使用扩增辅助迭代荧光原位杂交对完整果蝇大脑中的基因表达进行多重检测

Summary

扩增辅助迭代荧光原位杂交 （EASI-FISH） 是一种强大的技术，它将扩增显微镜与荧光原位杂交 （FISH） 相结合，以检测厚组织中多个基因的表达。该协议概述了该方法的最新进展及其对标记完整果蝇中枢神经系统的适应性。

Abstract

了解基因表达对于破译细胞功能至关重要。然而，分析给定组织内许多基因原位表达的方法仍然有限。此处描述的 EASI-FISH 方案已适应使用市售试剂检测完整成体果蝇中枢神经系统 （CNS） 中数十个基因的表达。该实验方案包括一种新的凝胶配方，可增强凝胶的稳定性，实现多轮杂交，并允许每块凝胶包埋多个大脑。这种改进提高了通量，促进了实验条件的最佳比较，并降低了试剂成本。此外，通过使用 GAL4-UAS 系统共检测绿色荧光蛋白 （GFP），可以在特定的神经元或神经胶质细胞类型中可视化基因表达。值得注意的是，通过扩增显微镜实现的高分辨率与该方法的灵敏度相结合，可以检测单个 RNA 转录本。这种方法有效地将高图像质量与高通量相结合，使其成为研究整个完整果蝇大脑基因表达的强大工具。

Introduction

FISH 于 40 多年前首次用于果蝇，用于绘制多线染色体上的基因^1，2。如今，单分子 FISH 是在完整组织中空间定位和定量 mRNA 转录本的金标准³。然而，由于样品完整性和 RNA 损失的问题，果蝇中的全安装单分子 FISH 技术仅限于可以在同一样品中分析的少数基因^{4，5，6，7}。虽然条形码的最新发展（例如^8，9，10）将可检测到的转录本数量增加到数百个，即使在厚组织中也是如此^11，12，但建立此类协议需要投入大量资源，这可能是实施的障碍。事实上，许多创造性的空间转录组学技术从未传播到其起源机构之外¹³。因此，一种简单且相对便宜的方法来检测同一完整大脑中数十个基因的表达将有助于各种研究目标：验证 RNA 序列和细胞图谱数据，绘制整个 CNS 的分子细胞类型，量化基因表达的发育、性别或物种特异性差异，或测量由果蝇中可用的多种遗传或环境扰动诱导的基因表达变化。

扩增显微镜是一种技术，允许研究人员通过在可膨胀的水凝胶中扩增组织^{14 来以更高的分辨率观察组织}。EASI-FISH 结合了扩增显微镜和 RNA FISH¹⁵，它利用杂交链反应 （HCR） 一种非酶技术来检测寡核苷酸探针结合¹⁶。EASI-FISH 最初是作为薄组织 FISH 的替代方法开发的，用于绘制小鼠下丘脑外侧厚 （300 μm） 组织切片中数十个基因的表达模式¹⁷。鉴于该组织的厚度小于 300 μm，并且最近描述了原型苍蝇 EASI-FISH 协议，因此该方法非常适合应用于成年果蝇大脑¹⁸。在这里，解剖和固定的果蝇大脑嵌入可膨胀的水凝胶中，其中 mRNA 和蛋白质分别与烷化剂 Melphalan-X 和 Acryloyl-X （Ac-X） 共价锚定到凝胶聚合物上。蛋白质消化后，允许大脑的各向同性扩增，基因特异性 DNA 寡核苷酸探针与组织中的 mRNA 杂交，以定位目标转录本。然后在第二个杂交步骤中添加荧光标记的 DNA 发夹。多个发夹分子在 HCR 反应中聚合形成亚稳态 DNA 聚合物。这导致单个转录本的信号放大，这可以通过光片或共聚焦显微镜检测为亮点。

mRNA 和蛋白质的共价锚定到凝胶基质上，以及凝胶形成后蛋白质的蛋白水解消化创造了一个 mRNA 转录本相对稳定且可能更容易被探针结合的环境。mRNA 和凝胶的稳定性允许进行多轮重新探测和成像，通过在轮次之间与 DNase1 酶孵育来剥离 DNA 探针和 HCR 产物^15，17。此外，样品的膨胀通过分子去拥挤减少了自发荧光和光散射，并有效地提高了图像分辨率¹⁴。因此，可以更容易地解析单个 mRNA 转录本。

