本方案描述了分泌蛋白的培养、收集与浓缩方法 结核分枝杆菌培养滤液蛋白（CFPs）经定量后，通过等电聚焦分离为20个组分，再利用制备型SDS-PAGE和电洗脱系统进一步分离为30个组分。
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摘要
摘要
结核分枝杆菌（M. tuberculosis）分泌的蛋白质在结核病的致病机制、免疫调节及疾病进展中发挥着关键作用。了解这些蛋白质的组成与功能，对于发现可用于结核病诊断、疫苗研发和治疗干预的新生物标志物至关重要。本研究聚焦于培养滤液蛋白（CFPs）的系统性分离、分级和表征，以实现全面的免疫学和蛋白质组学分析。CFPs来源于在化学成分明确条件下培养的M. tuberculosis H37Rv菌株，以确保蛋白质表达的可控性。通过过滤纯化培养上清液，并利用中空纤维系统进行浓缩，保留分子量大于10 kDa的蛋白质。采用液相等电聚焦技术进行分级，根据蛋白质的等电点将其分离为20个不同的组分。进一步通过制备型十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并结合电洗脱技术，获得30个蛋白质组分。通过该方法获得的分级蛋白质为免疫学图谱分析和基于质谱的蛋白质组学分析提供了宝贵的资源。通过对分泌蛋白进行系统性分离与表征，本研究有助于识别结核病特异性蛋白质生物标志物，从而提高诊断准确性，并深化对M. tuberculosis致病机制的理解。
引言
大量研究强调了分泌蛋白在生长及免疫相互作用中的重要作用 结核分枝杆菌1. 上清液 M. tuberculosis 包含多种复杂的蛋白质和非蛋白质成分，是研究其生物学特性和免疫原性的重要资源。早期的蛋白质组学研究在培养滤液中鉴定出近450种蛋白质2，其中许多在引发针对结核病的免疫反应中发挥关键作用。鉴定这些具有免疫学意义的抗原对于开发创新的结核病诊断方法和疫苗至关重要。然而，由于结核病免疫反应的复杂性，该领域的研究进展面临挑战 M. tuberculosis 感染以及用于分离分枝杆菌蛋白的生化纯化方法的技术局限性。
已采用多种分离技术来解析结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的蛋白质，这有助于检测含量较少但功能重要的蛋白质，并拓展了蛋白质组学研究的范围。理想的分离方法可将复杂的蛋白质混合物有效分离为数量有限的 distinct 组分。目前用于分离分枝杆菌蛋白质的两种广泛应用的方法是基于色谱和基于电泳的技术1,2。
色谱技术，包括亲和层析、离子交换层析和反相层析，十余年来一直是蛋白质分级分离的核心方法。这些方法已被广泛用于分离结核分枝....
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方案
本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 生长 结核分枝杆菌 以及培养滤液蛋白（CFPs）的制备
- Sauton液体培养基的制备
- 将以下组分加入 950 mL 蒸馏水中：甘油 30.0 mL；磷酸二氢钾（KH₂PO₄），1.7 g；L-酪氨酸，0.2 g；七水合硫酸镁（MgSO₄·7H₂O），0.5 g；一水合硫酸锰（MnSO₄·H₂O），0.01 g；氯化钠，0.1 g；氯化钙，0.02 g；以及溴百里酚蓝，0.03 g。2PO40.5 克；硫酸镁，0.5 克；柠檬酸，2.0 克；酪蛋白水解物，0.5 克；硫酸铁铵，0.05 克；谷氨酸钠，4.0 克。
- 使用40%氢氧化钾调节pH至7.2（约5 mL/L）。
- 加水定容至1 L，15 psi条件下高压灭菌20 min。
- 分枝杆菌悬液的制备
- 转移菌落 结核分枝杆菌 在罗氏斜面（Lowenstein-Jensen斜面，ATCC 27294）上培养的H37Rv接种至2 mL Sauton液体培养基中。
- 在无菌条件下，通过剧烈振荡玻璃珠来打散分枝杆菌菌团。
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结果
图1 展示了所制备的培养滤液蛋白（CFP）的复杂性。首先，将100 µg的CFP进行二维SDS-PAGE分析以评估其复杂程度。该分析显示CFP中存在近100个不同的蛋白质斑点（图1）。
每次运行收集的20个组分均通过SDS-PAGE进行分析。其中，三次不同运行的三个代表性组分如图2所示。
图3 显示了分离组分的pH分布，其范围从2.54到12.9。大多数组分（第5至第14组分）的pH值介于4到6之间，这是分枝杆菌蛋白主要集中所在的pH范围。各组分间pH值呈现逐渐升高的趋势（图3）。
首先使用SDS-PAGE对各组分进行分析。图4
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讨论
Mycobacterium tuberculosis 的培养滤液蛋白（CFP）是多种不同蛋白质组分的复杂混合物，其浓度各不相同。蛋白质组学研究已在CFP中鉴定出多达1,314种蛋白质4,5。大量研究表明，CFP在调节免疫反应中发挥关键作用。具体而言，CFP在T细胞介导的细胞免疫应答4,5,6,7以及B细胞介导的抗体应答8,9,10,11中均具有不可或缺的作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ÄKTA flux 切向流过滤系统 | CYTIVA | 29038437 | |
| 两性电解质（pH 3.0 至 10.0） | BIO-RAD | 1632094 | |
| 两性电解质（pH 4.0 至 6.0） | BIO-RAD | 1631143 | |
| BCA 蛋白检测试剂盒 | MERCK | 71285-M | |
| CAPS | MERCK | C2632 | |
| 酪蛋白水解物 | MERCK | 65072-00-6 | |
| 柠檬酸 | MERCK | C0759 | |
| 皂苷 | MERCK | 300410 | |
| DTT | MERCK | D9779 | |
| 硫酸铁铵 | HIMEDIA | GRM10944 | |
| 甘油 | MERCK | G5516 | |
| 甘油 | MERCK | 252859 | |
| 罗氏斜面培养基（Lowenstein-Jensen 斜面） | HIMEDIA | SL001 | |
| 硫酸镁 | MERCK | M7506 | |
| Millipore Stericup 快速释放真空过滤系统 | MERCK | S2HVU11RE | |
| 磷酸 | MERCK | 695017 | |
| 磷酸二氢钾 | MERCK | P0662 | |
| 氢氧化钾 | MERCK | 484016 | |
| 制备型等电聚焦电泳装置（Rotofor） | BIO-RAD | 170-2986 | |
| 叠氮化钠 | MERCK | S2002 | |
| 谷氨酸钠 | MERCK | 49621 | |
| 氢氧化钠 | HIMEDIA | MB095 | |
| Tris | MERCK | 252859 | |
| 尿素 | MERCK | U5128 | |
| 全胶洗脱装置（Whole Gel Eluter） | BIO-RAD | 1651250 |
参考文献
- Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach. Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).
- de Souza, G. A., et al.
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