小鼠儿科脑震荡模型：伴有长期功能障碍的闭合性头部损伤（CHILD）

摘要

儿童脑震荡可能导致长期后遗症，伴随生理和心理方面的紊乱。该儿童脑震荡小鼠模型可导致长期的神经炎症、白质改变以及神经元结构变化，并伴随行为功能障碍。该模型可调整用于不同冲击部位或重复性脑震荡，以评估终生影响的变化。

摘要

儿童时期的脑震荡和轻度创伤性脑损伤（mTBI）构成重大的健康威胁，许多患者在后期生活中表现出严重的生理、神经和心理社会功能障碍。目前对这些损伤的细胞与分子病理生理机制了解甚少，这一重大知识空白阻碍了针对慢性后遗症的特异性治疗策略的研究。现有的单一动物脑震荡模型均无法完全模拟人类患者所表现出的所有特征，当前的模型通常针对特定研究问题而设计。我们旨在建立一种能够重现临床早期及长期症状的青少年脑震荡模型，命名为伴有长期功能障碍的闭合性头部损伤（Closed Head Injury with Long-term Disorder, CHILD）。在该模型中，通过施加脑震荡力 通过 将电磁撞击器作用于轻度麻醉且头部可自由旋转的出生后第17天（P17）未束缚小鼠的头部。小鼠被置于固定在立体定位装置上的紧绷锡箔上，撞击器被精确对准目标皮层区域。电磁撞击器可调节撞击深度、停留时间和持续时间，以控制损伤严重程度。该模型的一个优势在于允许头部自由旋转，这是重要的临床特征。撞击后，立即记录小鼠翻正反射时间和开始探索环境的时间，随后将其放回母鼠身边。随着脑震荡严重程度的增加，部分小鼠会出现颅内出血。可根据需要对小鼠在整个生命周期中进行行为学和神经影像学的常规监测。不同损伤程度可模拟青少年脑震荡的异质性特征。目前标准的CHILD模型不出现颅骨骨折，常规神经影像学无可见改变（与临床情况相似），但会导致进行性且持续的神经元死亡、弥散MRI改变、神经元活动与可塑性异常、胶质增生，以及随年龄增长而逐渐加重的行为异常。总之，该CHILD模型可模拟许多临床脑震荡患者所表现出的早期及长期特征。

引言

儿童创伤性脑损伤（TBI）是一个重要的健康问题，是导致儿童急诊就医的首要原因，并与远期严重的健康后果相关。即使是占所有TBI病例75%的轻度TBI（mTBI）¹，也会导致长期的异常，包括生理、心理、神经和认知功能障碍²。尽管儿童轻度TBI发生率高且具有显著的健康风险，但导致慢性功能缺陷的病理、细胞和分子机制仍研究不足。这一知识空白阻碍了儿童轻度TBI有效治疗和诊断方法的开发。

成年啮齿类动物创伤性脑损伤（TBI）模型包括自由落体打击、控制性皮层冲击和液体冲击损伤，可通过调整参数诱导中度至重度损伤（取决于所采用的评估指标）^3,4。其中许多成年动物模型已被改造用于研究儿童TBI^5,6。在过去十年中，研究人员已开发出基于闭合性头部损伤及旋转机制的啮齿类动物轻度TBI（mTBI）模型⁷。然而，相较于成年TBI的研究文献，这些模型在发育期啮齿类动物中的应用仍较为有限⁸。为提高临床相关性，并涵盖能够模拟儿童临床异质性的多种损伤严重程度，本研究建立了“伴长期功能障碍的闭....

方案

实验在两个地点重复进行，分别为法国波尔多大学和美国加利福尼亚大学河滨分校（加利福尼亚州，美国）。

在波尔多，所有实验均使用在大学动物设施中繁育的 P17 雄性和雌性 C57Bl6J 小鼠进行。初始种鼠购自商业来源，并在标准条件下饲养，光照周期为 12 小时黑暗/12 小时光照，温度为 21 °C ± 1 °C，湿度为55% ± 10%，并提供食物和水 随意摄取实验操作遵循波尔多大学动物护理委员会的规定、法国关于实验动物使用的法律法规（授权号 #29324-2021012118549817 v3）、欧洲理事会指令（86/609/EEC）以及ARRIVE指南。本方案作为一种轻度创伤性脑损伤模型，不会引起疼痛或痛苦，因此无需额外的特殊镇痛处理，常规镇痛管理即可。幼鼠（TBI组、假手术组）于出生后第25天（P25）成功断奶。

