本文介绍了一种可及的、开源的微流控工作流程，用于并行分析细菌中的质粒保留情况。该方法利用荧光显微镜对凝胶微滴内单细胞微菌落中的质粒存在进行定量，为传统的平板计数法提供了一种精确、便捷且可扩展的替代方案。
本文内容
摘要
摘要
质粒在合成生物学中发挥着至关重要的作用，能够将外源基因导入多种生物体并实现其表达，从而促进细胞群体内部及细胞群体之间生物回路和通路的构建。在许多应用中，维持质粒功能而不依赖抗生素筛选至关重要。本研究介绍了一种基于开源硬件的微流控工作流程，通过在凝胶微滴中培养单细胞，并利用荧光显微镜对微菌落进行定量，以分析质粒保留情况。该方法可并行分析大量微滴和微菌落，相比传统平板计数法具有更高的统计效力，并可将该检测方法整合到其他微滴微流控工作流程中。通过使用表达荧光蛋白的质粒并结合非特异性荧光DNA染料，可根据质粒丢失或荧光标记表达情况识别并区分单个菌落。值得注意的是，该先进工作流程采用开源硬件实现，可对样品和微流控芯片进行精确的流体控制和温度管理。这些特性显著提升了工作流程的易用性、稳健性和可及性。尽管本研究以大肠杆菌（Escherichia coli）作为实验模型，但该方法的真正潜力在于其广泛的适用性。该方法可适用于多种需要对质粒或染料荧光信号进行定量的研究，也可拓展至其他应用领域。采用开源硬件有助于在多样化的研究环境中，利用可及的技术开展高通量生物分析。
引言
质粒是原核细胞中重要的遗传元件，通过水平DNA转移和快速适应环境变化，在微生物进化中发挥着重要作用1,2。这些染色体外的DNA分子携带赋予有利性状的基因，例如抗生素抗性、代谢功能和毒力因子，因此在微生物学研究、合成生物学和进化研究中具有重要价值2。然而，由于复制和分离过程带来的代谢负担，质粒在细胞群体中的维持具有挑战性，通常在缺乏选择压力的情况下会导致质粒丢失3。此外，稳定的遗传需要依赖毒素-抗毒素系统和分配系统等机制，这进一步增加了质粒维持的复杂性。评估不同条件下质粒的稳定性，对于以质粒为主要研究工具的基础研究和实际应用均至关重要4,5。目前大多数评估质粒稳定性的方法存在显著局限性：基于流式细胞术的方法仅能提供间接的群体水平数据，需要昂贵的设备，且无法直接观察菌落形态6；整体转录组学和蛋白质组学方法成本高昂，仅能反映细胞的平均响应，无法直接量化单个菌落中的质粒保留情况6；传统的连续稀释和传代方法虽然简单 但耗时较长，且缺乏精确性和代表性7。总体而言，定量推断或预测在时间推移或选择压力下仍保留特定功能性质粒的菌落数量仍然具有挑战性。
为应对这些挑战，本文介绍了一种利用开源硬件科研仪器的新型微流控工作流程，以大肠杆菌（Escherichia coli）为模型，对多个独立的细菌菌落中的荧光信号进行定量分析。该方法能够在不同条件或选择性压力下，实现对质粒保留情况的高通量且精确的分析。单细胞分辨率分析提供了一种精确操控独立菌落的方法，可获得敏感的质粒定量数据，有助于评估质粒的保留率与丢失率4。
微流控技术，特别是液滴微流控技术，已成为在受控环境中包封和操控单个细胞的有力工具8具体而言，微凝胶液滴可包封单个细胞，实现高通量且精确的分析，且无需将液滴悬浮于油相中进行维持9，从而允许一个 在明确定义的微环境中对质粒动态进行的对照研究。在将细胞悬液直接从移液管尖端封装之后10，荧光技术可用于监测液滴内微菌落的生长，从而在不同选择压力下对质粒的保留与分离进行详细分析3.
