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方法文章

药物敏感性及药物相互作用的检测 结核分枝杆菌 采用刃天青微孔板与棋盘式稀释法检测

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DOI：

10.3791/67672

⸱

2025年10月24日

 ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2University of Madras, 3Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于可视化和标准化刃天青微孔板法（REMA）及其棋盘式联合药敏试验的实验方案，以评估结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的药物敏感性及药物相互作用特征。该方法可在体外（in vitro）为优化治疗方案中的药物组合以及应对耐多药结核病提供重要依据。

摘要

多重耐药结核病（MDR-TB）的出现迫切需要快速且准确的药物敏感性试验（DST）方法，以指导有效的治疗方案。本研究介绍了一种结合刃天青微孔板法（REMA）与棋盘式联合药敏试验的方法，用于测定抗结核药物对Mycobacterium tuberculosis的最低抑菌浓度（MIC），并评估药物间的相互作用。该REMA方法采用96孔板格式，利用具有代谢活性的M. tuberculosis将刃天青染料还原，从而通过颜色变化直观判断药物敏感性。通过测试不同浓度的抗结核药物对M. tuberculosis分离株的作用，观察颜色变化以确定MIC值。随后采用棋盘式试验评估药物组合之间可能存在的协同、相加或拮抗效应。该方法操作简便、成本低廉，可在七天内获得结果，相较于传统DST方法具有显著优势。本方法为M. tuberculosis分离株的药物敏感性检测提供了有价值的参考，并有助于识别具有潜力的药物组合，从而改善对MDR-TB的治疗效果。

引言

由Mycobacterium tuberculosis引起的结核病（TB）仍然是严峻的全球公共卫生挑战，耐药菌株的出现进一步加剧了这一问题。根据世界卫生组织（WHO）的数据，2023年全球约有1060万例新增结核病病例和130万例死亡，凸显出对更有效的诊断和治疗策略的迫切需求1。由于当前治疗方案复杂、毒性大且疗程长，耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）给疾病防控带来了重大挑战2,3。

新型抗结核药物（如靶向结核分枝杆菌独特生化通路的贝达喹啉和德拉马尼）的近期问世 M. tuberculosis，代表了结核病管理领域的重大突破4,5这些药物主要被批准用于氟喹诺酮类和利福平耐药的结核病病例，作为世卫组织推荐的较长和较短耐药结核病治疗方案的一部分6,7然而，确定最佳的药物组合和给药方案，特别是这些药物与现有疗法联合使用时，仍然是一个关键的研究领域8,9目前的药物敏感性试验（DST）方法虽然可靠，但通常耗时较长、资源消耗大，且在临床或研究环境中难以用于评估复杂的药物组合10这凸显了对简单且可扩展的表型检测方法的需求，这些方法能够同时评估药物的有效性及其相互作用特征 M. tuberculosis

在这些表型方法中，刃天青微孔板法（resazurin microtiter assay, REMA）已成为评估药物敏感性的广泛接受且常规使用的方法。该方法基于代谢活跃的细菌将蓝色的刃天青染料还原为粉红色的试卤灵，从而作为细胞活力的可视性指标。尽管该方法由 Palomino 等人于 2002 年推广普及11，但利用刃天青评估细菌生长的原理可追溯至 Pital 等人的研究工作12。在过去的二十年中，REMA 方法已得到广泛验证，并被纳入分枝杆菌研究和诊断检测的标准操作程序中13,14,15。

作为REMA的补充，Caleffi-Ferracioli等人提出的棋盘式实验通过采用相同的基于刃天青的读数方法，在微稀释体系中实现了双药相互作用研究，从而扩展了REMA的应用范围16。尽管该方法在原理上具有前景，但目前仍主要作为一种研究工具，适用于在早期临床前评估阶段筛选潜在的药物协同或拮抗组合，而非作为常规诊断检测方法。

本文并未将REMA或其棋盘式变体作为新方法提出。本研究的目的是提供一种用于最低抑菌浓度（MIC）测定和药物相互作用测试的有用且经过验证的方法的可视化展示，该方法已在先前的研究中被描述并成功应用。我们提供了一个逐步操作的实验方案，详细指导接种物制备、药物滴定、平板布局、MIC结果判读以及棋盘式相互作用分析。本文旨在促进REMA和棋盘式实验在结核病药物研发及实验药理学中更广泛、更一致的应用。