GFP 充分维持该过程，以保持可通过荧光或扩增后抗体结合检测到。因此，该报告基因可用于标记和分割感兴趣的细胞类型。结合许多可用的神经元特异性分裂 GAL4 驱动线（例如，^19，20），这为进一步了解神经元类型的分子身份或识别无法通过其解剖结构轻松区分的分子亚型提供了可能性。

这里描述的是原型蝇 EASI-FISH 方案的更新版本¹⁸，它具有出色的 mRNA 保留能力，消除了技术难题，并且凝胶的稳定性更高。修饰包括增加 PFA 浓度、降低固定温度，以及通过在与 Melphalan-X 和 Ac-X 孵育之前安装大脑来促进样品制备。该方案还采用了一种新的凝胶配方来提高凝胶的稳定性，从而在进行多轮 FISH 和成像时有效减少凝胶损伤。这些修改使方案更易于执行，减少了处理时间和试剂使用量，并增强了对一致结果的信心。重要的是，多路复用的能力得到了提高，因此可以在几个月内在同一大脑中研究数十个基因。成年果蝇大脑中几个神经元基因在一系列表达水平上的表达模式说明了这一点。

Protocol

该方案是在成年（5-6 天大）黑腹果蝇雌性上执行的，但任何性别或果蝇物种都适用。有关凝胶锚定配方，请参见补充表 1;对于凝胶配方，补充表 2;对于其他 EASI-FISH 试剂，补充表 3。有关日常材料和试剂指南，请参见补充表 4。对于光片显微镜凝胶支架，参见补充文件 1。图 1A-C 显示了在扩增和探针杂交（步骤 2.1 至 3.8）之前大脑包埋在凝胶中的示意图。图 1D 是嵌入大脑的照片，图 1E 显示了用于光片显微镜的凝胶支架，图 1F 描述了典型实验的时间线。材料表中列出了试剂和所用设备的商业细节。

1. 苍蝇脑解剖与固定

1. 在冷 S2 培养基中解剖苍蝇脑或 CNS（有关更多解剖详细信息，请参阅 reference²¹）
2. 要修复大脑，将最多 20 个大脑或 10 个 CNS 添加到 2 mL 冷的 4% PFA/PBS 中，并在 4°C.
   的章动器上孵育过夜 注意：吞咽或吸入 PFA 有害，对皮肤和眼睛有刺激性，并可能致癌。
3. 用 2 mL 冷 PBT（0.5%，见补充表 4）冲洗样品 （1x），然后在 4 °C 下用 2 mL 冷 PBT （4x） 在章动器上洗涤样品 15 分钟。
4. 用 2 mL 冷的 70% 乙醇冲洗样品 （1x）。将大脑在 4 °C 的 2 mL 70% EtOH 中储存长达 6 个月。

2. 安装大脑并添加 RNA 和蛋白质接头（第 1 天）

注意：请始终佩戴手套，并始终使用 RNase Away 擦拭设备和工作区。需要戴手套 （1） 以防止 RNase 接触样品，以及 （2） 防止多种对健康造成危害的试剂。

1. 用 RNase 去污试剂擦拭不带电的载玻片，准备凝胶室。去除硅胶垫圈上保护粘合剂的不透明薄膜，将垫圈（最多 4 个腔室）粘附在载玻片上，并使用 P20 移液器吸头用 1 μL 聚赖氨酸涂覆每个腔室表面。风干并重复该过程。
   注意：步骤 2.1 可以在前一天完成。
2. 将脑转移到 0.2 mL PCR 管中（每管最多 4 个脑），并在 150 μL PBT （0.1%） 中再水化 （2x） 5 分钟，在 PBS 中再水化 （2x） 5 分钟。
3. 要安装大脑，每个腔室添加 40 μL PBS，然后用细镊子轻轻地将大脑排成一排插入腔室中央，在大脑之间留出一些空间（参见图 1D）。每个腔室最多可安装 6 个大脑或 2 个 CNS。
4. 去除 PBS 并立即加入 50 μL 20 mM MOPS 缓冲液。在室温 （RT） 下孵育 30 分钟。
5. 当大脑在 MOPS 缓冲液中平衡时，解冻美法伦-X 和 Ac-X 储备溶液，每个腔室准备 75 μL 美法伦-X/Ac-X 溶液（用 MOPS 缓冲液以 1：1 稀释美法伦-X 储备液，并以 1：100 添加 Ac-X）。涡旋并短暂旋转以收集溶液;安排制备时间，使溶液在 30 分钟孵育时间结束时准备好，而不是更早。
   注意：吞咽或吸入美法仑-X 有害，对皮肤和眼睛有刺激性，并可能致癌。
6. 去除所有 MOPS 缓冲液并加入 50 μL 美法仑-X/Ac-X 溶液。
7. 通过在顶部放置盖玻片来覆盖腔室，但不要使用垫圈粘合剂进行密封。将腔室放入加湿箱中，并在室温下避光孵育过夜。