与传统批量培养技术相比，该方法的优势包括更高的精确度、更低的变异性，以及能够进行高通量分析。开源微流控技术克服了昂贵的专有系统在可及性、适应性和维护方面存在的局限性，而这些因素常常阻碍研究进展11,12,13。通过展示如何在微凝胶中利用开源仪器实现质粒保留分析的先进实验流程，本研究为质粒生物学、合成生物学应用以及微流控液滴分析技术的研究提供了一种易于获取且可靠的方法。
总之，本文介绍了一种可及的方法，用于定量评估质粒在 E. coli 具有高统计功效。该方法的能力使其成为推进质粒生物学认知和改进合成生物学应用的有力工具。
方案
图1展示了在E. coli中评估质粒稳定性的示意图。材料表中列出了所用试剂和设备的详细信息。原始数据和可视化脚本可在 https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK 获取。
图1：评估质粒稳定性的逐日实验方案 E. coli蓝色箭头表示白天进行的步骤，紫色箭头表示过夜孵育。所有液体和琼脂培养均在 37 °C 同时设置一个独立的阴性对照管/板。需要注意的是，对于可能已经发生质粒丢失的实际样本，无需进行细胞培养准备和传代步骤，因此如果包含平板参考培养，则该方案可缩短至一或两天。 请点击此处查看此图的放大版本。
1. 微流控芯片制备
注意：在本实验方案中，可使用不同的商用或定制芯片设计进行细胞封装，这些芯片能够在滴落模式下生成直径小于 100 µm 的水包油液滴。本研究所用芯片的设计与制备（参见文章数据 https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK）参照此前已发表报告14中所述的相同设计与制备方法进行。
- 使用专为凝胶微滴生成设计的母模，制备或获取一个玻璃基底上的PDMS微流控芯片。
- 向芯片中注入疏水溶液（氟烷基硅烷），使内部微通道具有疏水性。将溶液从入口注入，并确保所有通道均被液体充满。让充满溶液的通道静置约30–60秒。
- 通过向内部微通道注入空气，将溶液从装置中排出。使用空的空气注射器吹入空气，同时用吸水纸覆盖其他端口以防止溅出。
- 将处理后的装置置于加热板上，在65 °C下烘烤15分钟，以蒸发多余的溶液。或者，也可将装置在冰箱（4 °C）中过夜保存。
注意：微流控芯片现已准备就绪，可随时使用。本实验方案可在此处暂停。
2. 样品制备
- 细胞收获
注意：在液滴中进行细胞培养可提供有关质粒动态的相关数据。作为一种实验用细菌模型，一种 E. coli TOP10 感受态细胞与质粒 pCA_Odd1 联合使用（参见数据存档 https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK），该质粒编码一种超级折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）并具有卡那霉素抗性15细菌、质粒和培养基可根据实验体系的不同而有所变化。- 通过将25 g预混LB培养基和12 g琼脂溶解于800 mL蒸馏水（dH₂O）中来制备LB（Luria Bertani）琼脂培养基2O）。同时，通过将25 g预混LB培养基溶解于800 mL去离子水（dH₂O）中制备液体LB培养基。2O. 将溶液进行高压灭菌，并使其冷却至约 60 °C转移到无菌环境（如超净工作台）中进行后续步骤。
注意：预混的LB粉末含有10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g NaCl。也可使用自行配制的LB-琼脂培养基。 - 添加 50 µL 50 μg/mL），加入50 mL液体LB琼脂中（终浓度： 100 µg/mL）。通过倒置试管数次来混匀溶液。
- 每个培养皿（90 mm × 15 mm）中倒入约 15 mL 液体 LB 琼脂。准备两个平板：一个用于阴性对照（污染监测），另一个用于实验培养。让 LB 琼脂溶液冷却并凝固，直至两个平板中的颜色由深色变为透明。
- 使用无菌接种环涂布 E. coli 采用划线法在培养平板上接种菌株。放置甘油菌种保存管 E. coli 回到——80 °C 使用后立即关闭两块板，并在过夜孵育于 37 °C （第1天）
- 第2天，检查阴性对照平板上是否有任何菌落，以判断是否存在污染（如有，则从步骤2.1.4起重复操作）。在荧光单菌落中进行鉴定 E. coli 使用蓝光透射仪对平板进行观察，以制备液体培养物储备液。