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方案

注意：示例实验中使用的化学品和材料详见材料表文件。

1. 7H9-S 培养基的制备

  1. 配制 100 mL 7H9-S 培养基时，称取 0.47 g 7H9 粉末和 0.1 g 酪蛋白胨，溶于 90 mL 蒸馏水中，搅拌至完全溶解。
  2. 将肉汤转移至 250 mL 锥形瓶中，在 121 °C 高压灭菌器中灭菌 15 分钟。
  3. 灭菌后待其冷却，加入 10 mL 油酸白蛋白葡萄糖催化酶（OADC）添加剂和 0.5 mL 甘油。
  4. 于 37 °C 培养过夜以检测无菌状态。
    注意：通过在 37 °C 培养过夜来验证所配制的 7H9-S 培养基的无菌性。次日培养基应保持澄清，无浑浊现象。
  5. 将 7H9-S 培养基置于 4 °C 避光保存。

2. M.tuberculosis  接种物制备

  1. 从在罗氏（Lowenstein Jensen，LJ）固体培养基上培养的结核分枝杆菌（M.tuberculosis）制备接种物
    1. 使用无菌接种环，从新近培养（21–28 天）的 LJ 培养基上取一满环结核分枝杆菌（M. tuberculosis）菌落。
      注意：操作时应小心避免刮取过深，以免扰动较老的菌落。
    2. 将采集的细菌转移至含有无菌玻璃珠和 2.5 mL 7H9-S 肉汤的无菌小瓶（bijou bottle）中。确保玻璃珠有助于在涡旋振荡过程中机械性地破坏菌团。
      注意：为获得可靠的药敏试验结果，必须使用培养 21–28 天的新鲜菌种。避免使用陈旧菌种，因其可能导致结果不一致。
    3. 盖紧小瓶，剧烈涡旋振荡至少 1 分钟。持续混匀以充分打散细菌团块，形成相对浑浊的菌悬液。目标是使细菌在培养基中均匀分布。
    4. 将菌悬液转移至新的无菌小瓶中，静置 15 分钟，避免扰动。此步骤可使较大的菌团沉降至瓶底。
    5. 以 McFarland 1.0 标准比浊管为参照，检测菌悬液的浊度，并用 7H9-S 肉汤调整至目标浊度。
      注意：McFarland 标准（通常为 1.0）用于表示约相当于 1.97 × 106 CFU/mL 的浊度17。该标准通过混合 0.1 mL 1% 氯化钡与 9.9 mL 1% 硫酸，生成硫酸钡细小沉淀，从而产生标准浊度。将菌悬液与 McFarland 标准管并排置于带有黑色刻线的白色背景前进行目视比较，并调整菌悬液浊度至与标准一致。
  2. 从在 7H9 液体培养基中培养的结核分枝杆菌（M.tuberculosis）制备接种物
    1. 使用无菌移液器，将 2.5 mL 培养 2–3 周的结核分枝杆菌（M. tuberculosis）菌液转移至含有玻璃珠的新无菌小瓶中。
    2. 涡旋振荡混合物至少 1 分钟，以确保形成均匀的菌悬液。涡旋过程有助于打散可能存在的菌团。
    3. 将 2.5 mL 菌悬液转移至新的无菌小瓶中，静置 15 分钟，使菌团沉降至底部。
    4. 将菌悬液浊度与 McFarland 1.0 标准进行比对，并用 7H9-S 肉汤调整至所需浓度。
  3. 接种物的稀释
    1. 制备 1:10 稀释液：在无菌容器中，将 1 mL 菌悬液加入 9 mL 7H9-S 肉汤中进行稀释（此稀释后浓度约为 1.97 × 105 CFU/mL）。

