扩增辅助迭代荧光原位杂交（EASI-FISH）是一种强大的技术，结合了扩增显微镜与荧光原位杂交（FISH），用于在厚组织中检测多个基因的表达。本方案概述了该方法的最新进展及其在完整Drosophila中枢神经系统标记中的应用。
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方法文章
完整组织中基因表达的多重检测 果蝇 利用扩增辅助迭代荧光技术研究大脑 原位 杂交
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
理解基因表达对于解析细胞功能至关重要。然而，分析大量基因表达的方法 原位 在特定组织内的研究仍然有限。本文所述的EASI-FISH方案已改进用于在完整成年组织中检测数十个基因的表达 果蝇 使用市售试剂对中枢神经系统（CNS）进行全脑范围的基因表达成像。本方案包含一种新型凝胶配方，可增强凝胶的稳定性，支持多轮杂交反应，并允许在单个凝胶中包埋多个大脑样本。该改进显著提高了实验通量，便于对不同实验条件进行优化比较，同时降低了试剂成本。此外，通过采用GAL4-UAS系统实现绿色荧光蛋白（GFP）的共检测，可在特定神经元或胶质细胞类型中可视化基因表达。值得注意的是，结合扩展显微镜技术所达到的高分辨率与本方法的高灵敏度，能够检测到单个RNA转录本。该方法有效整合了高成像质量与高通量优势，成为研究完整果蝇大脑中基因表达的强大工具。 关键词：中枢神经系统（CNS），扩展显微镜，基因表达，RNA检测，GAL4-UAS系统，绿色荧光蛋白（GFP），果蝇大脑，高通量，单分子RNA成像
引言
荧光原位杂交（FISH）技术最早在 40 多年前被用于在果蝇（Drosophila）的多线染色体上进行基因定位1,2。如今，单分子 FISH 已成为在完整组织中对 mRNA 转录本进行空间定位和定量的金标准3。然而，由于样本完整性问题和 RNA 丢失，果蝇（Drosophila）中的整体封片单分子 FISH 技术仅限于在同一样本中分析少数几个基因4,5,6,7。尽管近年来条形码技术的发展（例如8,9,10）使得即使在较厚的组织中也能检测到数百种转录本11,12，但建立此类实验方案需要投入大量资源，这可能成为推广应用的障碍。事实上，许多创新的空间转录组学技术从未走出其原始研发机构<....
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方案
本实验方案适用于成年（5-6日龄）雌性Drosophila melanogaster，但也可应用于任何性别或Drosophila物种。关于凝胶锚定剂配方，请参见补充表1；凝胶配方请参见补充表2；其他EASI-FISH试剂请参见补充表3。每日所需材料与试剂指南请参见补充表4。关于 光片显微镜用凝胶支架，请参见 补充文件1。 图1A-C 示意性展示了大脑在凝胶中包埋的过程（在膨胀和探针杂交之前，步骤2.1至3.8） 。图1D 为包埋后脑组织的照片，图1E 展示了用于光片显微镜的凝胶支架，图1F 描绘了一次典型实验的时间线。所用试剂和设备的商业信息列于材料表中。
1. 果蝇脑解剖与固定
- 在冰冷的 S2 培养基中解剖果蝇大脑或中枢神经系统（更多解剖细节参见参考文献
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结果
通过多轮实验检测成年Drosophila大脑中多种不同神经递质相关基因及神经肽基因的表达，展示了该改良版EASI-FISH方案的性能。通常每轮实验中，对凝胶化并扩增的大脑样本使用两到三种探针进行杂交，随后采用与Alexa Fluor（AF）488（除非存在GFP表达）、AF546、AF647或Janelia Fluor（JF）669偶联的发夹探针对进行HCR扩增。成像主要在光片显微镜上完成，获取单个z轴层扫图像或多个拼接后的图块，以覆盖整个大脑。部分单z轴层扫图像也通过共聚焦显微镜获取（详见图2和图3图注中的说明）。
图2 显示神经递质相关联的示例 基因VGluT，Gad1，Tdc2）和神经肽基因（AstA，Crz，Tk) 在其中表达的 果蝇 脑组织。转录本在同一次杂交过程中共同被检测到（VGluT
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讨论
所述用于完整样本的EASI-FISH方案 黑腹果蝇 神经系统能够在同一脑组织或中枢神经系统中检测数十种转录本。该方法具有稳健、简便和高灵敏度的特点，可与GFP检测联合使用，以鉴定特定的神经元或胶质细胞亚群。由于该技术易于实施，有望推动相关研究的开展 果蝇 对完整果蝇大脑中基因表达进行定位与定量研究感兴趣的实验室。
EASI-FISH 相较于未结合扩增显微技术的先前 FISH 方案具有多项优势。如先前在小鼠组织中所报道，该方法在多轮 FISH 操作中均表现出优异的 RNA 稳定性17这可能是由于mRNA与凝胶基质的结合，以及组织来源的RNase被结合并发生部分降解所致。与其他已发表的方案类似5,7,25，组织在4% PFA中于4°C固定（原始方案使用2% PFA在室温下固定1小时）.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 Paul Tillberg 在扩展显微镜技术动力学方面的建议，感谢 Christina Christoforou 在脑组织解剖方面的帮助，以及 Geoffrey Meissner 提供的宝贵反馈意见。我们进一步感谢 Tanya Wolff 和 Gerry Rubin，以及 Geoffrey Meissner 和 Wyatt Korff，允许我们纳入作为两项更大规模研究组成部分所获得的结果。所有工作均在珍利亚研究园区完成，并由霍华德·休斯医学研究所为多荧光原位杂交（MultiFISH）和果蝇扩展荧光原位杂交（Fly-eFISH）项目团队、Gerry Rubin 及项目技术资源团队提供资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 mL PCR管 | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 0.5 mL螺口微量离心管，琥珀色 | USA Scientific | 1405-9707 | |
| 0.5M EDTA，pH 8，无RNase | Invitrogen | AM9260G | |
| 10M NaOH | Sigma | 72068 | |
| 10x PBS | Fisher | BP 3994 | |
| 20x SSC | ThermoFisher | AM 9763 | |
| 40%丙烯酰胺 | Bio-Rad | 1610140 | |
