细胞悬液通过64 μm滤网过滤至微量离心管 中。

5. 流式细胞术及下游分析

  1. 若在96孔板中进行流式细胞术或荧光激活细胞分选，每孔染色约100万至200万个细胞，或肺组织悬液的8%部分。
  2. 离心细胞。所有在96孔板中的离心步骤均应在4 °C条件下以600 × g离心2.5分钟。快速弃去上清液，并用200 μL DPBS重悬细胞进行一次洗涤。再次离心后弃去上清液。
  3. 若细胞需用于流式细胞术分析，请按以下染色程序操作。
    1. 将细胞重悬于25 μL DPBS中，加入活/死细胞Zombie染料（1:150）和Fc阻断剂（1:250），室温避光孵育10分钟。
    2. 在FACS缓冲液中配制2倍浓度的抗体染色混合液。
      注：染色混合液应包含髓系标记物组合（表1）或上皮细胞标记物组合（表2）中所有标记物，且浓度应为指定浓度。
    3. 向板中每孔的25 μL肺组织悬液加入25 μL染色混合液，冰上避光孵育30分钟。此时总染色体积应为50 μL，一抗终浓度为1倍染色浓度。
    4. 加入150 μL FACS缓冲液，于4 °C以600 × g离心2.5分钟，弃去上清液。用200 μL FACS缓冲液洗涤两次。
    5. 如需进行胞内染色，使用胞内固定试剂盒对细胞进行固定 ；如无需胞内染色，可用含4%多聚甲醛（PFA）的DPBS在4 °C固定20分钟。
    6. 用200 μL FACS缓冲液洗涤三次以去除固定剂。样品可在200 μL FACS缓冲液中重悬，于4 °C避光保存2-3天。上机前可加入计数微球以定量细胞数量。
  4. 若需对细胞进行分选，请按以下染色程序操作。
    1. 将细胞重悬于含Fc阻断剂（1:250）的1倍浓度抗体染色混合液中，冰上避光孵育30分钟。
    2. 加入150 μL FACS缓冲液，于4 °C以600 × g离心2.5分钟，弃去上清液。用200 μL FACS缓冲液洗涤三次，分选前将细胞重悬于200 μL FACS缓冲液中。
      注：建议在分选前向细胞中加入活力染料（如DAPI）以评估细胞活性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

成功的消化将获得约2000万至2500万个细胞，细胞活力为90%–95%。若将约25,000个计数微球加入肺组织的8%部分，则微球应占收集事件的1%–3%。在圈选单细胞群体后，约90%–95%的细胞应为Zombie Aqua阴性（表明细胞具有活力）（图2A，图3A）。

在CD45+细胞中，CD64+F4/80+细胞被定义为巨噬细胞（图2B）。在基础状态下，肺中80%–90%的巨噬细胞被定义为肺泡巨噬细胞（AMs，Siglec-F+CD11c+），其余可归类为间质巨噬细胞（IMs，Siglec-F-CD11c-）（图2C）。然而，在感染和炎症期间，这一定义发生变化，此时IM的设门区域将包含单核细胞...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案概述了一种小鼠肺组织消化方法，每只小鼠可分离出约2000万至2500万个细胞，细胞活力可达90%–95%。此外，该方法还可收集支气管肺泡灌洗液（BALF）用于进一步分析。所获得的细胞悬液适用于多种实验技术，包括流式细胞术和荧光激活细胞分选，以分离用于测序或细胞培养的细胞。简而言之，在灌注后收集BALF，并用dispase溶液膨胀肺组织。随后将肺组织剪碎，并在liberase/DNase溶液中进行消化。经过裂解和过滤后，可进行后续实验操作，包括在流感病毒感染期间对髓系和上皮细胞亚群进行流式细胞术分析。

如果无法回收支气管肺泡灌洗液（BALF）和/或肺部不能正常充气，可能是由于导管位置不当所致。如果导管插入气管/支气管过深，可能会穿透组织进入腹膜腔，导致肺部无法充气，并且无法回收BALF。如果肺部已充气，但无法从一个或多个肺叶中抽出液体，则可能是导管偏向一侧支气管所致，此时将导管稍向外退出即可解决该问题。充分的灌注对于清除循环免疫细胞的污染至关重要21。在严重受损的肺组织中，出血和屏障完整性下降会使肺泡更容易因灌注压力而破裂

