药物敏感性及药物相互作用的检测 结核分枝杆菌 采用刃天青微孔板与棋盘式稀释法检测

摘要

本文介绍了一种用于可视化和标准化刃天青微孔板法（REMA）及其棋盘式联合药敏试验的实验方案，以评估结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的药物敏感性及药物相互作用特征。该方法可在体外（in vitro）为优化治疗方案中的药物组合以及应对耐多药结核病提供重要依据。

摘要

多重耐药结核病（MDR-TB）的出现迫切需要快速且准确的药物敏感性试验（DST）方法，以指导有效的治疗方案。本研究介绍了一种结合刃天青微孔板法（REMA）与棋盘式联合药敏试验的方法，用于测定抗结核药物对Mycobacterium tuberculosis的最低抑菌浓度（MIC），并评估药物间的相互作用。该REMA方法采用96孔板格式，利用具有代谢活性的M. tuberculosis将刃天青染料还原，从而通过颜色变化直观判断药物敏感性。通过测试不同浓度的抗结核药物对M. tuberculosis分离株的作用，观察颜色变化以确定MIC值。随后采用棋盘式试验评估药物组合之间可能存在的协同、相加或拮抗效应。该方法操作简便、成本低廉，可在七天内获得结果，相较于传统DST方法具有显著优势。本方法为M. tuberculosis分离株的药物敏感性检测提供了有价值的参考，并有助于识别具有潜力的药物组合，从而改善对MDR-TB的治疗效果。

引言

由Mycobacterium tuberculosis引起的结核病（TB）仍然是严峻的全球公共卫生挑战，耐药菌株的出现进一步加剧了这一问题。根据世界卫生组织（WHO）的数据，2023年全球约有1060万例新增结核病病例和130万例死亡，凸显出对更有效的诊断和治疗策略的迫切需求¹。由于当前治疗方案复杂、毒性大且疗程长，耐多药结核病（MDR-TB）和广泛耐药结核病（XDR-TB）给疾病防控带来了重大挑战^2,3。

新型抗结核药物（如靶向结核分枝杆菌独特生化通路的贝达喹啉和德拉马尼）的近期问世 M. tuberculosis，代表了结核病管理领域的重大突破^4,5这些药物主要被批准用于氟喹诺酮类和利福平耐药的结核病病例，作为世卫组织推荐的较长和较短耐药结核病治疗方案的一部分^6,7然而，确定最佳的药物组合和给药方案，特别是这些药物与现有疗法联合使用时，仍然是一个关键的研究领域^8,

方案

注意：示例实验中使用的化学品和材料详见材料表文件。

1. 7H9-S 培养基的制备

1. 配制 100 mL 7H9-S 培养基时，称取 0.47 g 7H9 粉末和 0.1 g 酪蛋白胨，溶于 90 mL 蒸馏水中，搅拌至完全溶解。
2. 将肉汤转移至 250 mL 锥形瓶中，在 121 °C 高压灭菌器中灭菌 15 分钟。
3. 灭菌后待其冷却，加入 10 mL 油酸白蛋白葡萄糖催化酶（OADC）添加剂和 0.5 mL 甘油。
4. 于 37 °C 培养过夜以检测无菌状态。
   注意：通过在 37 °C 培养过夜来验证所配制的 7H9-S 培养基的无菌性。次日培养基应保持澄清，无浑浊现象。
5. 将 7H9-S 培养基置于 4 °C 避光保存。

2. M.tuberculosis  接种物制备

1. 从在罗氏（Lowenstein Jensen，LJ）固体培养基上培养的结核分枝杆菌（M.tuberculosis）制备接种物
   1. 使用无菌接种环，从新近培养（21–28 天）的 LJ 培养基上取一满环结核分枝杆菌（M. tuberculosis....

结果

通过REMA实验测定抗结核药物的最低抑菌浓度
贝达喹啉、德拉马尼、莫西沙星和异烟肼对药物敏感性H37RV及耐药性临床分离株的活性采用REMA方法进行评估 M. tuberculosis贝达喹啉、德拉马尼和异烟肼的使用浓度范围为1 µg/mL至0.03 µg/mL，莫西沙星的浓度范围为2 µg/mL至0.06 µg/mL。耐药临床分离株的细菌悬液 M. tuberculosis 然后接种H37Rv并加入不同浓度的药物，培养7天。

Bedaquiline在0.25至0.125 µg/mL浓度范围内、Delamanid在0.063 µg/mL浓度下以及Moxifloxacin在0.063 µg/mL浓度下，对药物敏感的H37RV株和耐药性临床分离的M. tuberculosis菌株的细菌生长活力均表现出显著的浓度依赖性抑制，抑制率均达到0%（表3）。Bedaquiline、Delamanid和Moxifloxacin均显示出对结核分枝杆菌（MTB）的抑制作用，.......