- 在无菌条件下，打开培养皿，使用无菌接种环或 200 µL 用移液器吸头挑取选定的菌落，并转移至含有5 mL新鲜液体LB培养基的培养管中 5 µL 卡那霉素（配制成100 mg/mL）。准备一支未接种的阴性对照管，用于污染监测。将培养管在 37 °C 220 rpm 振荡过夜。
- 在不含抗生素的培养基中继续传代培养样本3天，以模拟质粒可能丢失的条件。在第3、4、5天分别转移 50 µL 将过夜培养物转接至含有5 mL无抗生素液体LB的新培养管中。37°C培养 37 °C 在220 rpm条件下振荡培养过夜。重复此步骤至第6天，经过四次传代后获得终体积为5 mL的培养物。
- 转移 50 µL 将最终的过夜培养物转接到含有2 mL液体LB培养基的新培养管中。使用分光光度计监测培养物，使其光密度（OD600）达到0.3（约需3–4小时）。
注意：应使用新鲜培养物，以免 OD600 上升，以确保细菌处于对数生长期。若未达到目标浓度，请从步骤 2.1.8 重复操作。
- 通过将25 g预混LB培养基和12 g琼脂溶解于800 mL蒸馏水（dH₂O）中来制备LB（Luria Bertani）琼脂培养基2O）。同时，通过将25 g预混LB培养基溶解于800 mL去离子水（dH₂O）中制备液体LB培养基。2O. 将溶液进行高压灭菌，并使其冷却至约 60 °C转移到无菌环境（如超净工作台）中进行后续步骤。
- 用于包封的细胞-琼脂糖混合物
注意：浓度控制对于确保单细胞液滴包封至关重要。可根据目标包封率和特定液滴体积计算所需的细胞浓度，如下例所示：
液滴体积（V滴）：如果 50 µm 液滴被生成
每滴所需细胞数（Cpd平均每个液滴0.2个细胞（每五个液滴一个细胞）
稀释倍数：初始细胞浓度在步骤 2.1.8 中获得
此处， 50 μm 或 100 μm （无液滴分裂）生成65–520 pL的液滴，每五个液滴中约包裹一个细胞，或每个液滴平均包裹1.6个细胞（无分裂时）。对于 E. coli，使用换算系数 1 OD600 单位 ≈ 7.8 x 108 cells/mL16将步骤 2.1.8 中测得的 OD600 值乘以转换系数，得到培养物的初始浓度（cells/mL）。- 重悬 E. coli 从不含卡那霉素的液体 LB 培养液制备的菌种储备液中取样，菌液浓度为 6.2e+6 个细胞/mL（目标浓度为 50 μm 直径的液滴）。将细菌悬液在室温下保存，直至与琼脂糖混合。
注意：抗生素会抑制阴性微菌落的形成，因此在质粒丢失实验中，必须将其从培养基中去除。 - 通过加热制备超低凝胶温度琼脂糖 90 °C 在LB液体培养基中，以2%（w/v）的浓度溶解。在控温摇床中振荡混合物10分钟。
- 将恒温振荡器的温度降低至 39 °C 冷却琼脂糖溶液。同时，将细菌悬液管放入恒温振荡器中加热4分钟，使其升温至 39 °C.
- 将细菌悬液与琼脂糖悬液按1:1比例混合，使琼脂糖终浓度为1%（w/v），细胞悬液浓度为3.1×10⁶ cell/mL。使用液体LB培养基代替细菌悬液，配制相同琼脂糖浓度的阴性对照溶液（用于污染监测）。
注意：琼脂糖-细胞悬液应尽快使用，以避免因细菌生长导致浓度变化。将恒温振荡器保持在 39 °C 在将琼脂糖装入尖端加热器以生成液滴之前，需保持其处于液态。
- 重悬 E. coli 从不含卡那霉素的液体 LB 培养液制备的菌种储备液中取样，菌液浓度为 6.2e+6 个细胞/mL（目标浓度为 50 μm 直径的液滴）。将细菌悬液在室温下保存，直至与琼脂糖混合。
3. 高通量单菌落培养
- 实验设置
- 构建或获取完整的开源流体平台（参见 https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK），包括气体压力驱动装置和流量传感器。或者，构建更简单的开源硬件频闪增强显微镜载物台（参见构建说明 https://wenzel-lab.github.io/strobe-enhanced-microscopy-stage/ 和项目仓库 https://github.com/wenzel-lab/strobe-enhanced-microscopy-stage）。
注意：也可使用传统的微流控装置，配备商用显微镜、高速相机和样品加热功能。 - 按照指定仓库（https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller）中的文档，集成基于开源 Raspberry Pi 的压力与流量控制系统。