| 4-羟基-TEMPO（4HT） | Sigma | 176141 | |
| 5 M NaCl，无RNase | Thermofisher | AM97060G | |
| 5 mL移液管，细尖头 | Global Scientific | 134070-S20 | |
| 6孔玻璃底培养板 | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| 无水乙腈 | ThermoFisher | 042311-K7 | |
| 丙烯酸 | TCI | A0141 | |
| 丙烯酰基-X | ThermoFisher | A20770 | |
| 过硫酸铵（APS） | Sigma | A3678 | |
| 扩增缓冲液 | Molecular Instruments | https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish | |
| 无水DMSO | Invitrogen | D12345 | |
| AstA_B2 | Molecular Instruments | PRR477 | |
| ChAT_B1 | Molecular Instruments | PRG115 | |
| Crz_B5 | Molecular Instruments | PRR480 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| FIJI | 开源软件 | https://imagej.net/software/fiji/ | |
| FMRFa_B2 | Molecular Instruments | PRR487 | |
| GAD1_B5 | Molecular Instruments | RTE581 | |
| GFP多克隆抗体，Alexa Fluor 488标记 | ThermoFisher | A-21311 | |
| 杂交缓冲液 | Molecular Instruments | https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish | |
| Imaris Stitcher | Oxford Instruments | https://imaris.oxinst.com/products/imaris-stitcher | |
| Imaris Viewer | Oxford Instruments | https://imaris.oxinst.com/imaris-viewer | |
| JF-669, SE | Tocris | 6420 | |
| 美法仑 | Cayman Chemicals | 16665 | |
| MOPs缓冲液 | Fisher | BP308-100 | |
| N,N-亚甲基双丙烯酰胺 | Bio-Rad | 1610142 | |
| N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED） | Sigma | T22500 | |
| 无核酸酶水 | Ambion | AM9932 | |
| 寡核苷酸探针 | Molecular Instruments | https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish | |
| 多聚甲醛（PFA） | EMS | 15710 | |
| PBS | Fisher | BP24384 | |
| Photoflo-200 | EMS | 74257 | |
| 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（聚赖氨酸） | Sigma | P1524 | |
| 探针洗涤缓冲液 | Molecular Instruments | https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish | |
| 蛋白酶K | NEB | P8107S | |
| QIAquick核苷酸去除试剂盒 | Qiagen | 28306 | |
| RNase Away | ThermoFisher | 7003，去污染试剂 | |
| 无RNase的DNase1 | Qiagen | 79254 | |
| S2培养基 | ThermoFisher | 21720024 | |
| 硅胶垫圈 | Invitrogen | P24743 | |
| Tdc2_B5 | Molecular Instruments | RTE880 | |
| Tk_B5 | Molecular Instruments | PRR484 | |
| UltraPure 10% SDS | Thermofisher | 15553027 | |
| 超纯BSA | ThermoFisher | AM2616 | |
| 未标记及Alexa Fluor标记发夹探针 | Molecular Instruments | https://store.molecularinstruments.com/new-bundle/rna-fish | |
| VAChT_B1 | Molecular Instruments | RTA904 | |
| vGLUT_B2 | Molecular Instruments | RTB212 | |
| Zeiss Z7凝胶支架 | Janelia | 可应要求提供CAD文件 | |
| Zeiss LSM 980共聚焦倒置显微镜 | Zeiss | https://www.janelia.org/node/46947/#lsm980 | |
| Zeiss Z7光片显微镜 | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html |
参考文献
- Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on phila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA. 79 (14), 4381-4385 (1982).
- Gall, J. G. The origin of in situ hybridization - A personal history. Methods. 98, 4-9 (2016....
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重印与许可