3. 凝胶化和蛋白酶 K 消化（第 2 天）

1. 小心地取下盖玻片和美法仑-X/Ac-X，用 100 μL PBT （0.1%） 洗涤封固的大脑 （2x） 2 分钟，用 100 μL PBS （1x） 洗涤 2 分钟。
2. 解冻 TREx-1000 溶液、4HT、TEMED 和 APS><，并保持在冰上。 注：TREx-1000 可在 -20 °C 下沉淀;解冻后充分涡旋以完全溶解><。 注意：这些试剂吞咽或吸入时有害或有毒，对皮肤和眼睛有刺激物。
3. 通过将 TREx-1000 与 4HT、TEMED 和 APS 以 94：2：2：2 的比例混合来制备凝胶溶液。涡旋并保持在冰上。对于每个腔室，准备 150 μL 凝胶溶液。
4. 用移液器吸头从腔室中取出 PBS，然后用无绒湿巾小心地吸走任何残留的 PBS。对于每个腔室，立即在大脑顶部添加 40 μL 凝胶溶液。在 4 °C 下孵育 10 分钟。
5. 取出凝胶溶液，加入 40 μL 新鲜凝胶溶液，在 4 °C 下再孵育 10 分钟
   注：将凝胶废液收集在微量离心管中，并在丢弃前聚合。
6. 去除凝胶溶液并撕下垫圈表面粘合剂上的透明保护膜。加入最后 45 μL 的新鲜凝胶溶液，轻轻地将盖玻片放在腔室上，避免捕获任何气泡。按下盖玻片以密封腔室并在 4 °C 下孵育 10 分钟（在 4 °C 下平衡总共 30 分钟）。
7. 将凝胶在 37 °C 下聚合 1.5 小时。
8. 凝胶凝固后，让它们在工作台上冷却几分钟。小心地取下盖玻片，然后用新的剃须刀片取下硅胶垫圈。接下来，将凝胶修剪成矩形并切开右上角以跟踪样品方向。
9. 用蘸有少量 ProK 缓冲液的细刷从载玻片上去除凝胶，然后单独转移到 2 mL 微量离心管中。
10. 将每块凝胶与 500 μL ProK 缓冲液和 5 μL ProK 酶 （1：100） 在 37 °C 下孵育过夜。

4. DNA 消化和探针杂交（第 3 天）

1. 用 1 mL PBS 在 RT.
   下洗涤凝胶 （3x） 10 分钟 注：更换溶液时，请使用细头移液管，以避免损坏凝胶。
2. 将凝胶在 37 °C 下在 1 mL DNase1 缓冲液中孵育 30 分钟。
3. 将 50 μL DNase1 酶添加到 450 μL DNase 缓冲液中。轻轻混合，但不要涡旋。将每块凝胶在 500 μL DNase1 中孵育 2 小时 37 °C。用 1 mL PBS 在 RT.
   洗涤 （4x） 15 分钟 注：凝胶可以在 DNase 消化/洗涤之前或之后在 4 °C 的 5x SSC 中储存数周。
4. 解冻杂交 （hyb） 和探针洗涤缓冲液。将凝胶在 500 μL 无探针的 hyb 缓冲液中于 37 °C 下孵育 30 分钟><。 注意：hyb 和探针洗涤缓冲液含有甲酰胺，怀疑可致癌。
5. 在 hyb 缓冲液 （10 nM） 中以 1：100 的比例稀释探针，每块凝胶制备 300 μL。将凝胶与 hyb 缓冲液和探针在 37 °C 下孵育过夜。将探针洗涤缓冲液和 PBS 保持在 37 °C。

5. 探针清洗（第 4 天）

1. 在 37 °C 下用 750 μL 探针洗涤缓冲液洗涤凝胶 （3x） 30 分钟。
2. 在 37 °C 下用 1 mL PBS 洗涤凝胶 （3x） 30 分钟，然后 （3x） 洗涤 1 小时。
3. 在 RT 下在 2 mL PBS 中洗涤凝胶过夜或在周末在 4 °C 中洗涤凝胶。