注意：模块控制在数据仓库中进行了图示并提供支持（https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK）。作为替代方案，也可使用传统的压力控制器或高扭矩注射泵。 - 在系统中加入玻璃载片和移液吸头加热器（https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring），以控制琼脂糖-细胞样品进入芯片时的温度。
注意：这些加热器在数据仓库（https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platform 和 https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK）中已图示，是开源控制器系统的重要功能，可实现琼脂糖操作，而其他商用系统可能不具备此功能。
- 构建或获取完整的开源流体平台（参见 https://doi.org/10.17605/OSF.IO/6YWJK），包括气体压力驱动装置和流量传感器。或者，构建更简单的开源硬件频闪增强显微镜载物台（参见构建说明 https://wenzel-lab.github.io/strobe-enhanced-microscopy-stage/ 和项目仓库 https://github.com/wenzel-lab/strobe-enhanced-microscopy-stage）。
- 单细胞包封
- 将微流控芯片置于频闪增强显微镜载物台上，确保液滴生成结点（水相与油相交汇处）可见。
- 通过控制软件界面将移液吸头加热器和玻璃载片加热器设定为 40 °C。
- 使用带管路和PDMS塞的注射器，将含细胞悬液的1%琼脂糖混合物装入200 μL移液吸头中。将吸头插入加热器，并放置于微流控芯片水相入口处。将吸头上的PDMS密封件更换为连接至流量控制系统管路的密封件，开始注入细胞悬液。
- 将出口管路末端插入废液管，并在用户界面上设定两相的流速或压力，使液体缓慢进入微流控通道。水相使用200 µL/h（180 mbar），油相使用1700 µL/h（320 mbar）。等待1分钟，使液滴生成趋于稳定。
注意：压力值取决于芯片设计的通道尺寸，不同液滴生成结点设计可能需要调整流速值。 - 液滴生成稳定后，将废液管和收集管转移至收集管中。持续收集液滴直至样品储液耗尽。重复步骤3.2.3至3.2.5，以包封步骤2.2.4中的阴性对照溶液。
注意：样品收集应在15分钟内完成。 - 在液滴生成过程中将收集管置于冰上，或实验结束后将其置于4 °C环境中1小时，使琼脂糖在液滴内凝胶化。
注意：若微通道未堵塞且加载相同悬液，微流控芯片可重复使用。完成乳液生成（步骤3.2.3–3.2.5）后应丢弃移液吸头。
- 菌落生长及从乳液中释放
- 将含有细菌及阴性对照的凝胶微液滴转移至设定为37 °C的培养室中。
- 孵育微液滴至少4小时或过夜，以确保菌落充分生长。通过明场显微镜检查确认阴性对照无污染迹象 via bright field microscopy。
- 为从乳液中释放菌落，使用移液器或带针头的注射器（此处使用21 G针头）尽可能从凝胶微液滴乳液下方移除油相。
- 将50 µL凝胶微液滴转移至新的微量离心管中，并在4 °C下保存以用于后续液滴分析。向剩余乳液中加入等体积的氟化油与1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇（PFO）的1:1混合液。
- 在乳液上方加入约200 µL磷酸盐缓冲液（PBS）或0.9% w/v NaCl缓冲液。涡旋混合物后，在固定转速离心机中短暂离心。
- 小心从液-液界面底部移除油相，并从上层弃去100 µL PBS。重复步骤3.3.4–3.3.5，以获得在PBS缓冲液中洗涤干净、含极少或不含油残留的微凝胶。
注意：微凝胶会沉降在液-液界面处；避免在去除油相时将其一并移除。
4. 单菌落分析
- 细胞染色
注意：本实验方案可使用多种不同的染色组合。原则上，应选择一种在荧光显微镜可用滤光片组合下，其荧光颜色与质粒所编码的荧光蛋白明显不同的DNA或细胞壁染料。此处使用碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）对细胞DNA进行染色，以便将其荧光信号与质粒编码的绿色荧光蛋白区分开来，但也可使用其他多种DNA染料。
注意：碘化丙啶（PI）具有潜在致癌性，必须使用适当的个人防护装备进行操作。染料应按照当地法规安全处置。- 将洗涤后的微凝胶在约 80 x g 条件下离心 g 室温孵育5分钟。用移液器弃去上清液。
- 将50 μL微凝胶转移至新的微量离心管中，作为乙醇处理的阴性对照。
