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小鼠耳部皮内接种Mycobacterium avium

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DOI：

10.3791/67675

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2025年7月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Global Infectious Disease Research, Seattle Children's Research Institute, 2Department of Pediatrics, University of Washington School of Medicine, 3Department of Global Health, University of Washington

本文内容

摘要

本文介绍一种在小鼠耳部进行低剂量Mycobacterium avium皮内接种的实验方案，以模拟暴露样条件。

摘要

与基于缓慢复制生物体的自然非结核分枝杆菌（NTM）暴露或感染不同，小鼠模型中的气溶胶感染可导致肺部细菌生长显著增加。慢性气溶胶感染和全身性感染可用抗分枝杆菌药物治疗，这些治疗也可能反映先前的暴露情况，但这些方法耗时较长，且与自然暴露情况的相似性较低。本实验方案的目标是建立一种侵入性更小、更贴近临床转化的模拟NTM暴露条件的小鼠模型。本文介绍了一种通过耳部组织对临床前小鼠进行Mycobacterium avium（M. avium）皮内攻击的方法，以模拟暴露过程，并诱导针对该细菌的免疫反应，而不引发明显疾病。本文描述了皮内耳部注射技术，并证实了分枝杆菌感染的持续存在且局限在局部，从而为在该体内模型中进一步研究免疫应答提供了可能。

引言

非结核分枝杆菌（NTM）是一类不断扩增的菌种，包含一组常难以治疗的致病性细菌1,2NTM 可存在于土壤、水和水气溶胶等环境来源中3,4,5尽管有报告趋势表明非结核分枝杆菌（NTM）感染呈上升趋势，但作为一类疾病，它们在美国不到20个州被常规报告。6,7患有特定合并症的个体，包括囊性纤维化患者或正在使用免疫抑制药物的个体，发生致病性非结核分枝杆菌（NTM）有效感染的风险增加2然而，健康个体通常会通过环境来源反复持续地接触非结核分枝杆菌（NTM），但不会引发强烈的或慢性的感染。有一些证据表明，NTM的暴露可能“预处理”整体免疫反应 疫苗接种中针对分枝杆菌抗原的免疫反应8，暴露于其他分枝杆菌后的结局，以及诊断检测9但迄今为止，此类暴露的临床前建模一直存在困难。

慢性肺部感染10 并且，用于病原体特异性疫苗效力研究的处理方法并不能代表相对无害的环境暴露及其可能引发的明显不同的免疫应答。例如，慢性感染可导致组织严重损伤和播散性病变。10近年来，已有研究进展致力于填补这一科研空白，包括提供非结核分枝杆菌（NTM）暴露的小鼠模型 通过 来自 Henao-Tamayo 实验室的饮用水11，对此暴露后的免疫反应进行了深入研究。潜伏性结核病（TB）是分枝杆菌感染的另一种疾病状态，在临床前动物模型中较难模拟。Kaufmann 实验室率先采用耳部皮内感染方法 M. tuberculosis 在 C57BL/6 中12 和 NOS2-/-13 小鼠以模拟潜伏性结核感染、再激活，并表征低氧肉芽肿的机制。Nemeth 等人利用局限性皮内耳部模型模拟既往暴露于 M. tuberculosis，以表征不同的免疫反应，从而确定其对后续攻毒结果的影响14。已有成功报道采用10的皮内耳部模型4 菌落形成单位（CFU） M. tuberculosis 菌株H37Rv和Erdman，但迄今为止尚未使用非结核分枝杆菌（NTM）分离株进行测试。

本方法的总体目标是建立一种可重复的非结核分枝杆菌（NTM）耳部攻毒模型，该模型可限制其他攻毒途径所导致的疾病，从而进一步研究暴露后免疫应答。使易感的C57BL/6小鼠饮用含有高剂量M. avium的水，所产生的感染样状态较其他暴露方式更为显著11。因此，本技术的建立依据在于既往成功使用M. tuberculosis作为耳部真皮攻毒病原体的经验，且所用攻毒剂量相对较高12,13,14。在此，我们旨在评估该模型是否可成功适用于此前报道浓度一半的M. avium分离株12,13,14（102 CFU）。我们预期，推进新型NTM暴露（而非感染）模型的发展，将有助于解答有关此类暴露对健康以及未来感染/疫苗接种动态影响的重要生物学问题。