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了美国国立卫生研究院（R35GM150816 和 P30DK043351）、Charles H. Hood 基金会以及哈佛干细胞研究所的资助。我们感谢 Alexander Mann 及 Franklin 实验室所有其他成员在设计和优化流式细胞术设门策略与分析方面提供的帮助与建议。同时感谢哈佛医学院免疫学流式细胞术核心设施。流式细胞术分析使用 FlowJo 软件完成。图示示意图使用 BioRender 软件绘制。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带滑动接头的1 mL注射器VWRBD309659
1.7 mL 微量离心管DOT ScientificRN1700-GMT
10 mL 移液管（一次性）Fisher Scientific12-567-603
带BD鲁尔锁接头的10 mL注射器VWR75846-756
123计数eBeads计数微球Thermo Scientific01-1234-42
12通道移液器（30–300 µL）USA Scientific 7112-3300
16% 多聚甲醛VWR100503-917
23 G 针头（普通斜面）VWR305194
27 G 针头（普通斜面）VWRBD305109
5 mL 移液管（一次性）Thermo Fisher Scientific170373
50 mL 离心管Olympus 28-108
96孔圆底板Corning3797
ACK裂解缓冲液GibcoA100492-01
Alexa Fluor 488 标记抗小鼠CD11c抗体BioLegend117311
抗F4/80大鼠单克隆抗体（PE（藻红蛋白）/Cy7）BioLegend123114
APC 标记抗小鼠CD64（FcγRI）抗体BioLegend139306
APC/Cyanine7 标记抗小鼠CD45抗体BioLegend103115
BD Insyte Autoguard 防护型静脉导管VWR381423
Brilliant Violet 421 标记抗小鼠I-A/I-E（MHC-II）抗体BioLegend107632
Brilliant Violet 421 标记抗小鼠/人CD11b抗体BioLegend101235
Brilliant Violet 605 标记抗小鼠Ly-6C抗体BioLegend128036
Brilliant Violet 711 标记抗小鼠CD45抗体BioLegend103147
C57BL/6J小鼠 Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) 单克隆抗体 (APA5), PE-Cyanine7, eBioscienceLife Technologies25-1401-82
CD170 (Siglec F) 单克隆抗体 (1RNM44N), PELife Technologies12170280
细胞滤筛Corning352350
离心机EppenodorfCentrifuge 5910R
牛胰脱氧核糖核酸酶I（DNase）Millipore SigmaDN25-100MG以DPBS配制为20 mg/mL储存液，-20 °C保存
中性蛋白酶（Dispase）VWR76176-668解冻一次后分装为1 mL等分试样，-20 °C保存
解剖镊（Dumont #7）Fine Science Tools11297-00
解剖剪刀Fine Science Tools14060-09
DPBSThermo Fisher Scientific14190250
eBioscience 固定试剂盒Life Technologies00-5523-00
EDTALife TechnologiesAM9260G
乙醇VWRTX89125170HU
胎牛血清（FBS）GeminiBio100-106解冻一次后，56°C热灭活，分装后长期保存于-20 °C
FITC 标记抗小鼠CD31抗体BioLegend102406
Gibco RPMI 1640 培养基Fisher Scientific11-875-093
载玻片Fisher Scientific12-552-3
带刻度储液槽USA Scientific 1930-2235
冰桶Corning432128
盐酸氯胺酮注射液（100 mg/mL）Dechra氯胺酮与赛拉嗪安乐死混合液可配制为30 mg/mL盐酸氯胺酮和4.5 mg/mL赛拉嗪的无菌DPBS溶液，最多可保存一个月。
Liberase酶Millipore Sigma5401119001以DPBS配制为5 mg/mL储存液，-20 °C保存
96孔板盖Fisher Scientific07-201-731
轨道摇床培养箱Barnstead Lab-LineSHKE4000
p1000 移液器Eppenodorf3123000063
p1000 吸头USA Scientific 1122-1830
p200 移液器Eppenodorf3123000055
p200 吸头USA Scientific 1110-1700
PE 标记抗小鼠CD326（Ep-CAM）抗体BioLegend118206
PerCP/Cyanine5.5 标记抗小鼠CD104抗体BioLegend123614
PerCP/Cyanine5.5 标记抗小鼠Ly-6G抗体BioLegend127616
Pipet-Aid Drummond4-000-101
纯化抗小鼠CD16/32 抗体BioLegend101302文中称为 "Fc阻断剂"
喷雾瓶VWR23609-182
缝合线（2-0号）VWR100190-026
吸水垫VWR56617-014
Xysed（赛拉嗪100 mg/mL）Pivetal参见上述盐酸氯胺酮说明。 
Zombie Aqua 可固定活力检测试剂盒BioLegend423102