注意：PI 染料仅能进入细胞膜受损的细胞，例如经乙醇处理后的细胞。 - 加入等体积的70%乙醇至剩余的微凝胶中，用涡旋振荡器短暂混匀。室温孵育15分钟，以通透细菌膜便于PI染色。重复步骤4.1.1。
- 加入等体积的0.9% w/v NaCl溶液至微凝胶中，短暂涡旋振荡。重复步骤4.1.1。
- 添加 2 µL 向两个微量离心管样品中加入 PI（1 mg/mL）。充分混匀，室温避光孵育 15 分钟。
注意：如果阴性对照出现任何红色荧光信号 通过 荧光显微镜观察时，菌落在之前步骤中暴露于其他溶液可能导致其完整性受损。
- 显微镜技术
注意：使用倒置落射荧光显微镜对液滴和微凝胶成像，以获取液滴尺寸分布及微凝胶中细菌菌落的荧光信号（图2）。此处介绍一个开源的倒置显微镜平台（https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform）17 使用10倍0.3NA物镜、白色LED阵列进行明场照明，以及470 nm LED用于激发。商用落射荧光显微镜可用于成像液滴和微凝胶。由于照明条件和滤光片因显微镜型号、品牌及所用荧光蛋白的不同而异，因此需要进行校准。- 转移 2 μL 将凝胶微滴加入成像室载玻片并添加 5 μL 添加氟化油以帮助形成单层液滴，实现最佳成像。
注意：细胞计数板或简易微流控腔室有助于将乳液均匀铺展并减缓干燥过程。 - 在显微镜上，从上方开启白色LED矩阵照明，用于明场成像。将制备好的载玻片装上，聚焦样品并找到单层液滴区域。采集一幅明场图像。
- 在不移动样品的情况下，切换至470 nm LED作为激发光源，拍摄菌落的荧光图像。调整滤光轮至绿色波长滤光片位置，用于sfGFP成像。扫描所有含有液滴单层的区域，并重复步骤4.2.2–4.2.3，以确保液滴分析的统计学可靠性。
- 转移 2 µL 将染色后的微凝胶转移至成像腔芯片中 5 µL 加入0.9% w/v NaCl溶液以帮助形成微凝胶的单层结构。成像过程中密封芯片的入口和出口，防止蒸发。
注意：蒸发可能影响荧光标记的共定位。建议在长时间成像时使用微流控腔室。 - 重复步骤 4.2.2–4.2.3。调整红色波长区间滤光片以进行碘化丙啶（PI）成像，并采集相应图像。
- 完成一个位置的成像后，在载玻片上寻找下一个具有微凝胶单层的合适区域，重复成像过程，以确保样本分析的统计稳健性和全面性。
- 转移 2 μL 将凝胶微滴加入成像室载玻片并添加 5 μL 添加氟化油以帮助形成单层液滴，实现最佳成像。
图2：显微镜图像及其分析. 微凝胶中菌落的荧光成像与分析。A–C) 采集的图像通道 通过 明场与荧光显微镜结合倒置显微镜观察。复合图像（D) 显示微凝胶内存在一个阴性菌落（仅显示红色荧光）。(E–H图像分析工作流程的结果。通过生成感兴趣区域（ROIs），可在红色和绿色通道上识别菌落，并对信号进行定量以确定阴性菌落的存在。比例尺： 50 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
- 图像分析
注意：为了分析包埋菌落的荧光信号并识别稀有事件，可使用 Fiji/ImageJ 对明场和荧光成像图像进行处理（图3）。这些步骤可编写为宏脚本，参数值可能因光学配置不同而有所调整。- 打开绿色和红色通道的图像。定义一个起始坐标为 (500, 500)、宽度和高度均为 2000 像素的矩形感兴趣区域（ROI）。
注意：这些参数适用于 3000 × 3000 像素的图像，该 ROI 用于选定照明更均匀的区域。 - 将图像裁剪至定义的矩形 ROI 区域。从每个像素的强度值中减去常数 10，并对图像应用平滑滤波器，以降低背景噪声，使目标对象更清晰。
注意：仅此区域将用于后续分析。 - 复制红色通道的图像，并将其转换为二值掩膜，以识别与质粒相关的稀有事件。设定阈值范围为 10 至 255。在此范围内的像素将被视为前景（目标对象），其余则视为背景。
- 执行形态学操作，闭合目标对象中的微小间隙并填充内部孔洞。对二值掩膜中的重叠对象应用分水岭算法进行分离。
- 分析二值掩膜中的颗粒。仅保留面积大于 30 像素、圆度在 0.50 至 1.00 之间的颗粒。将分析结果汇总并添加至结果表中。保存粒子分析检测到的 ROI 集合，以便进一步可视化。
- 将保存的 ROI 叠加显示在绿色和红色通道的图像上。测量这些图像中 ROI 的强度或其他属性。将测量结果记录在结果表中，并将数据分别保存为 CSV 文件，用于后续统计分析。
- 打开绿色和红色通道的图像。定义一个起始坐标为 (500, 500)、宽度和高度均为 2000 像素的矩形感兴趣区域（ROI）。
