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方法文章

培养滤液蛋白（CFPs）的分离与分级 结核分枝杆菌

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DOI：

10.3791/67679

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2025年7月11日

 ,  ,  , 
1Department of Immunology, National Institute for Research in Tuberculosis, 2Faculty of Medical Research, Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

本文内容

摘要

本方案描述了分泌蛋白的培养、收集与浓缩方法 结核分枝杆菌培养滤液蛋白（CFPs）经定量后，通过等电聚焦分离为20个组分，再利用制备型SDS-PAGE和电洗脱系统进一步分离为30个组分。

摘要

结核分枝杆菌（M. tuberculosis）分泌的蛋白质在结核病的致病机制、免疫调节及疾病进展中发挥着关键作用。了解这些蛋白质的组成与功能，对于发现可用于结核病诊断、疫苗研发和治疗干预的新生物标志物至关重要。本研究聚焦于培养滤液蛋白（CFPs）的系统性分离、分级和表征，以实现全面的免疫学和蛋白质组学分析。CFPs来源于在化学成分明确条件下培养的M. tuberculosis H37Rv菌株，以确保蛋白质表达的可控性。通过过滤纯化培养上清液，并利用中空纤维系统进行浓缩，保留分子量大于10 kDa的蛋白质。采用液相等电聚焦技术进行分级，根据蛋白质的等电点将其分离为20个不同的组分。进一步通过制备型十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并结合电洗脱技术，获得30个蛋白质组分。通过该方法获得的分级蛋白质为免疫学图谱分析和基于质谱的蛋白质组学分析提供了宝贵的资源。通过对分泌蛋白进行系统性分离与表征，本研究有助于识别结核病特异性蛋白质生物标志物，从而提高诊断准确性，并深化对M. tuberculosis致病机制的理解。

引言

大量研究强调了分泌蛋白在生长及免疫相互作用中的重要作用 结核分枝杆菌1. 上清液 M. tuberculosis 包含多种复杂的蛋白质和非蛋白质成分，是研究其生物学特性和免疫原性的重要资源。早期的蛋白质组学研究在培养滤液中鉴定出近450种蛋白质2，其中许多在引发针对结核病的免疫反应中发挥关键作用。鉴定这些具有免疫学意义的抗原对于开发创新的结核病诊断方法和疫苗至关重要。然而，由于结核病免疫反应的复杂性，该领域的研究进展面临挑战 M. tuberculosis 感染以及用于分离分枝杆菌蛋白的生化纯化方法的技术局限性。

已采用多种分离技术来解析结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的蛋白质，这有助于检测含量较少但功能重要的蛋白质，并拓展了蛋白质组学研究的范围。理想的分离方法可将复杂的蛋白质混合物有效分离为数量有限的 distinct 组分。目前用于分离分枝杆菌蛋白质的两种广泛应用的方法是基于色谱和基于电泳的技术1,2。

色谱技术，包括亲和层析、离子交换层析和反相层析，十余年来一直是蛋白质分级分离的核心方法。这些方法已被广泛用于分离结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的蛋白质3。然而，由于蛋白得率低以及非蛋白质组分的干扰等因素，可能影响后续的免疫学分析。这些局限性制约了色谱技术在鉴定具有免疫学意义的抗原中的应用。

为解决这些局限性，采用了一种基于二维电泳的分离方法。在第一维中，使用制备型等电聚焦（IEF）系统，根据蛋白质的等电点通过等电聚焦对其进行分离。在第二维中，利用制备型SDS-PAGE按分子量进一步分离蛋白质，随后使用全胶洗脱仪进行洗脱。

这种二维方法具有多项优势。它通过将培养滤液蛋白（CFP）分离成600个不同的组分，显著降低了其复杂性。此外，由于洗脱过程不会引入干扰细胞免疫学检测的成分，这些组分可直接用于免疫学分析4,5,6。

本方案详细介绍了用于免疫学分析的培养滤液蛋白的制备与分离方法6。

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方案

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 生长 结核分枝杆菌 以及培养滤液蛋白（CFPs）的制备

  1. Sauton液体培养基的制备
    1. 将以下组分加入 950 mL 蒸馏水中：甘油 30.0 mL；磷酸二氢钾（KH₂PO₄），1.7 g；L-酪氨酸，0.2 g；七水合硫酸镁（MgSO₄·7H₂O），0.5 g；一水合硫酸锰（MnSO₄·H₂O），0.01 g；氯化钠，0.1 g；氯化钙，0.02 g；以及溴百里酚蓝，0.03 g。2PO40.5 克；硫酸镁，0.5 克；柠檬酸，2.0 克；酪蛋白水解物，0.5 克；硫酸铁铵，0.05 克；谷氨酸钠，4.0 克。
    2. 使用40%氢氧化钾调节pH至7.2（约5 mL/L）。
    3. 加水定容至1 L，15 psi条件下高压灭菌20 min。
  2. 分枝杆菌悬液的制备
    1. 转移菌落 结核分枝杆菌 在罗氏斜面（Lowenstein-Jensen斜面，ATCC 27294）上培养的H37Rv接种至2 mL Sauton液体培养基中。
    2. 在无菌条件下，通过剧烈振荡玻璃珠来打散分枝杆菌菌团。
  3. 启动分枝杆菌生长
    1. 将细菌悬液转移至含有10 mL Sauton液体培养基的McCartney瓶中。
    2. 在37 °C下孵育该瓶2周。
  4. 扩大培养规模
    1. 将培养好的菌液转移至1 L瓶中的200 mL Sauton培养基中。
    2. 在37 °C摇床中孵育4周。
    3. 将对数期培养物转移至含有2 L Sauton培养基的4 L锥形瓶中。
    4. 在37 °C下静置培养额外4周，直至形成表面菌膜。
  5. 收集培养滤液蛋白（CFPs）
    1. 通过离心收集培养物，离心条件为 1,000–1,500 x g 室温下孵育30分钟。
    2. 通过0.45 µm真空过滤系统过滤上清液。
    3. 使用截留分子量为10 kDa的切向流过滤系统浓缩含有CFP的滤液。
  6. 储存收获的 CFP
    1. 使用市售的BCA法蛋白检测试剂盒测定蛋白含量。
    2. 分装蛋白质，加入叠氮化钠至终浓度为0.2%，于-80 °C保存。