在中国台湾，Riverside 实验室从商业渠道获得妊娠13天的 C57Bl6J 雌性小鼠，所有实验均使用其后代在出生后17天（P17）的雄性和雌性幼鼠进行。动物饲养于自动控制的12小时光照/12小时黑暗循环环境中，温度维持在 21 °C母鼠和幼崽均具有 随意摄取 可自由获取食物和水。所有实验程序均经加州大学河滨分校机构动物照护与使用委员会批准，并符合《动物福利法》和公共卫生服务政策。该设施内的所有幼鼠（TBI组、假手术组）均在出生后第21天断奶。

结果

CHILD 模型是一种相对快速且可重复的幼年小鼠轻度创伤性脑损伤（mTBI）模型，同时允许损伤严重程度和位置的变化。正如预期，CHILD 小鼠在闭合性头部损伤后的恢复时间显著延长（图 3）。当合并各组数据（n = 36 雌性假手术组，n = 140 雄性假手术组，n = 30 雌性 G1 组，n = 55 雄性 G1 组，n = 32 雌性 G2 组，n = 141 雄性 G2 组）时，观察到翻正时间延迟（图 3A，三因素方差分析 p < 0.001）以及恢复探索行为所需时间延长（图 3B，三因素方差分析 p < 0.001）。恢复期还依赖于撞击的严重程度（图 3，G1 vs G2；三因素方差分析，p < 0.001，两个参数均显著）。性别效应明显，同龄雌性小鼠相较于雄性在翻正时间和开始探索时间上均表现出更长的恢.......

讨论

方案中的关键步骤
本文所述的 CHILD 方案需要使用电磁撞击器（图 2A），其作用包括：（1）标准化撞击参数（速度、深度、持续时间）；（2）确保实验室内及不同实验室之间的可重复性；（3）可方便地从商业渠道获得。另一个关键组件是用于撞击啮齿类动物头部的撞击头。撞击头可采用多种材料，从硅胶到金属均可，但本方案使用的是取自 2 mL 注射器推杆的橡胶头（图 2B）。选择橡胶头的原因在于能够将撞击力和旋转传递至颅骨，同时避免引发颅骨骨折。在 G2 小鼠中，有少数个体出现了颅骨骨折，无论是否伴有硬膜下出血。使用电磁撞击器还允许通过调节撞击速度/持续时间以及深度来控制损伤严重程度，正如 G1 和 G2 分组设计中所采用的方法。为确保可重复性，撞击器在头部的位置应仔细对准；然而，由于头部旋转在病理生理过程中起着重要作用，因此微小的位置差异对损伤结果影响不大。

另一个关键组分是小鼠在遭受头部撞击时所放置的介质。已有多种报道使用了不同.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BSA	Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 圣康坦法拉维耶尔邮政信箱 法国	A7030
C57Bl6J 小鼠	Charles River Laboratory France CRLF 9 All. Moulin Berger, 69130 É库利，法国		波尔多
电磁冲击器	Leica Biosystems，伊利诺伊州里士满，美国	Impact One 立体定位撞击器
落射荧光显微镜	奥林巴斯，BX41，美国宾夕法尼亚州森特瓦利
乙二醇	Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 圣康坦法拉维耶尔邮政信箱 法国	102466
GFAP一抗	Millipore，Billerica，MA	AB5541	鸡抗 GFAP
GFAP 二抗	Molecular Probes，Invitrogen	A11034	山羊抗兔 AlexaFluor  488
甘油	Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 圣康坦法拉维耶尔邮政信箱 法国	G5516
重型铝箔	Kirkland	RK611	在Cosco获得
Micromanager 软件	（美国国立卫生研究院，美国）
NeuN 一抗	AbCam，剑桥，发现大道 生物医学园区 英国剑桥，CB2 0AX	AB128886	兔抗 NeuN
NeuN 二抗	Molecular Probes，Invitrogen	A11041	山羊抗鸡 AlexaFluor 568
PBS	Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 圣康坦法拉维耶尔邮政信箱 法国	P5493
PFA	Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 圣康坦法拉维耶尔邮政信箱 法国	1.04003
叠氮化钠	Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 圣康坦法拉维耶尔邮局信箱 法国	26628-22-8
立体定位仪支架 - 底座	KOPF 仪器公司，7324 Elmo 街，Tujunga，CA 91042 É美国	900-C
立体定位仪 - 电极操作器	KOPF 仪器公司，7324 Elmo 街，Tujunga，CA 91042 É美国	960
立体定位仪 - U型架	KOPF 仪器公司，7324 Elmo 街，Tujunga，CA 91042 É美国	900-U
Triton X-100	Sigma Aldrich Chimie S.a.r.l 80 Rue de Luzais L'lsle-d'Abeau Chesnes - BP701 38297 圣康坦法拉维耶尔邮政信箱 法国	X100
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000-10	封片剂
振动切片机	Leica Biosystems，伊利诺伊州里士满，美国	VTS1000
	杰克逊实验室 Jackson Laboratory 600 Main Street, Bar Harbor, ME, 美国 04609		加州大学河滨分校