方案

雌性C57BL/6小鼠购自一家实验动物供应实验室，年龄为6-7周。小鼠饲养于西雅图儿童研究所（SCRI）生物安全二级（BSL-2）动物设施中，在无病原体条件下饲养，并按照SCRI机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的实验方案进行操作。所有实验方法均遵循有关动物福利的相关指南和规定。该机构持有美国农业部（USDA）证书编号#91-R-0061和公共卫生服务部（PHS）保证编号#A4337-01。本研究中所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。

1. 接种用细菌菌种的制备

  1. 在适合细菌操作的生物安全柜中，从 -80 °C 保存条件下取出一管 Mycobacterium avium（ATCC 25291）菌种，于室温下解冻。
    注意：根据所有菌种材料的最佳操作规范，M. avium 的储存浓度应预先通过在 7H10 琼脂平板上接种系列稀释液并计数菌落形成单位（CFU）来确定。
  2. 使用 26 G 规格的钝头针，将液体在 1.0 mL 注射器中反复抽吸 10 次或更多次，使菌液充分重悬，形成均匀的悬浮液。
  3. 通过将悬浮液进行 1:10 系列稀释后，取 100 µL 涂布于 7H10 琼脂平板，检测 M. avium 的浓度。将平板在 37 °C 培养 3 周，计数菌落，以确保接种物浓度准确。
  4. 用无菌 PBS 稀释样品，将 M. avium 浓度调整至所需剂量。调整后置于室温保存，待用。
    注意：本实验中使用的剂量为每 10 µL 含 102 CFU。

2. 实验动物的准备与麻醉

  1. 在给予麻醉剂之前，准备一个温暖的表面（如加热垫），用于放置已接种小鼠的笼子，以帮助其在恢复期间调节体温。
  2. 向小鼠注射氯胺酮（100 mg/mL）与赛拉嗪（20 mg/mL）混合溶液 通过 腹腔注射途径。
  3. 麻醉后，通过捏压脚趾确认小鼠已达到手术操作所需的麻醉深度。
  4. 双侧眼部涂抹润滑剂。

3. 接种平台及材料准备

  1. 使用泡沫板制作一个平台，使小鼠在操作过程中能够稳定站立。
    注意：双面胶带有助于将小鼠耳朵平整地固定在平台上，但粘性不宜过强，以保持耳部组织健康。
  2. 准备带光源的放大镜以观察平台。
  3. 在附近准备好无菌的汉密尔顿注射器和工作用的M. avium制剂。

4. 耳部真皮接种

  1. 将小鼠仰卧放置在平台边缘，使其耳朵能够贴附在双面胶带上。
  2. 轻轻按压使耳朵平整贴紧胶带，确保耳朵不会移动。
    注意：注射前可用酒精棉片擦拭耳朵，以减少皮肤共生菌在注射后造成交叉污染和感染的风险。但在未使用酒精棉片的预实验中，并未观察到此类感染。
  3. 用无菌的汉密尔顿注射器抽取10 µL含有100 CFU的M. avium菌液。
    注意：抽取10 µL前应轻轻涡旋混匀M. avium悬液，确保其均匀一致。
  4. 一手持平台，另一手持汉密尔顿注射器，确保针头斜面朝上（图1）。
  5. 将汉密尔顿注射器置于耳皮下，施加极轻微的压力，注意针头不要完全穿透薄薄的耳组织。
  6. 针头到位后，缓慢而平稳地推动注射器推杆。
  7. 给药过程中观察耳朵的颜色变化。
    注意：成功给药的表现为注射部位出现不透明的隆起，形似水泡。
  8. 完成给药后，检查小鼠耳朵和胶带是否有渗漏迹象。
    注意：若发生渗漏，可估算损失剂量并在对侧耳朵补注相应剂量。最低限度应标记该动物并记录为可能接受了低于目标剂量的处理。
  9. 给药成功后，确保将小鼠放回其原饲养笼，使其接触温暖表面，并在麻醉恢复期间持续监测，直至完全清醒。