6. 荧光发夹的杂交链式反应 （HCR）（第 5 天）

注意：有关 HCR 原则，请参见 reference²²。

1. 在 RT 下将凝胶在 500 μL 扩增 （amp） 缓冲液中孵育 30 分钟。
2. 在 PCR 机器中将荧光发夹在 95°C 下加热 90 秒，然后迅速冷却至 25°C 30 分钟。
3. 对于每个探针，在 amp 缓冲液中以 1：50 稀释匹配的发夹对（h1 和 h2），每块凝胶制备 300 μL 并涡旋。
4. 将凝胶与发夹混合物在 RT 下在黑暗中孵育 3 小时。
5. 在 RT 下，用 750 μL 的 5x SSCT 洗涤凝胶 （2x） 15 分钟，用 1 mL 的 0.5x SSCT 洗涤凝胶 （2x） 30 分钟。
6. 如果大脑表达 GFP，则在含有 5 mg/mL 超纯 BSA 的 PBT （0.1%） 中用 500 μL 抗 GFP-AF488 抗体 （1：500） 染色，并在 4 °C 下孵育过夜（或周末）。

7. 凝胶封片和成像（第 6 天）

1. 抗体孵育后，冲洗凝胶一次，用 1 mL PBT （0.1%） 洗涤 （1x） 30 分钟，然后用 1 mL PBS 洗涤 （3x） 30 分钟><。 注意：在 PBS 中洗涤将导致 2 倍膨胀;对于 3 倍膨胀，用 0.05 倍 SSC 洗涤。
2. 洗涤时，用 1 μL 聚赖氨酸涂覆光片显微镜凝胶支架的凝胶附着表面两次，使其在两次涂层之间在 37 °C 下干燥。同样，对于共聚焦成像，在玻璃底培养皿的凝胶附着区域涂覆聚乙烯赖氨酸。
3. 在 RT 中用 1 mL 5 μg/mL DAPI/PBS 或 DAPI/0.05x SSC 对凝胶染色 30 分钟，或者在 4 °C 下染色过夜。
4. 要将凝胶安装在凝胶支架（光片显微镜）或玻璃底培养皿（共聚焦显微镜）上，请将凝胶放在盖玻片上，并用无绒布小心擦干边缘。确保凝胶的方向使组织最接近物镜。使用画笔，轻轻地将凝胶轻轻地放在聚赖氨酸表面上。对于成像，将凝胶浸泡在 PBS 中（如果扩展到 3x><，则为 0.05x SSC）。 注：成像后，可以用湿画笔轻轻地从聚赖氨酸表面去除凝胶，并转移到 2 mL 微量离心管中。
5. 要立即重新探测，请继续进行第 7 天。对于长期储存（1 周至 6 个月），将凝胶储存在 4 °C 的 1 mL 5x SSC 中。准备使用时，用 1 mL PBS 洗涤凝胶 （3x） 10 分钟><，然后再继续。 注：在所描述的缓冲液中，扩增程度通常是一致的（PBS 中为 ~2 倍，0.05 倍 SSC 中为 ~3 倍）。为了检查膨胀因子，请在荧光立体显微镜拍摄的图像中测量膨胀前后大脑的大小。为了在扩张后可视化大脑，请用 DAPI 对其进行短暂染色。近似膨胀因子是膨胀后的大小除以膨胀前的大小。

8. 剥离探针和发夹以进行多路复用（第 7 天）

1. 将凝胶在 37°C 下在 1 mL DNase1 缓冲液中孵育 30 分钟。
2. 将 50 μL DNase1 添加到 450 μL DNase 缓冲液中。轻轻混合，但不要涡旋。将凝胶在 500 μL DNase1 中于 37 °C 孵育 2 小时。
3. 在 RT 下用 1 mL PBS 洗涤 （4x） 15 分钟。凝胶现在已准备好进行下一轮杂交（第 3 天，第 6 步）。

Results

通过检测成体果蝇大脑中几种不同神经递质相关基因和神经肽基因的表达，证明了这种改进的 EASI-FISH 方案的性能。通常，凝胶化和扩增的大脑与每轮 2 或 3 个探针杂交，然后是带有发夹对的 HCR，与 Alexa Fluor （AF） 488（除非表达 GFP）、AF546 和 AF647 或 Janelia Fluor （JF） 669 偶联。成像主要在光片显微镜上进行，获取单个 z 堆栈或多个拼接在一起以包含整个大脑的图块。还使用共聚焦显微镜采集了单个 z 堆栈（详见图 2图 2 和 图 3）的图例）。

