本方案描述了一种逐步分析呼吸力学的方法 离体 采用强制振荡技术（FOT）的小鼠模型。
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摘要
摘要
呼吸力学是通过评估肺功能容量来定义和治疗肺部病理的关键研究领域。肺力学可通过涉及不同振荡波形的各种肺部操作进行评估。当这些操作施加于肺部时，会根据对波形的响应来测量压力、容积和流量等多个变量。随后对这些信号进行计算和分析，以确定滞后性、阻力、顺应性、组织阻尼和组织弹性等参数，从而对整体肺功能进行详细评估。呼吸力学分析在评估肺移植供体肺方面尤为重要。本方案是同类中的首个方案，提供了一种全面且可重复的逐步方法，用于利用 离体 小鼠模型。内容涵盖所选动物模型、肺脏获取、保存与储存，以及基于强制振荡技术系统的实验操作。此外，还概述了数据分析、临床意义，以及强制振荡技术在研究中的应用 离体 模型
引言
肺移植是终末期肺部疾病的唯一持久治疗方法。全球每年约有4600人接受肺移植，但几乎有600名患者因合适的供体肺源短缺而在等待名单上死亡1,2。为了扩大可用肺源的范围，供体分配系统不断调整，导致外科医生需要前往更远的地方获取供体器官3。距离的增加不可避免地延长了冷缺血时间，因此需要开发额外的器官保存方法。
目前肺移植供体器官保存的标准方法是在4 °C下进行冷静态保存，保存时间限制在6-8小时，可供移植的有效时间窗口较短4然而，随着运输距离的延长以及随之增加的缺血时间，在移植前评估肺功能显得至关重要。4随着肺移植政策的不断演变，已有新型研究致力于满足这一需求。近期研究表明，将肺脏保存在10 °C的低温静态保存条件下是一种更为理想的保存温度，可显著改善肺功能、增强对损伤的抵抗力，并在移植后实现与常规方法相当的原发性移植物功能障碍发生率4,5,6,7,8此外，以……为中心的研究 离体 肺灌注（EVLP）已显著提高了供体肺的利用率和移植数量，且未对受者造成不利影响9尽管体外肺灌注（EVLP）在扩大肺移植供体来源和延长器官保存时间方面的应用已有充分记录，但该技术成本高昂、耗时较长，且需要经过专门培训才能实施10因此，有必要开发其他方法来研究 离体 全面、经济且可重复的肺功能检测方法。
传统的肺力学测量指标，例如顺应性、阻力、弹性以及压力-容积曲线，可通过体描法或使用单室模型的呼吸机技术可靠地测定。通过强迫振荡模型拟合恒定相位模型，可以获得更详细的力学信息，将气道力学区分为中央和外周两个部分（牛顿阻力、组织阻尼/弹性、滞后性）11. 尽管这些技术的应用具有良好的可重复性和全面性，但迄今为止的一个局限在于必须在体内模型中进行此类测量，推测原因是失血后肺脏在肺泡入口环处会丧失结构完整性12。本研究采用一种 commercially available 基于强迫振荡技术的小型啮齿类动物呼吸机，旨在建立一种离体（ex vivo）模型，以更精确地表征肺移植应用中的肺力学特性。
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方案
本研究经动物研究委员会批准，符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的要求。实验使用6-8周龄、体重18-28 g的C57Bl/6野生型小鼠。试剂与设备的详细信息见材料表。
1. 准备
- 所有手术操作均应使用放大倍数最高达20倍的手术显微镜。
- 手术开始前，清洁并灭菌所有手术器械。可采用高压灭菌法或使用适当的消毒溶液，以维持无菌条件。
2. 供体肺的提取
- 所有操作均需在无菌条件下进行。
注意：此步骤需在专用手术区域并严格无菌条件下进行。 - 将小鼠放入麻醉诱导室，使用5%异氟烷与氧气混合气体进行麻醉诱导，并在整个实验过程中以3.5%异氟烷与氧气混合气体维持麻醉（遵循机构批准的实验方案）。
- 在首次切口前记录小鼠体重。
- 将小鼠固定于手术台上，通过按压脚趾检查麻醉深度。若小鼠出现疼痛性回缩反应，应根据需要增加麻醉剂量。
- 按照标准操作流程从供体取出肺脏13.