5. 细菌负荷评估

  1. 根据机构动物护理和使用委员会批准的方案对动物实施安乐死。
    1. 此处，每只动物的安乐死需采用至少两种方法。本实验中选择的方法为二氧化碳（CO2）窒息法和颈椎脱臼法。
    2. 首先，将导管伸入小鼠的饲养笼中，通入CO2气体，直至小鼠完全停止活动。注意使用不会导致气体泄漏的笼具。
    3. 随后，通过手动操作使颈椎脱位。
  2. 在M. avium感染后四周（28天，与先前研究一致12）解剖感染动物的耳组织。使用无菌器械解剖2只小鼠的耳组织，并将其置入含有CFU缓冲液（PBS + 0.05% Tween80）的锥形管中，利用组织匀浆器充分匀浆，直至形成均匀悬液。未感染的耳组织同样处理，作为对照。
    注：可根据需要选择不同的感染后时间点及目标器官。本实验中还采集了肺、脾、引流淋巴结和脑组织。
  3. 取100 µL匀浆液加入深孔板中的700 µL CFU缓冲液中，进行1/8倍稀释。在深孔板中依次进行系列稀释，至少制备5个连续稀释度。取50–100 µL原液或系列稀释液（本实验使用0至5号稀释液）接种于7H10琼脂三联平板，用T型涂布棒均匀涂布，于37 °C、5% CO2条件下培养2–3周。
  4. 计数菌落形成单位（CFU），并将其转换为以log10为单位的数据，以便在电子表格软件中进行分析。

结果

我们采用上述详细方案，以耳部真皮作为感染或暴露途径，评估是否可建立一种可重复的非结核分枝杆菌（NTM）攻毒模型。在攻毒后第28天采集两只动物的耳组织，进行匀浆处理，并按描述接种至分枝杆菌选择性7H10培养基上。我们观察到，在经皮内攻毒的耳组织中，M. avium 可持续存在至第28天，而在未攻毒的对侧耳组织中未检测到 M. avium（图2）。

尽管在感染后28天内我们未观察到病原体扩散至未受攻击的耳部，但其他使用该耳部真皮模型进行潜伏结核建模的研究者已观察到病原体向其他远端器官位点的扩散14我们假设，较低剂量的攻毒以及使用 M. avium 分离株可能会减少后续时间点的传播，从而更真实地反映暴露情况 与 慢性感染。因此，对 n=5 的组群实施了安乐死 M. avium 在感染后第28、56、90和132天对小鼠进行攻毒。以下器官采用与耳组织相同的方案进行匀浆处理：肺、脾、引流淋巴结（DLN）和脑。该攻毒途径导致随时间推移出现零星播散，其中在感染后56天或90天时，少于一半的动物在所检测器官中出现可计数的CFU表1。在攻毒后第132天，所有小鼠均检测到 M. avium 在脾脏中（评估的5只动物中有5只呈阳性），但在该时间点，其他器官中细菌含量极低（引流淋巴结中5只动物有1只呈阳性）或未检出（肺或脑中5只动物均未检出）表1).

啮齿类动物手术示意图、针具、实验步骤、科学研究、实验室设备。
图1：针头斜面朝上的方向。 在插入针头之前，必须使斜面朝上，以正确接种接种物。 请点击此处查看该图的放大版本。

受挑战与未受挑战样本的细菌培养实验；CFU Log₁₀ 结果图。
图 2：感染后28天 M. avium 在耳组织中的定植情况。 雌性C57BL/6小鼠耳部接种102 CFU的Mycobacterium avium。在感染后28天比较接种耳（+）与未接种耳（-），图中显示单次实验的n=2只独立动物，每只动物用不同颜色和符号表示。请点击此处查看该图的放大版本。

时间（天）器官 Log10 CFU
肺脾引流淋巴结脑
283.08, ND, ND, ND, ND2.81, ND, ND, ND, NDND, ND, ND, ND, ND0.78, 0.90, ND, ND, ND
562.30, ND, ND, ND, ND1.53, 3.43, ND, ND, ND2.78, ND, ND, ND, ND1.20, ND, ND, ND, ND
90ND, ND, ND, ND, ND0.60, 3.35, 3.26, ND, NDND, ND, ND, ND, ND0.60, ND, ND, ND, ND
132ND, ND, ND, ND, ND4.03, 3.58, 3.58, 4.03, 3.692.41, ND, ND, ND, NDND, ND, ND, ND, ND
DLN = 引流淋巴结, ND = 未检出

