本研究概述了一种从猪的小肠和大肠来源的类器官生成二维单层细胞的方案。这些单层细胞的生长伴随着跨上皮电阻(TEER)值的升高,表明上皮完整性良好。此外,在Ussing室实验中,施加佛司可林后,这些单层细胞表现出生理性的分泌反应。
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本研究概述了一种从猪的小肠和大肠来源的类器官生成二维单层细胞的方案。这些单层细胞的生长伴随着跨上皮电阻(TEER)值的升高,表明上皮完整性良好。此外,在Ussing室实验中,施加佛司可林后,这些单层细胞表现出生理性的分泌反应。
胃肠道(GIT)不仅参与食物的消化和营养物质的吸收,还起到抵御病原体的保护屏障作用。传统上,该领域的研究依赖于动物实验,但目前对遵循“3R原则”(替代、减少、优化)的替代方法的需求日益增加。猪源类器官作为一种极具前景的工具应运而生,可提供更为准确的 体外 复制 体内 相较于传统细胞模型,肠道类器官具有更多生理相关条件。肠道类器官的一个主要挑战在于其顶膜朝内、基底侧膜朝外的结构方向。这一局限性可通过在transwell小室(以下简称“小室”)上构建二维(2D)类器官单层来克服,从而实现对两层膜表面的可及性。在本研究中,我们成功建立了猪空肠和结肠类器官的二维培养体系。该培养过程包含两个关键阶段:首先形成细胞单层,随后使用定制培养基诱导细胞分化。通过测量跨上皮电阻来监测细胞生长情况,结肠类器官在第8天、空肠类器官在第16天电阻趋于稳定。经过2天的分化阶段后,上皮层即可用于分析。为定量并追踪如氯离子分泌等主动电活性转运过程,我们采用Ussing室技术。该方法可实现实时测量,并对上皮转运过程进行详细表征。这一创新性 体外 模型结合Ussing chamber等既定技术,为在3R框架内对猪胃肠道进行生理学表征提供了强有力的平台,同时也为研究病理生理机制及开发潜在治疗策略开辟了新的途径。
胃肠道(GIT)在消化、营养吸收以及通过粪便排泄废物方面起着核心作用1。此外,胃肠道还作为抵御病原体的屏障,这一功能依赖于其复杂的细胞组成,包括干细胞、分泌黏液的杯状细胞、肠内分泌细胞和吸收性肠上皮细胞2。肠道稳态可能受到多种因素的干扰,例如细菌感染3或炎症过程4,从而对机体造成严重后果,如营养吸收障碍、腹泻甚至死亡5。研究此类病理生理状况通常采用实验动物模型,或根据“3R原则”6使用来自不同物种的细胞培养系统。在使用物种特异性模型时,结果的准确预测性和可转化性至关重要7。尽管存在这一需求,目前仍明显缺乏能够充分模拟肠道复杂结构与功能的猪源性细胞培养模型。
为应对这一挑战(该挑战同样存在于其他物种中),研究人员已开发出三维(3D)类器官,以期模拟胃肠道(GIT)的生理复杂性8。最初,类器官由人和小鼠的肠道组织构建而成;迄今为止,来自幼龄和成年猪的猪类器官也已成功建立并实现培养9,10....
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本方案中,两只健康的猪(本特海姆黑白花猪;1 只雄性,1 只雌性;4.5 月龄;体重约 65 kg)通过击晕枪击毙并放血处死。根据动物保护法,此类操作(屠宰及组织摘取)不被归类为动物实验,但需向汉诺威兽医大学基金会的动物福利官员报备(注册编号:TiHo-T-2023-15)。
1. 插件的包被
注意:所有步骤均需在安全柜内使用无菌材料进行。除非另有说明,本方案的所有步骤均需在冰上操作。
2. 二维类器官单层的生成
注意:猪结肠类器官的生成和培养方法与猪空肠类器官所述方法相同25。在生成三维类器官后,应进行至少3-4....