图3：用于识别阴性菌落的图像分析工作流程。该图展示了一个逐步处理和评估荧光图像的自动化工作流程。该工作流程基于荧光标记的共定位以及颗粒分析。请点击此处查看该图的放大版本。
5. 琼脂平板比较实验
注意：为了将液滴法与传统的平板检测法进行比较，在步骤 2.1.8 中使用培养皿对相同 E. coli 菌株的荧光菌落进行了定量分析。该方法作为模拟对照方法，用于测量 sfGFP 质粒的稳定性。参见图 1中的方法示意图。
- 按照“细胞收获”部分步骤 2.1.1 所述方法制备不含抗生素的 LB 琼脂。将琼脂冷却至 60 °C 以下并混匀。
- 在无菌环境下，将 15 mL 琼脂培养基倒入每个培养皿中。将皿盖部分打开，使平板凝固，待用。
- 取三块平板，每块接种 10 µL LB 培养基中 OD600 为 0.007 ± 0.002 的 E. coli 菌液，使用 L 形涂布棒均匀涂布。将平板倒置并闭合后于 37 °C 培养。在相同条件下制备一块不含细菌的对照平板。
- 培养 24 小时后，使用 FluoPi（一种开源荧光成像系统，https://github.com/RudgeLab/FluoPi）15 拍摄平板的荧光图像。
注意：FluoPi 由树莓派相机组成，配备中心波长为 470 nm 的蓝色激发光源，以及丙烯酸材质的激发滤光片和发射滤光片。 - 利用所获得的图像，人工计数每块平板中的荧光菌落和非荧光菌落。
结果
细胞包封和微菌落形成的验证
在破乳并洗涤微凝胶之前，可通过明场显微镜观察凝胶微滴，以直观确认细胞包封情况。此步骤乳液的代表性结果如图4所示。
图 4：荧光显微镜叠加图像的局部区域。经过过夜培养后，表达 sfGFP 的 E. coli 在凝胶微滴内部形成的代表性微菌落。使用 10 倍放大倍率、数值孔径为 0.30 NA 的物镜进行观察。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的高清版本。
图像分析结果
在对微凝胶进行染色并获取多个位置的明场及荧光通道图像后，可在原始图像中识别出呈阴性的菌落（见图5A）。将一次实验中所有图像提取的数据进行绘图，可展示各个菌落的荧光比值，从而突出显示那些失去质粒编码荧光的菌落（见图5B）。结果表明，在总共分析的2785个微菌落中，有100个菌落丢失了其质粒或质粒功能，占比为3.6%。
图 5：阴性微菌落的定量分析。（A）荧光显微镜叠加图像的局部区域。去除油相并染色后，微凝胶中表达 sfGFP 的代表性菌落以及两个阴性菌落显示出DNA染料的红色荧光（以黑圈标出）。比例尺：100 µm。（B）从16张多通道显微图像中提取的单个微菌落荧光值的散点图。图中以红色标示的菌落无任何绿色荧光，被计为阴性菌落。请点击此处查看该图的高清版本。
琼脂平板定量法
三块平板的图像如图6所示，非荧光菌落以白色箭头标出。第一块平板（图6A）共显示213个菌落，其中1个不具荧光。第二块平板（图6B）共有49个菌落，无非荧光菌落。第三块平板（图6C）共显示252个菌落，其中6个不具荧光。这些结果对应的平均菌落质粒丢失率为2.3%，标准差较大，为3.2。
图6： 平板上阴性菌落的鉴定. (A–C荧光和非荧光 E. coli LB-琼脂平板（直径：90 mm，高度：15 mm）上的菌落。接种物来源于 E. coli 与 sfGFP 来自 -80 °C 菌种在第1天划线接种，第2天加入抗生素培养，从第3天至第6天每天按1:100比例稀释，以允许质粒丢失。菌落于 37 °C 孵育24小时后，在FluoPi腔室中进行成像。非荧光菌落使用GIMP增强，并用白色箭头标示。 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
本文展示了一种基于凝胶微滴的方法，可有效识别和定量表达或不表达质粒编码荧光蛋白（如 sfGFP）的菌落。对于质粒产物表达不足的菌落，可通过一种荧光DNA染料（此处为碘化丙啶）进行识别，该染料可标记所有菌落，并具有不同的发射波长。该方法结合了液滴微流控、凝胶化和荧光显微镜技术，并利用开源技术，使得在多种研究环境中均可实施先进的实验流程11,13。成功生成凝胶微滴后，可实现多种先进的分子生物学单细胞实验流程，包括细胞裂解、单基因组扩增、代谢细胞相互作用筛选、培养基更换等8,9。本实验方案利用这些优势，以比传统基于平板的检测方法更具可扩展性的方式培养、染色并分析微菌落。
关键步骤