3. 抗生素的配制与保存

  1. 储备液和工作液的配制：按照表1中总结的方法，配制本示例实验所用药物及其储备液和工作液。
    1. 异烟肼（INH 或 I）：配制浓度为 1 mg/mL 的异烟肼储备液时，将 2 mg 异烟肼粉末溶解于 2.0 mL 蒸馏水中。使用 0.22 µm 注射器滤器对溶液进行除菌。
    2. 莫西沙星（MOX 或 M）：配制浓度为 1 mg/mL 的莫西沙星储备液时，将 2 mg 莫西沙星粉末溶解于 2.0 mL 蒸馏水中。使用 0.22 µm 注射器滤器对溶液进行除菌。
    3. 贝达喹啉（BDQ 或 J）：贝达喹啉在水中溶解度较差。配制浓度为 1 mg/mL 的储备液时，将 2 mg 贝达喹啉粉末溶解于 2.0 mL 二甲基亚砜（DMSO）中。使用 0.22 µm 注射器滤器对溶液进行除菌。
    4. 德拉马尼（DEL 或 D）：与贝达喹啉类似，德拉马尼在水中溶解度也较差。配制浓度为 1 mg/mL 的储备液时，将 2 mg 德拉马尼粉末溶解于 2.0 mL 二甲基亚砜（DMSO）中。使用 0.22 µm 注射器滤器对溶液进行除菌。
  2. 储存：将每种药物储备液分别分装至无菌冻存管中，每管 100 µL，于 -20 °C 保存，可稳定保存长达 3 个月。一旦解冻后，剩余溶液应丢弃，不得再次冷冻。

4. 刃天青溶液的配制与保存

  1. 将刃天青溶于蒸馏水中，配制成终浓度为 0.01% 或 0.02% 的溶液。使用 0.2 µm 滤膜过滤该溶液以实现灭菌。
  2. 将灭菌后的刃天青溶液置于 4 °C 避光保存，可稳定存放 1–2 周，防止降解。

5. REMA 平板的制备

注意：有关 REMA 96 孔微量滴定板设置的可视化指南，请参见图 1。该 96 孔板提供了足够的空间，可对每种药物在六个两倍稀释浓度下进行重复药物检测。

  1. 加入7H9-S肉汤：使用多通道移液器，向第2-11列、B-G行的各孔中加入100 µL 7H9-S肉汤。确保所有孔中的分布均匀。
  2. 加入药物溶液：向B2和B6孔中加入100 µL工作浓度的异烟肼（INH）溶液。同样，将莫西沙星（MOX）、德拉马尼（DEL）和贝达喹啉（BDQ）的工作溶液分别加入对应的孔中（B3和B7、B4和B8、B5和B9）。
  3. 稀释药物浓度：使用多通道移液器，从B行到G行（第2-9列）进行两倍系列稀释，注意在G行混匀后弃去最后的100 µL。
  4. 生长对照孔：向B10和C10孔中各加入100 µL 7H9-S肉汤，作为生长对照。
  5. 阴性对照和无菌对照：向B11和C11孔中各加入200 µL 7H9-S肉汤，作为阴性对照和无菌对照。
  6. 防止蒸发：向所有外周孔中加入200 µL无菌蒸馏水，以减少孵育过程中的蒸发。
  7. 接种平板：除阴性对照孔外，向每个孔接种100 µL 1:10稀释的菌液悬液。确保所有孔的接种均匀一致。
  8. 封板并孵育：将平板用塑料袋密封以维持无菌状态，并在37 °C下孵育7天。

6. REMA 棋盘滴定实验

注意：有关药物组合（例如 BDQ 和 DEL）的 REMA 棋盘式滴定试验模板的可视化指南，请参见图 2A、 B。

  1. 垂直和水平稀释药物：将第一种药物（BDQ）沿垂直方向（B-H行）稀释，第二种药物（DEL）沿水平方向（2-8列）稀释，以生成多种双药组合。
    注意：对于水平稀释的药物，需在无菌小瓶中制备系列稀释的工作液（从4 µg/mL至0.06 µg/mL）。
  2. 添加用于垂直稀释的BDQ工作液：向B2和B8孔中各加入100 µL BDQ工作液。
  3. 加入7H9-S培养基：使用多通道移液器，向C2-H8列各孔中加入50 µL 7H9-S培养基。确保所有孔中的分布均匀。
  4. 稀释药物浓度：使用多通道移液器，在B-H行（2-8列）进行两倍系列稀释，每次混匀后在H行最后一排弃去50 µL。
  5. 添加用于水平稀释的DEL工作液：将药物从4 µg/mL至0.06 µg/mL的系列稀释工作液分别加入对应的孔中。
  6. 生长对照孔：向B9和C9孔中各加入100 µL 7H9-S培养基，作为生长对照。
  7. 阴性对照和无菌对照：向B10和C10孔中各加入200 µL 7H9-S培养基，作为阴性对照和无菌对照。
  8. 接种平板：除阴性对照孔外，向每个孔接种100 µL 1:10稀释的菌液悬液。确保所有孔的接种均匀一致。
  9. 封板并培养：将平板用塑料袋密封以维持无菌状态，并在37 °C下培养7天。