参考文献

  1. Wanner, A., Salathé, M., O'Riordan, T. G. Mucociliary clearance in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 154 (6), 1868-1902 (1996).
  2. Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 81-91 (1977).
  3. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir Res. 2 (1), 33-46 (2001).
  4. Basil, M. C., Alysandratos, K. -D., Kotton, D. N., Morrisey, E. E. Lung repair and regeneration: Advanced models and insights into human disease. Cell Stem Cell. 31 (4), 439-454 (2024).
  5. Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nat Rev Immunol. 14 (2), 81-93 (2014).
  6. Gschwend, J., et al. Alveolar macrophages rely on GM-CSF from alveolar epithelial type 2 cells before and after birth. J Exp Med. 218 (1), e20210745(2021).
  7. Gillich, A., et al. Capillary cell-type specialization in the alveolus. Nature. 586 (7831), 785-789 (2020).
  8. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nat Commun. 10 (1), 3964(2019).
  9. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaat3773(2019).
  10. Tsukui, T., et al. Collagen-producing lung cell atlas identifies multiple subsets with distinct localization and relevance to fibrosis. Nat Commun. 11 (1), 1920(1920).
  11. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nat Immunol. 21 (2), 145-157 (2020).
  12. Johansson, C., Kirsebom, F. C. M. Neutrophils in respiratory viral infections. Mucosal Immunol. 14 (4), 815-827 (2021).
  13. Li, F., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages autonomously determine severe outcome of respiratory viral infection. Sci Immunol. 7 (71), eabj5761(2022).
  14. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101(2019).
  15. Warshamana, G. S., Corti, M., Brody, A. R. TNF-α, PDGF, TGF-β1 expression by primary mouse bronchiolar-alveolar epithelial and mesenchymal cells: TNF-α induces TGF-β1. Exp Mol Pathol. 71 (1), 13-33 (2001).
  16. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 14 (3), 309-315 (1996).
  17. Quantius, J., et al. Influenza virus infects epithelial stem/progenitor cells of the distal lung: Impact on Fgfr2b-driven epithelial repair. PLoS Pathog. 12 (5), e1005544(2016).
  18. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. BIO Protoc. 11 (8), e3988(2021).
  19. Morton, J., Snider, T. A. Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676(2017).
  20. Bijgaart, R. J. E., van den Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo live imaging of lung metastasis and their microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741(2016).
  21. Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. Int Immunopharmacol. 85, 106632(2020).
  22. Short, K. R., et al. Influenza virus damages the alveolar barrier by disrupting epithelial cell tight junctions. Eur Respir J. 47 (3), 954-966 (2016).
  23. Laidlaw, B. J., et al. CD4+ T cell help guides formation of CD103+ lung-resident memory CD8+ T cells during influenza viral infection. Immunity. 41 (4), 633-645 (2014).
  24. D'Agostino, M. R., et al. Protocol for isolation and characterization of lung tissue-resident memory T cells and airway-trained innate immunity after intranasal vaccination in mice. STAR Protoc. 3 (2), 101652(2022).
  25. Waal, A. M., de Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
  26. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Semin Immunopathol. 38 (4), 461-469 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章