讨论

耐药结核病（DR-TB）所构成的全球性威胁已成为一个紧迫问题^1,19。这迫切需要开发更优、更快速的药物敏感性检测（DST）方法，特别是针对二线和新型抗结核药物的检测方法。此类方法对于优化治疗策略、有效管理抗结核药物以及降低疾病进展和进一步产生耐药性的风险至关重要²⁰。在此背景下，一种能够同时评估药物敏感性和药物相互作用特征的方法将带来显著优势，有助于改善治疗效果，并支持更有效的结核病防控策略。

刃天青（Resazurin）是一种对氧化还原敏感的染料，广泛用于细菌活力检测中作为代谢活性的指示剂²¹。刃天青微量滴定板法（Resazurin Microtiter Assay, REMA）及其棋盘式联合检测法是评估单个抗结核药物及其联合用药效果的经济、可靠的工具^11,16

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
250 mL 方形瓶，带盖	肖特杜伦	218203655	培养基制备
7H9肉汤	Becton Dickinson	271310	结核分枝杆菌培养基（室温）
带盖96孔板	康宁	3596	96孔透明平底聚苯乙烯TC处理微孔板，独立包装，带盖，无菌（室温）
ART-Tips（1000 μL	TARSONS	528106	疏水性聚乙烯滤膜  聚丙烯架装滤芯吸头-无菌（室温）
ART-Tips（200 μL	TARSONS	528104	疏水性聚乙烯滤膜  聚丙烯架装滤芯吸头-无菌（室温）
二水合氯化钡	默克	217565	麦康凯标准比浊管制备（室温）
贝达喹啉（BDQ）	Jansen 和 Jansen	Jansen 和 Jansen 赠予	抗结核药物（4 °C)
Casitone	Becton Dickinson	225930	细菌培养补充剂（室温）
德拉马尼（DEL）	大冢制药	大冢制药赠送	抗结核药物（4 °C)
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	67-68-5	药物储备液的配制（室温）
过滤 0.2 μm	Millipore	SLGVR33RS	0.22  μm PVDF，一次性无菌注射器滤器（室温）
甘油	默克	356350	加入培养基中（室温）
接种环	Sigma-Aldrich	I8263	用于培养物悬液制备（室温）
异烟肼（INH）	Sigma-Aldrich	I3377-5G	抗结核药物（4 °C)
LJ 培养基斜面	BD Mycobactosel	221414	结核分枝杆菌培养基（4 °C)
McCartney Bijou 窄口瓶，14 mL	Supertek	12.124.0014	用于培养物悬液制备（室温）
McCartney Bijou 细口瓶，7 mL	Supertek	12.124.0007	用于培养物悬液制备（室温）
微量移液器（1000 μL	Gilson	F144059M	用于精确液体操作（室温）
微量移液器（200 μL	Gilson	FA10005M	用于精确液体操作（室温）
莫西沙星（MOX）	Sigma-Aldrich	SML1581-50MG	抗结核药物（4 °C)
多通道移液器（20–200 μL	VWR	849070024	用于在多个孔之间同时进行移液
OADC	Becton Dickinson	211886	细菌培养补充剂（4 °C)
移液器吸头填充器	默克	Z333980	精确液体操作（室温）
刃天青钠盐	Sigma-Aldrich	62758-13-8	REMA实验（室温）用氧化还原指示剂
10 mL 血清移液管	康宁	CLS4100	使用无菌聚苯乙烯一次性移液管（室温）
实心玻璃珠，直径 6 mm	Sigma-Aldrich	Z265950	用于培养物悬液制备（室温）
硫酸 95–97%	默克	100731	McFarland 标准液制备（室温）
滤器用注射器	Dispo Van	100032	适用于注射器滤器
涡旋混合器	REMI	CM-101 PLUS	用于培养物悬液的制备
自封口塑料袋	Sigma-Aldrich	Z162949