7. 孵育与结果判读

  1. 刃天青染色：孵育 7 天后，向每孔加入 30 µL 刃天青（0.01%–0.02%）。密封后过夜孵育，以促进显色。
  2. 判断颜色变化。
    1. 在一致的白光或日光平衡光源下目视观察各孔。
      注意：生长对照孔（无药物）应由蓝色变为粉红色，表明细菌代谢活跃。蓝色表示完全抑制生长；粉红色表示活跃生长，而紫色（混合色调）表示部分抑制。
    2. 为准确判读，将颜色强度与阴性对照（仅培养基）和阳性对照（无药物的细菌生长）进行比较。为减少观察者偏差，建议采用双人独立判读或对培养板进行拍照记录。
      注意：目视判断可能受环境光照条件影响，因此必须保持光照条件一致。
  3. 最低抑制浓度（MIC）
    1. 将 MIC 定义为药物最低浓度，此时孔内仍保持完全蓝色，表明代谢活性被抑制 ≥99%。呈现紫色或粉红色的孔提示存在部分或完全生长。
      注意：REMA 法测定 MIC 的原理近似于经典比例法，即 MIC 被定义为相对于无药对照组抑制 ≥99% 接种菌量的最低药物浓度。尽管 REMA 不依赖菌落形成单位（CFU）计数，但其视觉终点表型上对应于该基于比例的阈值。此解释与先前建立的比色法方案一致11,14。

8. 部分抑菌浓度（FIC）指数的计算

注意：部分抑菌浓度（FIC）指数有助于确定两种药物之间的相互作用（协同作用、拮抗作用或无关作用）。该指数根据棋盘法实验获得的最小抑菌浓度（MIC）值进行计算。

  1. 确定每种药物单独使用时的最低抑菌浓度（MIC）：根据 REMA 实验结果，确定每种药物单独使用时的 MIC。
  2. 确定联合用药时每种药物的最低抑菌浓度（MIC）：通过棋盘滴定实验，确定每种药物在与第二种药物联合使用时的 MIC。
  3. 计算每种药物的 FIC（部分抑菌浓度）。
    注：FIC 和 FIC 指数的计算公式参见表 2。表 3 显示了基于 REMA 实验的汇总 MIC 数据。表 4 展示了代表性的 MIC 和 FIC 指数值。
    1. 按以下方式解释 FIC 指数：
      FIC ≤ 0.5：表示协同作用——两种药物联用对细菌生长的抑制效果优于任一药物单独使用。
      FIC > 0.5 至 < 4.0：表示相加作用——联合效应等于各单独效应之和。
      ​FIC ≥ 4.0：表示拮抗作用——两种药物相互干扰彼此的活性。
  4. 示例：计算 BDQ 与 DEL 在 H37Rv 菌株中的 FIC 指数
    1. 确定 BDQ 对 H37Rv 的 MIC（例如，0.125 µg/mL）。当与 DEL 联合使用时，记录 BDQ 的 MIC 为 0.03 µg/mL。
    2. 确定 DEL 对 H37Rv 的 MIC（例如，0.063 µg/mL）。当与 BDQ 联合使用时，记录 DEL 的 MIC 为 0.125 µg/mL。
    3. 计算 BDQ 的 FIC：
      FIC(BDQ) = 联合用药时 BDQ 的 MIC / 单独用药时 BDQ 的 MIC = 0.03 / 0.125 = 0.24
    4. 计算 DEL 的 FIC：FIC(DEL) = 联合用药时 DEL 的 MIC / 单独用药时 DEL 的 MIC = 0.125 / 0.063 = 1.98
    5. 将两个 FIC 相加得到 FIC 指数：FIC 指数 = FIC(BDQ) + FIC(DEL) = 0.24 + 1.98 = 2.26
    6. 解释结果。
      注：FIC 指数为 2.26，落在相加作用范围内（>0.5 至 <4.0），表明 BDQ 与 DEL 联合对结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的生长抑制具有相加效应。

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结果

通过REMA实验测定抗结核药物的最低抑菌浓度
贝达喹啉、德拉马尼、莫西沙星和异烟肼对药物敏感性H37RV及耐药性临床分离株的活性采用REMA方法进行评估 M. tuberculosis贝达喹啉、德拉马尼和异烟肼的使用浓度范围为1 µg/mL至0.03 µg/mL，莫西沙星的浓度范围为2 µg/mL至0.06 µg/mL。耐药临床分离株的细菌悬液 M. tuberculosis 然后接种H37Rv并加入不同浓度的药物，培养7天。