包封过程是本实验方案中关键且精细的步骤。需要精确控制试剂浓度、流速和压力，以生成特定尺寸范围内且每个液滴中平均细胞数可控的均一微凝胶。此外，保持细胞-琼脂糖混合物的浓度和温度，可防止细胞聚集或过早凝胶化。在移液器吸头中对液态琼脂糖-细胞悬液进行温度控制，是我们开源硬件微流控工作站的一项特别优势，相比调控注射泵和管路温度的方法，该方式使微凝胶的生成更为简便且稳定。由于细胞在包封和培养前即与琼脂糖培养基混合，因此必须快速生成琼脂糖微凝胶，以避免细胞浓度发生显著变化。为此，我们优化了一种受Abate等人启发的液滴分裂式微流控芯片设计18。
修改与故障排除
为了优化原始方案，需要进行多项校准和修改。与常规的水包油液滴相比，琼脂糖的包封更具挑战性，需要设计一种系统，使琼脂糖保持在液态的同时，确保水相流动产生均一粒径范围的颗粒。由于凝胶化导致琼脂糖黏度变化，进而影响流速，使颗粒尺寸增大。显微成像需要仔细选择 滤光片和光源，以确保激发光和发射光信号不重叠，从而实现清晰区分。最初选择DAPI对细菌染色，但其发射信号与sfGFP重叠，导致sfGFP在蓝色检测通道中被检测到。我们随后改用PI，因其在长波长（红光）范围内的发射光与sfGFP有良好分离。
尽管使用所提出的方法对质粒丢失进行了定量分析，但所用的sfGFP质粒意外地表现出高度稳定性，在无抗生素培养的第一代细胞中几乎未观察到质粒丢失现象，即使在pH9培养基和40 °C孵育等应激条件下也是如此。该观察结果与其他研究团队的发现一致1,19。质粒的稳定性限制了该方法在初始细胞培养代次中全面展示其定量能力，但同时也证明了该方法具有足够的灵敏度，能够检测到质粒保留率的微小差异。早期代次中质粒高度稳定的现象对于采用负筛选检测（如靶标细菌抑制）的液滴微流控筛选具有重要意义，这意味着筛选靶标的质粒丢失导致假阳性结果的可能性较低。由于液滴微流控筛选的通量通常比其他高通量筛选方法（如移液机器人工作流程）高出数个数量级，因此这些罕见事件需要被评估并加以考虑。
局限性
尽管该方法具有优势，但仍存在一些局限性。微流控器件的制备需要专业知识和对细节的精细把控，同时需对流速进行严格的实验控制，以确保确定性的包封效率。这些方面可能需要针对不同的实验装置进行优化。虽然该方法依赖荧光显微镜进行信号检测，因而需要配备合适的成像设备，但此类设备可采用开源硬件构建，从而提高可及性。此外，微凝胶也可使用带有大喷嘴的商用流式细胞仪进行分析，进一步提升实验的可及性和通量。也可使用液滴分选仪进行此类流式细胞分析。
此外，尽管该方法旨在检测来自质粒、染料或其他标记物的荧光信号，但其应用局限于可进行荧光标记的细胞，因而可能不适用于所有细菌菌株或实验条件。然而，该方法可经调整以结合其他类型的显微技术，例如相差显微镜或明场显微镜，从而实现超出荧光检测范围的表型分析应用。此外，该方法还可与傅里叶变换红外光谱（FTIR）或拉曼光谱等光谱技术联用，拓展其对包封细胞化学成分及结构信息的分析能力。这些改进显著拓宽了该方法的适用范围，使其成为适用于多种研究场景的多功能工具。
意义与应用
传统的质粒丢失检测方法19难以准确量化丢失表达的细胞比例，而这一信息在实验方法设计及多种生物学应用中可能极为重要。通常在琼脂平板实验中通过计数菌落类型进行评估，该方法适用于获得界限清晰的独立菌落，如图4所示。然而，重叠的菌落难以被明确识别；在我们的实验中，并非总能获得理想的菌落密度，且需要大量平板才能对低频发生的质粒丢失事件进行良好的统计分析。本文提出的方法提供了一种更为稳健的策略，可更精确地定量来自独立菌落的荧光信号，其检测的菌落数量高于传统的琼脂平板类方法。这是因为在微液滴中，菌落彼此分离生长，体积更小，易于加载至成像腔室，从而可通过显微镜或基于流式细胞术的方法对大量菌落进行定量分析。该方法可显著提升统计代表性，并便于整合到其他凝胶微液滴工作流程中。
开源硬件11,20的使用使研究人员能够自定义微流控工作站的设计并精确调节流速，从而通过调节颗粒尺寸适配多种细胞类型和实验条件。这种灵活性还可扩展至整合其他类型的显微镜技术，例如相差显微镜或光谱学技术，进一步拓宽该方法的应用范围。该方法能够在不同条件下评估质粒稳定性的能力，对于那些需要在无抗生素选择压力下、特定应激条件下或经历多代培养时维持质粒保留的应用至关重要。本方法所具备的多功能性与适应性，使其在合成生物学、环境监测以及临床诊断等领域的多样化研究应用中具有重要价值2。
披露
作者声明，不存在可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作获得了由T.W.主持的ANID FONDECYT常规项目1241621以及“通过开放硬件实现拉丁美洲生物成像中心”（Latin American Hub for Bioimaging Through Open Hardware）蔡司·伯格倡议项目（Chang Zuckerberg Initiative）的资助。T.W.还感谢CIFAR在CIFAR MacMillan多尺度人类计划中授予的Azrieli全球学者资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇 | Sigma-Aldrich | 370533-25G | 用于破乳 |