注意：肺和心脏被整块取出，以进行肺灌注 离体并取出一部分气管以备后续插管使用。
3. 肺脏的保存与储存
- 将肺脏从供体取出后，使用18 G静脉套管针经气管插管，小心推进套管，确保不刺破气管。
- 用3-0丝线将气管固定在套管上，确保密封紧密。继续推进18 G静脉套管针，使其进入右心室流出道（RVOT），刚好通过肺动脉瓣。
- 记录肺脏离体时间。
- 将肺脏置于含有商品化保存液的50 mL锥形管中，于4 °C或10 °C下过夜保存。
4. 设置与校准
- 首先打开系统和/或软件电源。
- 启动程序，点击 创建新研究按钮，并按照屏幕提示定义实验方案并分配受试对象。
- 点击 实验会话，使用用户的姓名首字母和姓氏首字母登录。
- 采用一致的命名规则开始标记受试对象。
- 输入每个受试对象的性别、出生日期和体重信息。
- 选择受试对象并将其分配至测量位点，确认体重数据。
- 继续按照屏幕提示完成软件的设置与校准。
注意：在管路校准过程中，为确保一致性，使用了与供体肺插管时相同类型的套管连接至系统的Y型管路。 - 若校准值超出可接受范围，则需重复校准。
- 在准备就绪前取消启动通气的提示。带有通气和数据记录的实验会话可稍后启动。
5. 肺通气与数据采集
- 从50 mL锥形管中取出肺脏。使用先前放置的18 G静脉血管导管，以每公斤60 mL的剂量注入额外的保存液，冲洗右心室流出道（RVOT），以灌洗肺毛细血管。
注意：必须格外注意避免供体肺脏脱水，因为脱水是研究肺力学时已知的混杂因素。 - 将供体肺脏固定至呼吸机设备，并开始实验。
- 点击开始通气，准备就绪后，按下开始记录以启动实验过程。
注意：本研究所用呼吸机设置为呼吸频率150次/分钟，潮气量10 mL/kg，呼气末正压（PEEP）为3。 - 通过双击页面右侧任务列表中的任务，运行每一项肺力学评估程序。
- 运行任务列表中的深部吸气任务，以进一步确保肺不张区域被充分招募，并实现肺容积的标准化。详细信息请参见结果部分。
- 按顺序执行各项任务。
注意：可通过多个评估机械特性的任务来评价肺功能。深部吸气用于标准化肺容积，而Prime-8用于稳定肺力学状态。PV-P和PV-V用于测量静态与动态顺应性、气道阻力及导纳。Snapshot 150可快速评估阻力、顺应性和弹性模量，而QuickPrime则用于评估气道和组织阻力以及肺的黏弹性。这些任务共同确保对肺功能进行全面分析。本文中，提供了使用商用设备完成的深部吸气、Snapshot 150和QuickPrime任务的代表性结果数据。在不同扰动之间，使用深部吸气任务对肺容积进行标准化，以在数据分析时尽量减少混杂变量的影响。 - 将选定的任务序列重复运行三次。
- 点击停止记录，然后点击停止通气。
- 可单独导出数据，或继续下一个样本并重复步骤5.1–5.9。
注意：对于Snapshot 150和QuickPrime扰动所得数据，可靠分析要求COD值>0.95。
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结果
为小鼠模型提供了实验设计的图示说明（图1）。肺脏采用市售的基于强制振荡技术的小型啮齿类动物呼吸机系统进行充气，以评估供体组织在不同条件下的呼吸力学特性图2）。在比较不同组保存供体肺的结果时，储存于不同条件下的供体肺组别之间 10 °C 在所有储存在 4 °C 在所有参数中。在 10 °C 储存组中，使用 Snapshot 150 扰动评估时，供体肺显示出阻力显著降低和顺应性显著升高。在使用 QuickPrime 扰动时，观察到组织弹性、组织阻尼和滞后度呈下降趋势 10 °C 组（图3）。该组肺功能改善的潜在机制尚在研究中。初步数据显示，增加周期性牵张可减轻肺损伤，并更好地保护线粒体健康14这些初步数据表明，FOT 在研究呼吸力学和肺功能方面具有有效性、高效性和可重复性 离体 供体肺
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讨论
重要性与潜在应用
呼吸力学在多种应用中被常规用于研究肺部病理和肺损伤。尽管呼吸力学在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）等疾病进展以及机械通气情况下的研究已有大量文献报道，但其在器官移植领域的相关研究则相对较少。15,16,17,18,19此外，随着肺部分配政策的调整以及供体肺保存技术的不断发展，分析肺脏的呼吸力学特性对于优化移植预后至关重要。因此，有必要开展相关研究 离体 用于模拟和比较供体肺储存条件的动物模型。此处，一种 离体 采用小鼠模型分析供体肺在不同冷保存条件下肺功能容量的变化。
这些研究结果表明，呼吸力学参数可以在一种可靠的条件下进行测量 离体 这一方法具...