Bedaquiline在0.25至0.125 µg/mL浓度范围内、Delamanid在0.063 µg/mL浓度下以及Moxifloxacin在0.063 µg/mL浓度下，对药物敏感的H37RV株和耐药性临床分离的M. tuberculosis菌株的细菌生长活力均表现出显著的浓度依赖性抑制，抑制率均达到0%（表3）。Bedaquiline、Delamanid和Moxifloxacin均显示出对结核分枝杆菌（MTB）的抑制作用，...

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讨论

耐药结核病（DR-TB）所构成的全球性威胁已成为一个紧迫问题1,19。这迫切需要开发更优、更快速的药物敏感性检测（DST）方法，特别是针对二线和新型抗结核药物的检测方法。此类方法对于优化治疗策略、有效管理抗结核药物以及降低疾病进展和进一步产生耐药性的风险至关重要20。在此背景下，一种能够同时评估药物敏感性和药物相互作用特征的方法将带来显著优势，有助于改善治疗效果，并支持更有效的结核病防控策略。

刃天青（Resazurin）是一种对氧化还原敏感的染料，广泛用于细菌活力检测中作为代谢活性的指示剂21。刃天青微量滴定板法（Resazurin Microtiter Assay, REMA）及其棋盘式联合检测法是评估单个抗结核药物及其联合用药效果的经济、可靠的工具11,16

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
250 mL 方形瓶，带盖肖特杜伦218203655培养基制备
7H9肉汤Becton Dickinson271310结核分枝杆菌培养基（室温）
带盖96孔板康宁359696孔透明平底聚苯乙烯TC处理微孔板，独立包装，带盖，无菌（室温）
ART-Tips（1000 μLTARSONS528106疏水性聚乙烯滤膜  聚丙烯架装滤芯吸头-无菌（室温）
ART-Tips（200 μLTARSONS528104疏水性聚乙烯滤膜  聚丙烯架装滤芯吸头-无菌（室温）
二水合氯化钡默克217565麦康凯标准比浊管制备（室温）
贝达喹啉（BDQ）Jansen 和 JansenJansen 和 Jansen 赠予抗结核药物（4 °C)
CasitoneBecton Dickinson225930细菌培养补充剂（室温）
德拉马尼（DEL）大冢制药大冢制药赠送抗结核药物（4 °C)
二甲基亚砜Sigma-Aldrich67-68-5药物储备液的配制（室温）
过滤 0.2 μmMilliporeSLGVR33RS0.22  μm PVDF，一次性无菌注射器滤器（室温）
甘油默克356350加入培养基中（室温）
接种环Sigma-AldrichI8263用于培养物悬液制备（室温）
异烟肼（INH）Sigma-AldrichI3377-5G抗结核药物（4 °C)
LJ 培养基斜面BD Mycobactosel221414结核分枝杆菌培养基（4 °C)
McCartney Bijou 窄口瓶，14 mLSupertek12.124.0014用于培养物悬液制备（室温）
McCartney Bijou 细口瓶，7 mLSupertek12.124.0007用于培养物悬液制备（室温）
微量移液器（1000 μLGilsonF144059M用于精确液体操作（室温）
微量移液器（200 μLGilsonFA10005M用于精确液体操作（室温）
莫西沙星（MOX）Sigma-AldrichSML1581-50MG抗结核药物（4 °C)
多通道移液器（20–200 μLVWR849070024用于在多个孔之间同时进行移液
OADCBecton Dickinson211886细菌培养补充剂（4 °C)
移液器吸头填充器默克Z333980精确液体操作（室温）
刃天青钠盐Sigma-Aldrich62758-13-8REMA实验（室温）用氧化还原指示剂
10 mL 血清移液管康宁CLS4100使用无菌聚苯乙烯一次性移液管（室温）
实心玻璃珠，直径 6 mmSigma-AldrichZ265950用于培养物悬液制备（室温）
硫酸 95–97%默克100731McFarland 标准液制备（室温）
滤器用注射器Dispo Van100032适用于注射器滤器
涡旋混合器REMICM-101 PLUS用于培养物悬液的制备
自封口塑料袋Sigma-AldrichZ162949

参考文献

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