| 70% 乙醇 | 用于细胞通透化 | ||
| 琼脂 | Winkler | 9002-18-0 | |
| 活检打孔器 | 0.75 mm 和 1.8 mm | ||
| 蓝色LED透射照明仪 | IO Rodeo | ||
| 培养管 | 15 mL | ||
| 干燥器 | 配备真空泵 | ||
| 一次性杯子 | 用于混合PDMS | ||
| 一次性叉子 | 用于混合PDMS | ||
| E. coli TOP10菌株 | |||
| FluoPi显微镜 | https://github.com/wenzel-lab/FluoPi | 用于分析培养板的绿色荧光成像系统 | |
| 氟化油 | 3M | Novec 7500 | |
| 玻璃片加热器 | https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring | 用于控制微流控芯片温度在40 °C | |
| 玻璃载片 | |||
| 加热板 | Mechanic | 用于蒸发Aquapel | |
| 图像分析软件 | Fiji/ImageJ | 2.14.0/1.54f | |
| 培养箱 | Mundo Lab | MLAB Scientific / 用于培养板和微凝胶的孵育 | |
| 异丙醇 | 用于清洗玻璃载片 | ||
| 卡那霉素 | 100 ug/mL 浓度 | ||
| L型涂布棒 | 用于在琼脂平板上涂布细菌 | ||
| 主模具 | 硅片或玻璃晶圆上的芯片设计 | ||
| 微量离心管 | 2 mL | ||
| NaCl溶液 | 0.9% w/v 氯化钠溶液 | ||
| 开源硬件频闪增强显微镜平台 | https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platform | 用于明场显微镜观察 | |
| 培养皿 | Citotest | 2303-1090 | 90 x 15 mm |
| 移液器吸头加热器 | https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring | 用于控制移液器吸头温度在40 °C | |
| 等离子清洗机 | Diener Electronic | 117056 | 用于将PDMS与玻璃载片键合 |
| 质粒pCA_Odd1 | 编码sfGFP和卡那霉素抗性 | ||
| 聚四氟乙烯（PTFE）管 | Adtech Polymer Engineering Ltd | ||
| 预混LB培养基 | US Biological Life Science | L1520 | |
| 碘化丙啶（PI） | 用于染色 | ||
| 基于树莓派的压力与流速控制系统 | https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller | 用于控制压力和流速 | |
| 硅橡胶基料 | Sylgard | PDMS试剂盒 - 184硅橡胶试剂盒 | |
| 硅橡胶固化剂 | Sylgard | PDMS试剂盒 - 184硅橡胶试剂盒 | |
| 分光光度计 | 用于测量吸光度 | ||
| SQUID显微镜 | https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform | 用于分析染色细胞的多荧光成像系统 | |
| 无菌接种环 | 用于挑取菌落和划线接种 | ||
| 表面活性剂 | Sphere Fluidics | Pico-Surf | |
| 注射器 | NIPRO | 带滤器和管路 | |
| 温控摇床 | Mundo Lab | DLAB HCM100-Pro | |
| 镊子 | |||
| 超低凝胶温度琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A2576-5G | 用于生成水凝胶微珠 |
| 疏水溶液（氟烷基硅烷） | Aquapel | 用于处理PDMS装置的微通道 |
参考文献
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