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披露
作者声明，本研究在无任何可能被解释为利益冲突的商业或财务关系下进行。
致谢
作者感谢Sophie Paczensy提供呼吸机系统，以及Colin Welsh给予的协助。图1使用biorender.com制作。 本研究获得了南卡罗来纳临床与转化研究所（美国国立卫生研究院/转化科学促进国家中心）资助，资助编号为UL1-TR001450。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 18 G 血管导管 | B. Braun | 4251687-02 | 直接口 |
| 24 G 血管导管 | B. Braun | 4251601-02 | 直接口 |
| 3 mL 注射器 | Fisher Scientific | 14-823-41 | |
| 3-0 丝线缝合线 | Medex | ETH-A304H | |
| 50 mL 圆底离心管 | Thermo Fisher | 339652 | |
| 70% 乙醇 | Fisher Scientific | BP82031GAL | |
| 麻醉诱导室 | Harvard Apparatus | 75-2030 | 适用于大鼠的密闭式麻醉诱导室 |
| 麻醉机 | Harvard Apparatus | 75-0238 | 带被动废气清除功能的移动式麻醉系统 |
| 麻醉面罩 | Harvard Apparatus | 59-8255 | 大鼠专用麻醉面罩 |
| 钝头显微镊 | World Precision Instruments | 501217 | 组织镊，12.5 cm，直型，带齿 |
| C57Bl/6 小鼠 | Charles River | Strain Code 027 | 野生型，6–8 周龄，体重 18–28 g |
| 电子天平 | Fisher Scientific | S72422 | |
| FlexiVent 系统 | Scireq | NC2926059 | 基于强制振荡技术的小型啮齿类动物呼吸机 |
| 胰岛素注射器，1 mL | Fisher Scientific | 14-841-33 | |
| 异氟烷，USP 级 | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| 手术显微镜或外科放大镜 | AmScope | SM-3BZ-80S | 3.5x – 90x 体视显微镜 |
| Perfadex 溶液 | Xvivo | 19811, 19850 | |
| 培养皿 | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 无菌棉签 | Puritan | 25-806 1WC | |
| 无菌纱布块 | Fisher Scientific | 22-037-902 | |
| 手术剪 | World Precision Instruments | 1962C | 梅岑鲍姆剪 |
参考文献
- Erdman, J., et al. Lung transplant outcomes in adults in the United States: Retrospective cohort study using real-world evidence from the SRTR. Transplantation. 106 (6), 1233-1242 (2022).
- Valapour, M., Lehr, C. OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung. , Available at: https://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2022/Lung.aspx (2022).
- Benvenuto, L., Arcasoy, S. The new allocation era and policy. J Thorac Dis. 13 (11), 6504-6513 (2021).
- Ali, A., et al. Static lung storage at 10 °C maintains mitochondrial health and preserves donor organ function. Sci Transl Med. 13 (611), eabf7601(2021).
- Wang, L., et al. The effect of ischemic time and temperature on lung preservation in a simple ex vivo rabbit model used for functional assessment. J Thorac Cardiovasc Surg. 98 (3), 333-342 (1989).
- Date, H., et al. In a canine model, lung preservation at 10 °C is superior to that at 4 °C: A comparison of two preservation temperatures on lung function and on adenosine triphosphate level measured by phosphorus 31-nuclear magnetic resonance. J Thorac Cardiovasc Surg. 103 (4), 773-780 (1992).
- Hoetzenecker, K., et al. The advent of semi-elective lung transplantation-prolonged static cold storage at 10 °C. Transpl Int. 37 (1), 12310(2024).
- Abdelnour-Berchtold, E., et al. Evaluation of 10 °C as the optimal storage temperature for aspiration-injured donor lungs in a large animal transplant model. J Heart Lung Transplant. 41 (12), 1679-1688 (2022).
- Moreno Garijo, J., Roscoe, A. Ex vivo lung perfusion. Curr Opin Anaesthesiol. 33 (1), 50-54 (2020).
- Rajab, T., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Artif Organs. 44 (1), 12-15 (2020).
- Oostveen, E., et al. The forced oscillation technique in clinical practice: Methodology, recommendations, and future developments. Eur Respir J. 22 (6), 1026-1041 (2003).
- Gibney, B., et al. Structural and functional evidence for the scaffolding effect of alveolar blood vessels. Exp Lung Res. 43 (9-10), 337-346 (2017).
- Rajab, T. Techniques for lung transplantation in the rat. Exp Lung Res. 45 (9-10), 267-274 (2019).
- Evaluation of ventilation at 10 °C as the optimal storage condition for donor lungs in a murine transplant model. Hill, M., et al. The International Society for Heart and Lung Transplantation 44th Annual Meeting and Scientific Sessions, Prague, Czech Republic, , (2024).
- Hess, D. Respiratory mechanics in mechanically ventilated patients. Respir Care. 59 (11), 1773-1794 (2014).
- Henderson, W., et al. Fifty years of research in ARDS: Respiratory mechanics in acute respiratory distress syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 196 (7), 822-833 (2017).
- Mauri, T., et al. Respiratory mechanics to understand ARDS and guide mechanical ventilation. Physiol Meas. 38 (12), R280-R303 (2017).
- Bersten, A., et al. Respiratory mechanics and surfactant in the acute respiratory distress syndrome. Clin Exp Pharmacol Physiol. 25 (11), 955-963 (1998).
- Grinnan, D., Truwit, J. Clinical review: Respiratory mechanics in spontaneous and assisted ventilation. Crit Care. 9 (5), 472-484 (2005).
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