表1：耳部接种后随时间推移M. avium在体内的播散情况。 在每次时间点，每组取5只小鼠，采集其肺、脾、引流淋巴结（DLN）和脑组织。将组织匀浆后进行平板培养，并评估细菌生长情况。器官中的菌落形成单位（CFU）以log10转换值表示；当所有接种浓度下均未观察到CFU时，记为未检出（ND）。该时间进程数据代表一次实验的结果。

讨论

本文展示了如何在受控的耳部皮内模型中可重复地对小鼠进行分枝杆菌攻击。在进行该操作时，必须遵守无菌操作规范，并避免针刺伤。采用这种接种方法时，关键是要有合适的操作台和良好的照明条件，以确保针头准确进入真皮层间隙，而不会完全穿透耳部组织。如果发生穿透，可根据研究需要，在另一只耳朵进行第二次尝试。同一小鼠未处理的耳朵也可作为个体内部对照。该方法对设备和时间需求较低，易于研究人员掌握。专门安排小鼠和时间进行训练，有助于提高接种的成功率。该技术最常见的错误包括未将针头正确置入皮内间隙（而是穿透耳部）或推注过快，导致接种剂量不一致或针头从皮内滑脱。良好的照明和放大设备有助于准确放置针头完成接种。

我们正在利用一种模拟“暴露样”条件的方法来研究非结核分枝杆菌（NTM）。在感染后132天内，绝大多数M. avium被限制在耳部或引流淋巴结（DLN）中。然而，该方法的一个局限性在于，在所有被评估的动物中均观察到细菌向全身器官（尤其是脾脏）的播散。可能存在一个细菌接种量的阈值，低于该阈值时可减少播散的程度或频率，这可通过滴定实验加以确定。该实验方案可根据研究问题灵活调整所用菌种（例如其他NTM物种）以及接种剂量。

人类行为（如未采取适当的饮用水处理、环境污染、吸烟）、因年龄15增长及其他合并症导致健康状况恶化的人群数量增加、缺乏适当的诊断检测手段以及气候变化16等因素，可能在非结核分枝杆菌（NTM）感染率上升中发挥作用，且这一趋势在未来可能继续加剧。我们提出，通过饮水进行黏膜暴露11或在小鼠中建立局限性耳部感染的模型，可为研究日益增加的暴露水平对后续疫苗接种及疫苗效力的影响提供机会。尽管我们已将这种局限性耳部模型的方法学应用于M. avium，但我们认为该方法也可作为暴露技术，成功用于其他NTM菌种。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者们感谢动物实验中心工作人员在本研究期间对实验动物的悉心照料。作者们还感谢科罗拉多州立大学的Henao-Tamayo实验室分享了本研究所用的M. avium菌株。作者们还要感谢西雅图儿童研究所Aderem实验室和Urdahl实验室成员在原始实验方法方面的培训。本项目全部或部分由美国卫生与公共服务部下属的美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）、美国国立卫生研究院（NIH）通过合同编号75N93021C00029（授予RNC）以及基金编号R01AI125160和R01AI183642（授予RNC和SLB）提供资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 吐温80SigmaP6224
1 mL 注射器Fisher15-823-434
7H10 琼脂三联平板Moltox21-40S234
26G 钝头针头FisherNC0981254
生物安全柜NuaireNU-543-400
CO2 培养箱Fisher Scientific15-103-0513
双面胶带Scotch3136
Hamilton 701N 微量注射器Fisher14-824-16
硬组织用 Omni 尖端Fisher15-340-102
加热垫Kent ScientificHTP-1500
胰岛素针头FisherNC1551333
氯胺酮Patterson Veterinary07-890-8598
带光源放大镜BrightechB07MMZ27QK
PBSThermoFisher10010072
组织匀浆器OmniTH115
组织匀浆器支架OmniS1000
赛拉嗪Patterson Veterinary07-808-1947

参考文献

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