图 2 显示了在果蝇大脑中表达的神经递质相关基因（VGluT、Gad1、Tdc2）和神经肽基因（AstA、Crz、Tk）的例子。在同一轮杂交 （VGluT/Gad1 和 AstA

Discussion

所描述的针对完整果 蝇 神经系统的EASI-FISH方案能够检测同一大脑或中枢神经系统中的数十个转录本。它稳健、简单且灵敏，可以与 GFP 检测相结合，以识别神经元或神经胶质细胞的子集。由于这种方法易于实施，它应该有助于果 蝇 实验室的研究，这些实验室对绘制和量化完整苍蝇大脑中的基因表达感兴趣。

与以前不包括膨胀显微镜的 FISH 方案相比，EASI-FISH 具有多种优势。正如之前在小鼠组织中报道的那样，在多轮 FISH 中观察到出色的 RNA 稳定性¹⁷。这可能是由于 mRNA 锚定到凝胶基质上，以及组织来源的 RNase 的锚定和部分消化。与其他已发表的方案^5,7,25类似，在4°C下将组织固定在4%PFA中（原型方案在室温下使用2%PFA固定1小时¹⁸，

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR 管	美国科学	1402-4700
0.5 mL 螺口盖微量离心管，Amber	USA Scientific	1405-9707
0.5 M EDTA，PH 8，不含 RNase	的 Invitrogen	AM9260G
10 M NaOH	Sigma	72068
10x PBS	Fisher	BP 3994
20x SSC	ThermoFisher	AM 9763
40% 丙烯酰胺	Bio-Rad	1610140
4-羟基-TEMPO （4HT）	Sigma	176141
5 M NaCl 无 RNase	Thermofisher	AM97060G
5 ml 移液管 - 细尖	Global Scientific	134070-S20
6 孔玻璃底板	Cellvis	P06-1.5H-N
无水乙腈	ThermoFisher	042311-K7
丙烯酸	TCI	A0141
烯酰-X	ThermoFisher	A20770
过硫酸铵 （APS）	Sigma	A3678
扩增缓冲液	Molecular Instruments	https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
无水 DMSO	Invitrogen	D12345
AstA_B2	分子仪器	PRR477
ChAT_B1	分子仪器	PRG115
Crz_B5	仪器	PRR480
DAPI	Sigma	D9542
斐济	开源	https://imagej.net/software/fiji/
FMRFa_B2	Molecular Instruments	PRR487
GAD1_B5	Molecular Instruments	RTE581
GFP 多克隆抗体、Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21311
杂交缓冲液	分子仪器
Imaris Stitcher	牛津仪器	https://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher
Imaris 查看器	仪器	https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer
JF-669， SE	Tocris	6420
美法兰	开孟化学品	16665
MOPs 缓冲器	Fisher	BP308-100
N，N 亚甲基-双丙烯酰胺	Bio-Rad	1610142
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺 （TEMED）	Sigma	T22500
无核酸酶水	Ambion	AM9932
寡核苷酸探针	分子仪器	https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
多聚甲醛 （PFA）	EMS	15710
PBS	Fisher
Photoflo-200	EMS	74257
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（聚赖氨酸）	Sigma	P1524
探针洗涤缓冲液	分子仪器	https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish
K	NEB	P8107S
QIAquick Nucleotide Removal Kit	Qiagen	28306
RNase Away	ThermoFisher	7003，去污试剂
不含 RNase 的 DNase1	Qiagen	79254
S2 培养基	ThermoFisher	21720024
硅胶垫片	Invitrogen	P24743
Tdc2_B5	分子仪器	RTE880
Tk_B5	Molecular Instruments	PRR484
UltaPure 10% SDS	Thermofisher	15553027
Ultrapure BSA	ThermoFisher	AM2616
非偶联和 Alexa 荧光偶联发夹	分子仪器
VAChT_B1	分子仪器	RTA904
vGLUT_B2	分子仪器	RTB212
Zeis Z7 凝胶支架	珍妮莉亚	可根据要求提供
蔡司 LSM 980 共聚焦 倒置显微镜	蔡司	https://www.janelia.org/node/46947/#lsm980
蔡司 Z7 光片显微镜	蔡司	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html