2. 制备型液相等电聚焦（IEF）

  1. 蛋白样品的制备
    1. 将结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）CFP溶于60 mL等电聚焦分离缓冲液中，缓冲液含8 M尿素、1 mM二硫苏糖醇（DTT）、5%甘油、2%皂苷、2%两性电解质（pH 3.0–10.0与pH 4.0–6.0按1:4比例混合）。
  2. 设置等电聚焦系统
    1. 向阳极室加入0.1 M磷酸，向阴极室加入0.1 M氢氧化钠。
    2. 按照制造商说明组装制备型等电聚焦电泳槽（参见材料表）。
  3. 进行等电聚焦
    1. 将最多350 mg蛋白上样至等电聚焦系统。
    2. 在4 °C条件下，使用循环冷却水系统对蛋白进行聚焦。
    3. 以恒定功率12 W电泳，直至电压稳定在约1400 V，随后继续运行30分钟。
  4. 收集并分析组分
    1. 收集等电聚焦各组分，并测定其pH值。
    2. 通过SDS-PAGE分析每份等分试样，并采用银染法显色蛋白。

3. 制备型SDS-PAGE及整胶洗脱

  1. SDS-PAGE 样品制备
    1. 将 IEF 组分与市售的 6x SDS-PAGE 上样缓冲液混合。
    2. 在 95 °C 下加热混合物 5 分钟。
  2. 制备型 SDS-PAGE 电泳
    1. 将最多 10 mg 蛋白质上样至一块 16 cm × 20 cm 的聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶包含 4% 的浓缩胶和 12.5% 的分离胶。
    2. 以 50 mA 的恒定电流进行电泳，直至染料前沿距凝胶底部 2 cm。
  3. 从凝胶中洗脱蛋白质
    1. 用洗脱缓冲液（60 mM Tris，40 mM CAPS，pH 9.4）平衡凝胶 10 分钟。
    2. 将凝胶转移至全凝胶洗脱仪中。
    3. 以 250 mA 的恒定电流洗脱蛋白质，持续 1 小时。
  4. 收集并分析各组分
    1. 将分离的蛋白质 洗脱至 30 个独立的组分中，每个组分体积 为 2.5 mL。
    2. 按照生产商说明书，使用 BCA 蛋白定量法测定蛋白浓度。
    3. 对每个组分中的 10 µg 蛋白质进行 SDS-PAGE 分析，并通过银染显色。

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结果

图1 展示了所制备的培养滤液蛋白（CFP）的复杂性。首先，将100 µg的CFP进行二维SDS-PAGE分析以评估其复杂程度。该分析显示CFP中存在近100个不同的蛋白质斑点（图1）。

每次运行收集的20个组分均通过SDS-PAGE进行分析。其中，三次不同运行的三个代表性组分如图2所示。

图3 显示了分离组分的pH分布，其范围从2.54到12.9。大多数组分（第5至第14组分）的pH值介于4到6之间，这是分枝杆菌蛋白主要集中所在的pH范围。各组分间pH值呈现逐渐升高的趋势（图3）。

首先使用SDS-PAGE对各组分进行分析。图4

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讨论

Mycobacterium tuberculosis 的培养滤液蛋白（CFP）是多种不同蛋白质组分的复杂混合物，其浓度各不相同。蛋白质组学研究已在CFP中鉴定出多达1,314种蛋白质4,5。大量研究表明，CFP在调节免疫反应中发挥关键作用。具体而言，CFP在T细胞介导的细胞免疫应答4,5,6,7以及B细胞介导的抗体应答8,9,10,11中均具有不可或缺的作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ÄKTA flux 切向流过滤系统 CYTIVA29038437
两性电解质（pH 3.0 至 10.0）BIO-RAD1632094
两性电解质（pH 4.0 至 6.0）BIO-RAD1631143
BCA 蛋白检测试剂盒 MERCK71285-M
CAPSMERCKC2632
酪蛋白水解物MERCK65072-00-6
柠檬酸MERCKC0759
皂苷MERCK300410
DTTMERCKD9779
硫酸铁铵HIMEDIAGRM10944
甘油MERCKG5516
甘油 MERCK252859
罗氏斜面培养基（Lowenstein-Jensen 斜面） HIMEDIASL001
硫酸镁MERCKM7506
Millipore Stericup 快速释放真空过滤系统MERCKS2HVU11RE
磷酸 MERCK695017
磷酸二氢钾MERCKP0662
氢氧化钾 MERCK484016
制备型等电聚焦电泳装置（Rotofor） BIO-RAD170-2986 
叠氮化钠 MERCKS2002
谷氨酸钠MERCK49621
氢氧化钠HIMEDIAMB095
TrisMERCK252859
尿素MERCKU5128
全胶洗脱装置（Whole Gel Eluter） BIO-RAD1651250

参考文献

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  15. Rodríguez-Hernández, E., et al. Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis. J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).
  16. Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis. Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).

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