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本方案通过解离猪空肠和结肠来源的三维类器官,可靠地生成猪源二维单层细胞。空肠类器官培养16天,结肠类器官培养9天后,可形成完整的单层细胞。这些单层细胞随后可用于通过尤斯 chamber 技术评估其生电性及生理转运特性。
将三维类器官解离后,将单个细胞接种到包被的插入式培养小室中。每次更换培养基时,通过测量跨上皮电阻(TEER)值来监测细胞生长情况。该方法可同时追踪细胞增殖以及完整单层的形成,这对于构建功能性上皮层至关重要。初始时,TEER值接近基线水平,随着培养时间的延长逐渐升高,空肠类器官在培养18天后达到约150 Ω·cm2的平台期(图3A),而结肠类器官在培养9天后达到约200 Ω·cm2(图3B)。
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本方案描述了一种将已建立的猪源三维类器官消化为单细胞,并将其接种到Transwell膜上以形成完整单层的方法。该构型可暴露细胞的顶膜侧,便于利用Ussing室监测吸收和分泌过程。
在这一多步过程中,初始且关键的步骤是精确地解离三维类器官。实现单细胞的均匀接种对于功能性单层细胞的形成至关重要27。因此,必须仔细监测解离过程。应根据实际情况调整胰蛋白酶/EDTA溶液的孵育时间——若观察到细胞团块,则应延长孵育时间;若在细胞计数过程中发现细胞死亡过多,则应缩短孵育时间。需要注意的是,类器官大小的差异(可能源于操作者操作方式的不同)会影响解离过程,应予以充分考虑。
TEER 值逐渐升高,在结肠类器官中于第 9 天达到平台期,而在空肠类器官中则于第 18 天达到平台期,这表明形成了完整的单层细胞28,这一点已在成熟的肠道人类细胞培养系统29,
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我们声明不存在任何利益冲突。
感谢德国联邦食品和农业部(BLE# 28N-2-071-00)提供的资金支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔板 | SARSTEDT AG & Co. KG | 8,33,922 | |
| A83-01 | MedChemExpress, New Jersey, USA | HY-10432 | 储存于-20 °C。按需解冻 |
| accujet S | Brand GmbH + Co KG, Wertheim, Germany | 26351 | |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 12634010 | 储存于4 °C |
| B27添加剂 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 17504044 | 储存于-20 °C。按需解冻 |
| CaCl2.2 H2O | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | C3306 | 室温储存 |
| D(+)-葡萄糖(无水) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.08337 | 室温储存 |
| DAPT | MedChemExpress, New Jersey, USA | HY-13027 | 储存于-20 °C。按需解冻 |
| D-甘露醇 | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | M4125 | 室温储存 |
| DMSO | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | 154938 | 室温储存 |
| 电极组(AgCl/PtIr/标准) | Scientific Instruments, Simmerath, Germany | #1316 | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf SE, Hamburg, Gemany | 3123000063 | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf SE, Hamburg, Gemany | 3123000047 | |
| EVOM3手动上皮细胞伏特-欧姆计 | World precision instruments, Sarasota, USA | EVM-MT-03-01 | |
| 胎牛血清(FBS) | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | F7524 | 储存于-20 °C。按需解冻 |
| 福斯科林(Forskolin) | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | F6886 | 储存于-20 °C。按需解冻 |
| gasprofi 1 SCS micro | WLD-TEC GmbH, Arsenhausen, Germany | 60,04,000 | |
| 胃泌素1(Gastrin 1) | MedChemExpress, New Jersey, USA | HY-P1097 | 储存于-20 °C。按需解冻 |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 35050061 | 储存于4 °C。 |
| HCl | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | 1090571000 | 室温储存 |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | H0887 | 储存于4 °C |
| Herasafe 2025 II级生物安全柜 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51033316 | |
| ICO105培养箱 | Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Germany | 62,20,143 | |
| 吲哚美辛(Indomethacin) | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | I7378 | 室温储存 |
| KCl | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.04936 | 室温储存 |
| L-谷氨酰胺(L-Glutamin) | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | G7513 | 储存于-20 °C。按需解冻 |
| LWRN上清液 | 自制 | 储存于-20 °C。按需在冰上小心解冻。LWRN添加剂根据Miyoshi等(2012)方法制备 | |
| Matrigel基底膜基质,无LDEV,10 mL | Corning Incorporated - Life Sciences | 354234 | 储存于-20 °C。按需在冰上小心解冻 |
| Megafuge 1.OR | Heraeus Instruments, Osterode, Germany | 75003060 | |
| MgCl2.6 H2O | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.05833 | 室温储存 |
| Na2HPO4.2H2O | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.06580 | 室温储存 |
| N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine) | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | A7250 | 储存于-20 °C。按需解冻 |
| NaCl | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.06404 | 室温储存 |
| NaH2PO4.H2O | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.06346 | 室温储存 |
| NaHCO3 | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | 1.06329 | 室温储存 |
| 改进型Neubauer计数板 | Glaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rhön, Germany | 40442712 | |
| Olympus IX70倒置显微镜 | Olympus Corporation, Hamburg, Germany | ||
| 青霉素-链霉素(Pen/Strep) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 15140122 | 储存于-20 °C。按需解冻 |
| 多粘菌素B(PolymyxinB) | Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany | P4932-1MU | 储存于-20 °C。按需解冻 |
| Primovert显微镜支架,带双目摄影管 | Zeiss | 415510-1101-000 | |
| 重组小鼠表皮生长因子(rm EGF) | Prepotech, New Jersey, USA | 315-09 | 储存于-20 °C。按需解冻 |
| SB202190 | MedChemExpress, New Jersey, USA | HY-10295 | 储存于-20 °C。按需解冻 |
| Snapwell 3801 | Corning Incorporated - Life Sciences | 3801 | |
| 胰蛋白酶/EDTA | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 25300054 | |
| Ussing基础系统 | Scientific Instruments, Simmerath, Germany | #1317 | |
| Ussing扩散室 | Scientific Instruments, Simmerath, Germany | SKU 1307 | |
| 电压/电流钳制系统VCC6 | Scientific Instruments, Simmerath, Germany | SKU 1310 | |
| Y27632 | MedChemExpress, New Jersey, USA | HY-10583 | 储存于-20 °C。按需解冻 |
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